Expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa por células mononucleares de sangre periférica humana

Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias Expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa por células mononucleares de sangre periférica humana Gladys Wendy Valente Niño Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero Verano UAGro glaadys_valenten@hotmail.com Area II: Biología y Química Dra. Gloria Fernández Tilapa Profesora-Investigadora de la Universidad Autónoma de Guerrero gerti@hotmail.com Resumen Introducción. TNF-α es producido por monocitos, fibroblastos, células epiteliales, macrófagos, linfocitos T y B, granulocitos, células Natural Killer (NK), células musculares lisas y queratinocitos. Esta citocina es una mediadora de la inflamación local, vital para mantener localizadas las infecciones. Esto lleva al reclutamiento de las células inflamatorias, inmunoglobulinas y complemento, provocando la activación de los linfocitos T y B. También aumenta la activación y adhesión plaquetaria y, es probable que la oclusión vascular sea la causa de la necrosis tumoral, de donde proviene el nombre En una infección por Helicobacter pylori la expresión de TNF-α conlleva a una amplificación de la respuesta inmune contra la bacteria, promoviendo una inflamación crónica en el sitio de la infección ocasionando gastritis crónica, ulcera péptica o cáncer gástrico. El objetivo del estudio es determinar si la expresión del RNAm de TNF-α se ve afectada por el tiempo de incubación de células mononucleares de sangre periférica humana. Metodología. Se obtuvo RNA a partir de células mononucleares (1x10 6 ) aisladas de sujetos sin infección por H. pylori, sin síntomas de enfermedad gástrica y aparentemente sanos, las células fueron cultivadas a diferentes tiempos (24 y 30 h). Se empleó la técnica de RT-PCR para determinar la expresión del RNAm de TNF-α Se verificó la integridad de los cdnas mediante la amplificación de un fragmento del RNAm de β-actina. Resultados. Se obtuvo amplificación del fragmento del RNAm de TNF-α, así mismo, se confirmó la integridad

4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 del cdna mediante el fragmento de β-actina. Conclusión. La expresión del RNAm de TNF-α no se relaciona con el tiempo de incubación en un mismo número células mononucleares aisladas de sangre periférica. Palabras Clave: TNF-α, Células mononucleares, H. pylori e Inflamación. Introducción La inmunidad innata es la primera línea de defensa del huésped frente a patógenos y está mediada por los fagocitos neutrófilos, monocitos, macrófagos y las células dendríticas que, a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), interactúan con productos bacterianos como lipopolisacáridos, peptidoglicanos, ácido lipoteicoico, lipoproteínas, DNA, glicolípidos, fragmentos de pared celular y lipoarabinomanano. Este conjunto de recibe el nombre de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). La interacción entre PRRs- PAMPs conlleva a la activación de cascadas de señalización que inducen la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas que amplifican la respuesta para erradicar al patógeno (Mesa-Villanueva M.. et al., 2006) Entre las citocinas proinflamatorias se encuentra el Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α), producido por monocitos, fibroblastos, células epiteliales, macrófagos, linfocitos T y B, granulocitos, células Natural Killer (NK), células musculares lisas y queratinocitos. TNF-α se encuentra en dos formas, una de membrana (precursora) y otra soluble (stnf- α) (Filella X, et al., 2002). La forma unida a membrana es escindida por la enzima convertidora del TNF-α (TACE) y da origen a la forma soluble de esta citocina; se ha demostrado que ambas formas están relacionadas con la función inmune que ejerce esta citocina (Chapnick, D., et al., 2015). Para ejercer su función, TNF-α puede unirse a uno de sus dos receptores triméricos de membrana, los receptores 1 y 2 de TNF-α (TNFR1 y TNFR2). TNFR1 se expresa en células nucleadas y TNFR2 en células del sistema inmune, endoteliales y nerviosas. La unión de TNF-α a TNFR1 desencadena una señalización intracelular que termina con la activación del Factor Nuclear Kappa B (NF-κB) que se transloca al núcleo y activa la expresión de genes que codifican proteínas relacionadas con la respuesta inmune innata, adaptativa, inflamación y autoinmunidad (Bonizzi G., et al., 2004) TNF-α es un mediador de la inflamación local, vital para mantener localizadas las infecciones. Esto lleva al reclutamiento de las células inflamatorias, inmunoglobulinas y complemento, provocando la activación de los linfocitos T y B. También aumenta la activación y adhesión plaquetaria y, es probable que la oclusión vascular sea la causa de la necrosis tumoral, de donde proviene el nombre. (Idriss H., et al., 2000). Uno de los factores del incremento de TNF-α principalmente en mucosa gástrica es la infección por Helicobacter pylori (H. pylori), estudios realizados en poblaciones de linfocitos T de la mucosa gástrica infectada por H. pylori han demostrado la existencia de un aumento en la secreción de citocinas que derivan de los linfocitos TCD4, subtipo Th1 entre las que se encuentra TNF-α, un aumento en la expresión de esta citocina amplifica la respuesta inmune contra la

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) bacteria, ayuda a que los leucocitos se adhieran a las células endoteliales de los capilares, así como también al reclutamiento de leucocitos en el lugar de la infección. Por lo tanto el objetivo del trabajo es determinar si la expresión del RNAm de TNF-α se ve afectada por el tiempo de incubación de células mononucleares de sangre periférica humana. Materiales y Métodos Criterios de selección de los donadores Mediante encuesta y prueba de antígenos de H. pylori en heces, se seleccionaron donadores sin infección por H. pylori, en un rango de edad de 20 a 30 años, sin síntomas de enfermedad gástrica y aparentemente sanos. Aislamiento y cultivo de células mononucleares de sangre periférica Se obtuvieron 12 ml de sangre venosa en condiciones de ayuno por 8 a 12 h. Las células mononucleares de sangre periférica se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad con Histopaque (1077-Sigma Aldrich, Missouri, USA). Las células mononucleares obtenidas se tiñeron con azul de tripano y se cuantificaron en cámara de Neubauer, se cultivaron en placa de 24 pocillos para cultivos 1x10 6 células adicionando medio RPMI-1640 (R6504- Sigma Aldrich, Missouri, USA) enriquecido con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Gibco, Massachusetts, USA) y se incubaron en atmósfera (ATM) húmeda, con 5% de CO2 a 37 C durante a 24 h y 30 h. Extracción de ARN La extracción de RNA se realizó a partir de células mononucleares a las 24 y 30 h de incubación, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Massachusetts, USA), el cual es una solución monofásica de fenol, isotiocianato de guanidina y otros componentes que mantienen la integridad del RNA debido a la alta inhibición de la actividad de RNAsas. El reactivo lisa las células y disuelve los componentes celulares durante la homogenización de la muestra. La obtención del RNA se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante. El RNA total se resuspendió en 18 (µl) de H 2 O estéril tratada con DEPC y se mantuvo a -70 C hasta su transcripción. Síntesis de DNA complementario. Para la síntesis de DNA complementario (cdna) se utilizaron 2.5 µg de RNA total. La retrotranscripción (RT) se hizo con 0.25 µg de Oligo dt12-18 (Invitrogen, Brazil), 100 U MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Transcriptase), 0.5 mm de dntp s, buffer RT, 0.01 mm de DTT, 2.58 U de inhibidor de RNAasas (Amersham Biosciences, USA), en un volumen final de 25 µl. La reacción se incubó a 70º C por 10 minutos para el alineamiento y la extensión se hizo a 37º C por 1 h con 50 min. La enzima MMLV-RT se inactivó a 90º C por

4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 10 min. El cdna se almacenó a -20º C hasta su procesamiento. Se utilizó una reacción sin RNA como control negativo. Análisis de la expresión del RNAm de TNF-α. Las muestras de cdna se sometieron a PCR para el gen constitutivo β-actina, con los oligonucleótidos: sentido 5 -GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 y antisentido 5 - CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 ; la mezcla de PCR consistió de buffer 1X, dntp s 0.83 mm, MgCl 2 2 mm, iniciadores sentido y antisentido, 7 pmol/µl, Taq DNA polimerasa recombinante 1 U/µL (Bio SB, CA, USA) y cdna 2 µl. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 15 µl. El programa de amplificación fue: 94 C por 5 min, seguida de 30 ciclos a 94 C por 30 s, 57 C por 30 s, 72 C por 30 s y un ciclo de extensión final a 72 C por 5 min, obteniéndose un producto de 540 pb. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, se tiñeron con bromuro de etidio y se observaron en el fotodocumentador Gel Documentation Systems (Gel Doc 2000TM, BIO-RAD, Italia). Las muestras positivas al RNAm de β-actina se sometieron a PCR para valorar la expresión del RNAm de TNF-α, con los oligonucleótidos: sentido 5 - GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA-3 y antisentido 5 - GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGACT-3 ; en cada PCR se utilizaron 2.5 µl de buffer, 0.2 mm de dntp s, 1.5 mm de MgCl 2, 12 pmoles de oligonucleótido sentido, 10 pmoles de oligonucleótido antisentido, 1 U de Taq DNA polimerasa recombinante (Bio SB, CA, USA) y 2 µl de cdna; la reacción se llevó acabo en un volumen total de 25 µl. La amplificación consistió de un ciclo a 95 C por 5 min y 32 ciclos de 95 C por 50 s, 60 C por 50 s y 72 C por 90 s; con un ciclo de extensión final a 72 C por 5 min, obteniéndose un producto de 444 pb. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, se tiñeron con bromuro de etidio y se observaron en el fotodocumentador Gel Documentation Systems (Gel Doc 2000TM, BIO-RAD, Italia). En cada PCR se incluyó un tubo de reacción en que se sustituyó el cdna por agua desionizada estéril, como control negativo Resultados Integridad del RNA y verificación de la Transcripción reversa La integridad del RNA y la síntesis correcta del cdna se verificó en todas las muestras se verificó mediante PCR para comprobar expresión del gen constitutivo β-actina cuyo producto de PCR es de 540 pb. (Figura 1)

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 650pb 500pb 540pb Figura 1. Expresión del RNAm del gen β-actina. Carril 1: Marcador de peso molecular de 1kb, carril 2: control negativo, carril 3 muestra obtenida de cultivo de células mononucleares a las 24 h y carril 4 muestra obtenida de cultivo de células mononucleares a las 30 h, ambas positivas a la expresión del RNAm de β-actina. Expresión del RNAm de TNF-α en muestras positivas a β-actina. Las muestras positivas al gen de β-actina se sometieron a PCR para la detección del RNAm de TNF-α, obteniéndose un producto de 444 pb (Figura 2). MPM 1 Kb Control - A 0h 1x10 6 V 6h 1x10 6 MPM 1 Kb Control - A 0h 1x10 6 V 6h 1x10 6 500pb 400pb 444pb Figura 2. Expresión del RNAm del gen de TNF-α. Carril 1: Marcador de peso molecular de 1kb, carril 2: control negativo, carril 4 muestra obtenida de cultivo de células mononucleares a las 24 h y carril 5 muestra obtenida de cultivo de células mononucleares a las 30 h, ambas positivas a la expresión del RNAm de TNF-α. Discusión y conclusiones El RNAm de diversas citocinas puede producirse en respuesta a procesos inflamatorios ocasionados por estímulos traumáticos, químicos, físicos e infecciosos, que son capaces de inducir la síntesis de TNF- α, con la finalidad de modular la respuesta inmune en el sitio de la infección o de la lesión. Esta citocina actúa como proinflamatoria. Uno de los principales factores para el aumento de

4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016 esta citocina es la infección por H. pylori que al interactuar con los TLR activan vías de señalización que resultan en la transcripción de diversas citocinas, la producción de RNAm de TNF-α es constante si el estímulo está presente. Sin embargo en este estudio se pretende demostrar que en una concentración de 1x10 6 células aisladas de sangre periférica cultivadas a diferentes tiempos (24 y 30 h.) la expresión del RNAm de TNF- α no se ve afectada, lo cual se aprecia en la Figura 2, esto puede deberse a que la producción de RNAm es constante y no disminuye con el tiempo de incubación, así mismo se demostró la integridad del cdna utilizado mediante el gen constitutivo β-actina, observándose un producto de amplificación de 540 pb. Es de suma importancia incorporar al estudio un número mayor de muestras así como también realizar una semicuantificación de los productos de amplificación obtenidos. Agradecimientos Agradezco al Dr. Javier Saldaña Almazán por promover la investigación entre la comunidad estudiantil de esta máxima casa de estudios. Así mismo, quiero agradecer a la Dra Gloria Fernández Tilapa por su apoyo para realizar este verano de investigación en el Laboratorio de Investigación Clínica en la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Guerrero y a mis compañeros de Laboratorio por apoyarme en cada obstáculo que se me presentó. Referencias Carrillo-Esper R., (2003). Inmunidad innata, receptores Toll y sepsis. Cirugía y cirujanos. 71, 252-258. Filella X., Molina R., AM. Ballesta. (2002). Estructura y función de las citocinas. Medicina Integral. 39, 63-71. Bonizzi G., Karin M., (2004). The two NF-kB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends in Immunology. 25, 280-288 Mesa-Villanueva M., Patiño P. (2006). Receptores tipo Toll: entre el reconocimiento de lo no propio infeccioso y las señales endógenas de peligro. Inmunología. 25, 115-130. Chapnick, D., Bunker, E., Liu, X. (2015). A biosensor for the activity of the "sheddase" TACE (ADAM17) reveals novel and cell type-specific mechanisms of TACE activation. Science Signaling. 8, 365. Idriss H., Naismith J. (2000) TNF-a and the TNF Receptor Superfamily:Structure- Function Relationship(s). Microscopy research and technique. 50, 184 195.

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