DIAGNÓSTICO PRENATAL: DEL MICROSCOPIO A LAS PLATAFORMAS DE ALTO RENDIMIENTO María Orera U. de Genética HGU Gregorio Marañón CGCGenetics-CircaGen Oviedo 13 4 2011
cronograma 1966: STEELE: Estudio cromosómico en Líquido amniótico 1972: BROCK: AFP en los defectos de tubo neural 1982: MERKATZ: AFP en alteraciones cromosómicas 2000: QF-PCR /FISH 2003: Técnicas de alto rendimiento (MLPA) 2005: WALD: Screening combinado, detección 95 % 2008: Arrays CGH /Dirigidos
Alteraciones Cromosómicas Grandes Número Cromosomas Translocaciones Inversiones Deleciones e inserciones Estructurales CNV Repeticiones en Tandem Nucleotide Insertions and Deletions (Indels) Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Mutaciones Secuencia Pequeñas
ALTERACIONES CROMOSÓMICAS MAS FRECUENTES RECIÉN NACIDOS NO EQUILIBRADAS EQUILIBRADAS TRISOMÍAS + 21 0.12% Tr. Recíproca 0.25 + 18 0.015 Tr. Robertsoniana 0.1 + 13 0.008 Inv.pericéntrica 0.08 Triploidía 0.002 TRISOMÍAS GONOSOMAS TOTAL 0.83 47 XXY 0.12 47 XXY 0.12 45 X 0.03 47 XXX 0.11 Reareglo 0.03 Cr.Extranum 0.04
CARIOTIPO CARIOTIPO Gold Standard 46 cromosomas 550 bandas Resolución 10 Mb 100 genes Alteraciones numéricas y estructurales Prevalencia cromosomopatías 0.8%
RESULTS Type of Numerical Alteration Total % Num Alt n=733 % Abn Smp n=1.066 % Total Smp n=30.066 Trisomy 21 385 52,5% 36,1% 1,3% Sex chromosome aneuploidies 135 18,4% 12,7% 0,4% Trisomy 18 131 17,9% 12,3% 0,4% Trisomy 13 33 4,5% 3,1% 0,1% Triploid 26 3,5% 2,4% 0,1% Markers 21 2,9% 2,0% 0,1% Tetraploid 1 0,1% 0,1% 0,0% Other aneuploidies 1 0,1% 0,1% 0,0% Total 733 68,8% 2,4% Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010
RESULTS Type of Structural Alteration Total % Num Alt n=256 % Ab Smp n=1.066 % Total Smp n=30.066 Reciprocal balanced translocation 81 31,6% 7,6% 0,3% Inversion 62 24,2% 5,8% 0,2% Robertsonian balanced translocation 40 15,6% 3,8% 0,1% Robertsonian unbalanced translocation 20 7,8% 1,9% 0,1% Deletions 19 7,4% 1,8% 0,1% Other 19 7,4% 1,8% 0,1% Reciprocal unbalanced translocation 15 5,9% 1,4% 0,0% Total 256 24,0% 0,9% Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010
RESULTS Type of Mosaic Total % Num Alt % Ab Smp % Total Smp n=77 n=1.066 n=30.066 Autosomal mosaic 47 61,0% 4,4% 0,2% Sex chromosome mosaic 30 39,0% 2,8% 0,1% Total 77 7,2% 0,3% Total chromosomal anomalies: 3.6% amniocentesis Orera, M y cols. Global Congress maternal health 2010
FISH Marca CE, aprobado FDA Diagnóstico robusto y rápido Detecta mosaicismos de cualquier % Resultados válidos para ILE si hay anomalías ecográficas Sondas de síndromes mas frecuentes Poco automatizable Costoso
QF-PCR Rápido y barato Detecta mosaicismos >30% Aprobado para diagnóstico rápido No aprobado para ILE No automatizable
BACS on Beads (BoBs) Marca CE BACS inmovilizados en esferas de poliestireno 9 sondas 100 esferas No requiere confirmación con FISH DNA paciente marcado con biotina Amplificación enzimática Estreptavidina ficoeritrina Plataforma Luminex
BoBs
MLPA Detección de variaciones número de copias de hasta 45 regiones en un ensayo 20 ng ADN Discrimina variaciones de 1 nucleótido Identifica mutaciones puntuales conocidas Reproducible Una estandarización para muchas aplicaciones Económica Requiere poca inversión
MLPA PRENATAL Salsas específicas Microdeleciones Subteloméricas Retraso Mental Aneuploidías Aplicable en lisados celulares 3000 células 0.5ml L.A. Resultados 24 horas Frecuencia Combinada Microdelecciones Subteloméricas Aneuploidía 1:250
INCONVENIENTES Requiere comparación con control Obligado confirmar por FISH u otro MLPA Sensible a contaminantes No detecta alteraciones equilibradas ni mosaicismos No detecta mutaciones puntuales no conocidas CONTROL
ARRAYS
ARRAYS ARRAYSARRAYS Secuencias de ADN inmovilizadas en un soporte sólido BACS Oligonucleótidos Arrays CGH Variaciones en Nº de copias 44,105,240 K Arrays dirigidos Genotipado Patologías con heterogeneidad genética Craneosinostosis, Displasias esqueléticas, Metabolopatías A medida Enriquecidos en regiones diana
CNV Variaciones de secuencia > 1kb Indels <1Kb Fácilmente detectables por nuevas tecnologías Asociadas a enfermedad Autismo, esquizofrenia, retraso mental Identificación de nuevos síndromes
NEXT GENERATION SEQUENCING Secuenciación completa Detección cambios de secuencia Resolución 1 base No detecta Expansiones Cambios epigenéticos Metilación No distingue Mutación Polimorfismo Variante significado incierto En estudio DP no invasivo
ESTRATEGIAS OPCIONES Estudios dirigidos QF-PCR FISH MLPA Detección mutación específica Arrays genotipado Craneosinostosis Metabolopatías Displasias esqueléticas Utilización Antecedentes Alteraciones en la gestación Resultado cierto y definitivo Existe o no existe trisomía, deleción, mutación Estudios generales Whole genome 3.000.000.000 pb Cariotipo Array CGH Secuenciación completa Utilización Análisis habitual Distinta resolución Resultado incierto Alteraciones no detectadas en cariotipo Interpretación arrays y secuenciación
DP No invasivo Patrón fetal de metilación diferente Identificación en sangre materna mediante RT-PCR Disponible en 2-3 años MLPA Shotgun sequencing
COMPARACIÓN Tiempo Coste Detectadas No detectadas Cariotipo 15 días 150 Cromosomopatías Microdeleciones Mutaciones Alt.Metilación BoBs 2 días 250 Cromosomopatías Regiones no incluídas Alt metilación Frecuencia Poblacional 0.8/1000 1/300 MLPA 15 días 300 Cromosomopatías Mutaciones específicas Retraso >50% Regiones no incluídas Alt. Metilación 1/250 Array CGH 15 días 500 Autismo 10% Retraso 7-35% Secuenciación Whole genome Traslocaciones Inversiones Mutaciones >10 /persona > 6 meses 50.000 $ Mutaciones Alt. Metilación 24.000.000 / persona
Frecuencia enfermedades genéticas 100 multifactoriales 10 1 monogénicas cromosómicas 0,1
PREVALENCIA RETRASO MENTAL Retraso del desarrollo psicomotor (TGD) 1-3% menores de cinco años 20 % causa desconocida 75% causa genética Retraso mental 3% población Causas Prenatal 50% 65% causa genética Perinatal 10% Postnatal 10& Desconocido 30% Autismo Prevalencia 1/90 Causas genéticas 20-30%
Diagnóstico Prenatal 30 años después DP Convencional Cariotipo (QF PCR) DP Ampliado PANELES DE SÍNDROMES ASOCIADOS A RETRASO MENTAL BoBs MLPA CGH a medida
MANEJO ALTERACIONES ECOGRÁFICAS Marcadores de trisomía QF PCR FISH BoBs Cariotipo Alteración insepecífica Array a medida Hidrops Array Metabolopatías Array Noonan Alteraciones esqueléticas Array Displasias óseas Alteraciones Craneofaciales Array Craneosinostosis Alteraciones cardiacas FISH MLPA Array Metabolopatías
ALES Principios éticos del Diagnóstico prenatal Autonomía Justicia Aspectos legales Segundo supuesto de la ley de aborto Sentencias Tribunal Supremo Los médicos tienen la obligación de poner en conocimiento de la gestante toda la información conocida y constatada en orden de determinar las posibilidades efectivas sobre la evolución del embarazo Antonio Seijas, Agosto 2007
Autonomía materna Participación en el proceso Información Consentimiento Informado Control de la información Confidencialidad Futuro del feto Capacidad de tomar decisiones Interrupción gestación
COSTE / BENEFICIO Macro Coste global por paciente con retraso desarrollo:1.000.000 US$2003* Meso Amortización material inventariable Personal Micro Amniocentesis+Cariotipo+BoBs 500 * CDC 2004
Evolución 80 s >35 amniocentesis cariotipo 90 s IR 2º amniocentesis cariotipo FISH/QF PCR 00 s IR1º amniocentesis cariotipo B. corial FISH MLPA 10 s amniocentesis cariotipo B. corial BoB s Arrays 20 s DP no invasivo WGS