Transferencia de embriones y sus indicaciones en yeguas.

Transcripción

1 Transferencia de embriones y sus indicaciones en yeguas. Los caballos siempre han estado unidos al hombre desde la antigüedad. Primeramente fueron de ayuda a la hora de los trabajos, como animales de carga o medio de transporte. Sin embargo, a día de hoy, en los países desarrollados, está asociado a un uso lúdico. El sector equino mueve muchos millones de euros al año, y por ello, se están comenzando a utilizar técnicas de reproducción que ya llevan muchos años utilizándose en el ganado bovino, como es el caso de la transferencia de embriones. Está técnica, fue descrita por primera vez en 1972, aunque no fue comercializada hasta los años ochenta. No obstante, en España es una técnica minoritaria, algo que no ocurre en el resto de países europeos o estadounidenses. Como su propio nombre indica, esta técnica se basa en obtener embriones de una yegua donante e introducírselo a la yegua receptora. Esta actividad tiene ventajas que lo justifican, como son: Se pueden obtener potros de yeguas que están compitiendo, ya que una yegua que está en temporada de competición no puede permitirse una gestación, interrumpiendo su competición. Es una técnica de alto valor económico, ya que nos permite tener una yegua compitiendo (de alto valor económico) y, además tener una yegua gestante (corriente) con un potro de la yegua en competición. Obtenemos un mayor número de potros por año y yegua. Podemos obtener descendencia de una yegua a partir de los dos años de edad 1

2 Las yeguas con problemas de fertilidad pero gran valor, pueden tener descendencia con esta técnica. Al igual que las yeguas con problemas de salud no reproductivos, pero que si tuvieran una gestación, no la podrían llevar a término. Por último, evitaremos los riesgos de gestación y parto en yeguas de alto valor. 1. Elección de donantes y receptoras La yegua es poliéstrica estacional. La actividad reproductiva es primariamente regulada por el fotoperiodo, pero también por la nutrición y el clima. En la yegua donante, es necesario realizar un estudio reproductivo donde se valorará el estado del útero y la fase reproductiva en la que se encuentra, para saber si esa yegua puede ser usada en un programa de transferencia embrionaria. Si se identifican en el examen anormalidades que necesitan tratamiento deben de ser tratadas antes de utilizar a la yegua para transferencia embrionaria. La yegua será correctamente vacunada y desparasitada. A continuación en el recelo se monitorizara la conducta reproductiva. Mediante palpación rectal y ultrasonido se monitorizara la actividad folicular durante el ciclo estral. Durante el celo, la donante es examinada diariamente para evaluar el crecimiento folicular que permite saber el momento óptimo de la inseminación con semen fresco, refrigerad o congelado. Se induce la ovulación (gonadotrofinas coriónica humana o GnRH). El día de la ovulación es detectado y designado como Día 0. Una de las técnicas asociadas a la transferencia de embriones es la superovulación. Esta técnica nos permite elevar la eficiencia reproductiva y económica en los programas de transferencia embrionaria, puesto que se multiplica el número de ovulaciones y por tanto, habrá mayor número de óvulos de la yegua donadora. 2

3 Produciendo un número mayor de descendientes. Además, este proceso puede aumentar la tasa de fertilidad en los reproductores subfertiles y de yeguas subfértiles proporciona un número mayor de ovulaciones y, consecuentemente, una mayor expectativa para la fertilización. Los fármacos que se utilizan rutinariamente en otras especies, no son efectivas en la especie equina. Solo el extracto de hipófisis equina EHE y la aplicación de FSH de origen porcino son los únicos que lo pueden hacer. No obstantes, los últimos estudios nos muestran que la aunque aplicación de EHE induce a la múltiple ovulación, la administración del FSH de origen porcino aumenta la velocidad de crecimiento folicular, pero no estimula la superovulación como ocurre en la especie bovina. El factor más importante que afecta el éxito del programa es la selección y el manejo de la yegua receptora. Estás tienen que tener ciclos estrales normales, que hayan tenido dos o más celos normales y estar libres de anormalidades uterinas y ováricas y con un peso de 450 a 550 kg, al igual que las yeguas donantes. La edad óptima de las yeguas varía según la información, no obstante, la media es entre 3 y 10 años. Dependiendo del protocolo que se use, hay diferentes formas de la sincronización del celo, que más adelante se explica. Al igual que las yeguas donantes, al detectar que están en celo, se las examina diariamente por palpación rectal y ultrasonidos para monitorizar el crecimiento folicular y detectar la ovulación. Es preferible que al menos dos receptoras estén disponibles para cada yegua donante. Las yeguas receptoras deben ser alimentadas para mantener buen peso condición corporal. Se utilizan yeguas que han ovulado un día antes o de 0 a 3 días después de la yegua donante. También hay que tener en cuenta el tamaño de la yegua receptora, ya que como los experimentos de Walton y Hammond donde nos muestran que son indicativos en que el tamaño y la salud del útero determina el tamaño del potro a término. Con el objetivo de eliminar la necesidad de sincronizar yeguas donantes y receptoras, se han utilizado yeguas ovariectomizadas tratadas con progestágenos como receptoras sin embargo, el éxito obtenido varía y el método no ha sido ampliamente adoptado 3

4 2. Sincronización de celos. Para realizar una sincronización de celos entre las yeguas de una explotación podemos actuar de forma distintas en diferentes puntos de su ciclo reproductivo. Utilizaremos un método u otro dependiendo de que en fase se encuentren las yeguas que vamos a tratar. Para ello debemos llevar un control continuo de las yeguas y conocer que hormona está actuando en cada momento del ciclo reproductivo. Es necesario conocer el eje hipotálamo-hipofisis-ovario. Prostaglandinas: encargadas de romper el cuerpo lúteo. 4

5 Métodos de inducción de celo: La hormona más utilizada en el manejo del ciclo estral es la gonadotropina coriónica humana o HCG. Con esta hormona lo que pretendemos es acortar la fase lutea e inducir una regresión prematura del cuerpo luteo. La hcg es principalmente luteinizante y luteotropica y tiene poca actividad FSH. Se encuentra tanto en sangre como en orina de los primates. Una dosis única de esta hormona es suficiente para inducir la ovulación. Debe de ser empleada en el estro y su uso puede ser como única hormona o combinada con progestágenos, estrógenos y prostaglandinas. Esto es especialmente importante cuando se sincroniza para inseminación, usando semen congelado o enfriado, debido al alto grado de predictibilidad de ovulación después del tratamiento. Los resultados de este tratamiento indican que la ovulación ocurre dentro de las 48 horas siguientes en la mayoría de las yeguas. Los tiempos para la inyección de la hcg son entre 4 y 6 dias despues de la aplicación de prostaglandinas, de este modo, mitigamos el problema de variabilidad en la sincronización entre la ovulación y el estro. Uno de los problemas asociados a la utilización de la hcg es la falta de respuesta atribuida a la producción de anticuerpos, cuando son tratados con esta hormona más de una vez en una misma época reproductiva. Esta producción de anticuerpos puede ser la causa de que las yeguas se vuelvan refractarias al efecto de la hcg. Es necesario realizar un seguimiento ecográfico de estas yeguas, puesto que no podemos realizar la inducción a la ovulación si el folículo presente es menor de 35 mm. Podemos actuar utilizando prostaglandinas en el caso de que exista en la yegua un cuerpo lúteo. El cuerpo lúteo actúa en la yegua como productor de progesterona, y estos niveles mantenido en sangre de progesterona impiden la liberación de las gonadotropinas y por lo tanto impiden la foliculogenesis y la aparición de un nuevo ciclo y una nueva ovulación. Lo que pretendemos con el uso de las prostaglandinas es romper ese cuerpo lúteo y que se produzca una caída en la producción de 5

6 progesterona que estimulara la liberación de gonadotropinas y por lo tanto se empezara un nuevo ciclo. Las prostaglandinas naturales (5 mg. de Dinaprost) o las sintéticas (250 a 500 microg. de cloprostenol, 0,150 mg. de Tiaprost) son altamente efectivas para inducir a la actividad sexual a las yeguas acíclicas como consecuencia de la persistencia de un cuerpo lúteo. Otro método utilizado es la inoculación de progestágenos, se utiliza con el fin de alargar la fase lútea o producir una artificia, los progestágenos actúan inhibiendo la liberación de gonadotropinas por un mecanismo de feedback negativo y en el momento que retiramos la progesterona exógena se produce una caída de los niveles de progesterona a nivel sanguíneo que estimula la liberación de Gnrh y por lo tanto de gonadotropinas que provocaran el inicio de un nuevo ciclo. Podemos usar progesterona (P4) natural de cerdo inyectable (muy irritante) o los progestágenos orales (27,5 mg. de Allyltrembolona) diariamente durante unos 10 días. También se utilizan implantes de progestágenos que duran 15 días. Este tratamiento se puede combinar con el uso de prostaglandinas al final de tratamiento con progestágenos en el caso de que exista un cuerpo lúteo para asegurarnos de la regresión de este. Otro método que se puede utilizar es la variación de las horas de luz con luz artificial. Con esto pretendemos acortar el tiempo de la yegua en anestro para que ovule lo antes posible. La luz actúa sobre las yeguas como un estimulo para la reproducción así como la temperatura, el clima y la nutrición. Por eso lo anestros serán más cortos en temporadas con mas horas de luz donde la temperatura sea más alta y si la hembra esta correctamente alimentada y todas estas medidas de manejo nos sirven tanto para adelantar el celo como para alargar la temporada reproductiva de la yegua. Por lo tanto las medidas de manejo las combinamos siempre con el resto de métodos de inducción de celo. Otro método para sincronizar los celos puede ser la utilización de factor liberador de gonadotropinas o Gnrh. 6

7 El factor liberador de gonadotropinas (0,004 mg. de Buserelina) ha sido utilizado para estimular el ciclo estral, aunque los resultados son muy pobres si se los compara con los obtenidos por medio de la iluminación artificial. Por ello se utilizan en forma complementaria. Lo que sucede es que dosis elevadas no son fisiológicas y pueden ocasionar una supresión de la liberación de las gonadotropinas endógenas. Suelen ser más efectivas dosis menores a intervalos de 24 horas durante un periodo de 30 días. Ponemos de conclusión por lo tanto que disponemos de varios métodos para poder realizar una buena sincronización entre las yeguas, y que debemos conocer primero el estado en que se encuentran las yeguas a las que vamos a sincronizar porque no todos los métodos pueden ser utilizados en todos los momentos del ciclo. Importante recordar también que debemos combinar nuestros métodos de inducción de celo con unas correctas pautas de manejo de la yeguas. 3. Técnica: inseminación, recuperación de embriones y envasado para su transporte. Nos vamos a centra en la inseminación artificial y no en la monta natural puesto que generalmente cuando hacemos trasplante de embriones lo usamos entre un yegua y un semental de gran valía y generalmente no solemos tenemos a ambos animales en la explotación para realizar una monta natural y aunque así fuese hay veces que se prefiere hacer IA para prevenir que el semental sufra patadas o algún altercado con la yegua. Inseminación artificial: La IA es una técnica reproductiva que consiste en depositar esperma en el aparato reproductor de la hembra sin la intervención del macho. Ayuda a mejorar la fertilidad, reduce el riesgo de trasmisión de enfermedades, facilita los programas de selección y mejora genética y nos permite poder disponer de esperma de buena calidad en zonas alejadas de donde se localizan los donantes, con lo cual se reduce el riesgo de accidente en el transporte de animales. La inseminación artificial tiene diversas modalidades según que el esperma que utilicemos sea refrigerado o congelado. 7

8 En la realización de una inseminación artificial hay unos pasos que se deben seguir: 1. Determinación del momento de la inseminación: es necesario determinar en qué momento se encuentra la hembra y cuando se va a producir la ovulación. Si vamos a realizar la IA con semen refrigerado debemos coordinar el momento de la pedida de las pajuelas con el momento de la ovulación, en caso de usar semen congelado esto no es necesario puesto que lo descongelamos en el momento de ser usado. La exploración rectal mediante ecografía de sus ovarios y útero, repetida durante el tiempo del celo, es necesaria para determinar el momento más indicado de la IA, valorando el aspecto del folículo preovulatorio, midiendo su tamaño y forma, grosor de sus paredes y ecogenicidad del sedimento del líquido folicular. Podemos predecir la ovulación con un seguimiento ecográfico por la morfología del folículo. 2. Técnica: tradicionalmente se realiza la inseminación con catéteres largos a través de la vagina y cuello del útero y se deposita la dosis seminal en el útero. Pero actualmente existe una nueva corriente de inseminación que consiste en realizar una IA intrauterina profunda. Las ventajas de esta última es que requieren concentraciones muchos menores de espermatozoides por pajuela y que tiene un porcentaje de éxito reproductivo mayor a la forma tradicional. Esta técnica de inseminación intrauterina profunda se utiliza más cuando el semen que vamos a utilizar es semen congelado, puesto que este semen ya por el hecho de estar congelado ha reducido su capacidad fecundante. Esta técnica se puede realizar con endoscopio regando con el semen la papila tubarica o con catéteres largos depositan las dosis de forma intrauterina. La utilización de los endoscopios encarece el proceso. 8

9 Tras la inseminación se realiza un seguimiento ecográfico para confirmar la fecundación del ovocito. Recuperación de embriones: Los embriones equinos son selectivamente transportados a través del oviducto hacia el útero entre los día 5 a 6 postovulación, estando en estadios de desarrollo de mórula compacta a blastocito temprano después de entrar al lumen uterino, el tamaño del embrión crece exageradamente hasta blastocito expandido.aunque los embriones pueden ser recuperados entre los días 6 y 9 después de la ovulación, los días óptimos son el séptimo o el octavo. La principal indicación para recuperar embriones en el día 6 es para realizar el congelamiento de dichos embriones. Los embriones no son recuperados en el día 9 porque el porcentaje de transferencia exitosa es generalmente más bajo que para los embriones recuperados en los días 7 u 8. Lavado uterino: se realiza un lavado uterino transcervical, se coloca la yegua en el potro de contención y se hace un lavado del periné con un detergente suave, se enjuaga con agua limpia y se seca. Un operario se coloca un guante estéril en un brazo, lo lubrica de forma estéril e introduce un catéter también estéril que cuenta con un balón. Se introduce el catéter a través del cérvix hasta llegar al cuerpo del útero, se infla el balón y se tracciona caudalmente para que quede comprimido en el agujero del cérvix y así evitar la pérdida de liquido. Una vez colocado el catéter, el útero es lavado tres a cuatro veces con solución salina amortiguada con fosfatos puro o modificado (DPBS) previamente entibiado (30-35º C) 9

10 conteniendo 1% de suero fetal bovino, penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). El útero es llenado con 1 a 2 litros de DPBS en cada lavado (4 a 8 litros son usados durante todo el proceso de recolección). Después de llenado el útero se le permite al líquido salir y pasar a través de un filtro para embriones de 0.75µ. Es importante que el filtro de embriones no rebase o quede sin líquido, los filtros son ahora diseñados para prevenir ambos problemas. El líquido que pasa por el filtro es recolectado para evaluar cuanto se recuperó. Después del primer lavado el útero es masajeado a través del recto durante los subsiguientes lavados, y esto puede ayudar a que el embrión quede suspendido en el medio y además aumentar la recuperación total del líquido. La mayoría (> 90%) del líquido de lavado debería ser recuperado y estar libre de restos celulares o de sangre. La recuperación de líquido de lavado opaco indica que la yegua tiene un proceso de endometritis activa en el momento del lavado, y necesitará una evaluación diagnóstica futura. La presencia de sangre es asociada con un masajeo vigoroso del útero y o la manipulación del catéter. Recuperación de embriones: El líquido recuperado es revisado utilizando un microscópio estereoscópico a un aumento de 15x. Los embriones de 8 días usualmente se ven a simple vista. Cuando un embrión es identificado, es lavado como mínimo por 3 pasajes sucesivos en gotas de un mililitro de medio DPBS con 10% de suero fetal bovino, después del lavado el embrión se coloca en el mismo medio en una placa de Petri de 35 x 10 mm. El embrión es evaluado a mayor aumento (40-80x) y calificado usando la escala de 1 (excelente) a 4 (pobre). Los embriones pueden ser tomados utilizando pajuelas de 0,25 o 0,5 cc, pipetas capilares de vidrio de 25 µl, o cualquier otro instrumento adosado a una jeringa. 10

11 El proceso de levantar y depositar un embrión debería ser realizado bajo lupa estereoscópica. Una vez que los embriones son colocados en el medio de mantenimiento, estos deben ser rápidamente envasados para el transporte o transferidos a una hembra receptora. Envasado de embriones: Los embriones equinos son refrigerados y transportados utilizando el método desarrollado por Carnevale et al. Este método consiste en la utilización del medio F-10 de Ham para su conservación y refrigeración. Debido a que el medio F-10 de Ham debe ser gaseado antes de ser usado y esto requiere de un tanque de la mezcla de gases con su válvula reguladora, muchos veterinarios solicitan que el centro de transferencia embrionaria les envíe el medio F-10 de Ham ya gaseado antes de la recuperación del embrión. 4. Transferencia embrionaria Al principio, la transferencia de embriones se realizaba de forma quirúrgica, realizando una laparotomía del flanco.en las últimas décadas, los resultados que se han obtenido con la transferencia no quirúrgica han superado las tasas de éxito con el método no quirúrgico. El enfoque de esta técnica se resume como el uso de una técnica aséptica, con un daño mínimo al cérvix al depositar el embrión en útero del receptor adecuado. Como ya se ha explicado antes, las yeguas receptoras deben de estar en sincronizadas con la yegua donante. Por ello, se utilizan yeguas de 4 a 8 días post ovulación, siendo los que mejores resultados que proporcionan. Antes de la transferencia, la yegua debe de ser examinada mediante ecografía transrectal y palpación. Tiene que tener un buen tono uterino y el cuello del útero bien cerrado. Esto es indicativo de un nivel de progesterona aceptable en la circulación sanguínea. En la ecografía tiene que encontrarse desarrollo folicular, una mucosa del útero uniforme, sin edema o fluido. En el caso en que haya que sedar a la yegua, se esperará hasta que se vaya a transferir el embrión. La cola tiene que estar atada o sujeta a un lado. Se tiene que realizar una limpieza del periné, la vulva y el vestíbulo. Debemos de añadir, que los aparatos no son tan importantes como la técnica. Sin embargo, los que se utilizan son: 11

12 Pajuelas Existen dos medidas diferentes, de 0,25ml y de 0,5mL. El embrión debe ocupar no más del 60% al 70% del diámetro interno de la pajuela, preferiblemente menos. Pistola de inseminación Catéter de transferencia de embriones Si el embrión es demasiado grande para una pajilla de 0,5mL, se realiza una inseminación estándar con este catéter. 12

13 Tanto la pistola como el catéter deben de estar protegidos por un manguito de plástico estéril, para proteger la esterilidad del aparato de transferencia de embriones. Técnica: Una vez que la yegua está preparada, se introduce la pistola o la pipeta de transferencia de embriones se guía al cuello uterino. El orificio externo puede ser rodeado por el pulgar, prácticamente, con los dedos se puede proporcionar sujetar la pistola o la pipeta. Primero se introduce el arma a través del guante y luego a través del cuello uterino. El veterinario, mediante palpación rectal, sujeta el cuello del útero. La punta de la pistola o pipeta se guía a través del cuerpo uterino. Una vez dentro de la luz, en la base del cuerno uterino (cerca de la bifurcación), un asistente, puede empujar el émbolo del aparato y expulsar el embrión en el útero. Entonces, la pistola o la pipeta se retiran. Este proceso debe de durar entre 1 o 2 minutos y debe ser lo menos traumática posible para el cérvix y el útero. Hay que tener cuidado y ser lo más asépticos que podamos, ya que cualquier paso de bacterias a la vagina o al útero puede dar lugar a 13

14 una endometritis. No obstante, las yeguas que han recibido un embrión no quirúrgicamente, se les administra antibiótico y Regumate (progestágeno sintético) durante 5 días después de la transferencia. Las receptoras serán examinadas con ecografía cinco días después de la transferencia (9-12 días de la gestación) y luego a los 15, 25, 35, 45 y a los 60 días de gestación. La mayor tasa de muerte embrionaria se produce entre los días de gestación. Parece ser mayor en la transferencia de embriones en yeguas inseminadas con semen fresco. En los últimos años, se han logrado notables avances en la tecnología de la transferencia de embriones y las técnicas asociadas (superovulacion), micro manipulación y conservación de los embriones, las cuales están rebasando la fase experimental, para convertirse en herramientas útiles en las explotaciones equinas modernas. Libro: 5. Bibliografía - P. Brinsko, S, L. Blanchard, T, D. Varner, D, Schumacher J, C, Love C, Hinricks K, Hartman D. Manual of equine reproduction: Embryo Transfer. Chapter 17. Maryland Heights, Missouri: Elsevier; Monografías: - Katila T, Wade J.F. Equine embryo Transfer. Monograph Series No. 3. Hvemeyer Foundation; Alvarenga M, Wade J.F. Equine embryo Transfer. Monograph Series No. 14. Havemeyer Foundation; 2004 Artículos: Tesis: - Vanderwall D. Tecnicas actuales de transferencia embrionaria equina. Recent advances in equine reproduction. 2000; B. A. Ball (Ed.) - Rodriguez I, Sanz J, Perez C, Felipe M; Fertilidad in vivo del esperma equino congelado descongelado. I Jornadas de Investigacion Veterinaria. Cordoba, España. Pp: Alonso Castro Jimenez A. Tasa de ovulación y gestación en yeguas sincronizadas con prostaglandinas y gonadotropina coriónica humana. Julio de

15 Internet: - Rodriguez Artiles I, Profesora titular de la universidad, departamento de medicina y cirugía animal, hospital clínico de la universidad de córdoba. Inseminacion artificial o monta dirigida en la yegua. - Broto Turmo M. Sincronización del celo. Aula Magna Equisan. Autores: Inés Conejo Barruso/María García Gálvez EQUISAN Veterinaria Equina Integral 15