EFECTOS DE LAS DEFICIENCIAS DE COBRE EN LA REPRODUCCIÓN Y EFICACIA DE LAS NUEVAS BIOTECNOLOGÍAS DEL GANADO BOVINO EN CUBA. RESEÑA

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1 EFECTOS DE LAS DEFICIENCIAS DE COBRE EN LA REPRODUCCIÓN Y EFICACIA DE LAS NUEVAS BIOTECNOLOGÍAS DEL GANADO BOVINO EN CUBA. RESEÑA R. Pedroso y Felicia Roller Centro de Investigaciones para el Mejoramiento Animal de la Ganadería tropical (Cimagt) Ministerio de la Agricultura. Avenida 101 No 6214 entre 100 y 62 Reparto Loma de Tierra. Cotorro. Ciudad de La Habana. Cuba pedroso@cima-minag.cu. RESUMEN Esta reseña tuvo como objetivo exponer el impacto de las deficiencias de cobre (Cu) en la reproducción y eficacia de las nuevas biotecnologías e identificar algunos aspectos del mecanismo de acción. La presentación de hipocuprosis es la segunda carencia mineral más frecuente de los rumiantes en pastoreo, en Cuba afecta a más del 30 % de los bovinos. El diagnóstico de rutina en el animal está basado en el valor predictivo de la cupremia en estudios poblacionales, las mediciones del Cu hepático y la actividad de las enzimas Cu-dependientes en el dictamen confirmativo. La hipocuprosis se asocia a los fallos reproductivos de anestro, repeticiones del celo, aborto y las infecciones uterinas, baja tasa de desarrollo y crecimiento embrionario. No se ha probado la participación del eje hipotálamo hipófisis en su mecanismo de acción. Nuevas explicaciones a estos fenómenos se buscan en los fallos de las síntesis o secreción de hormonas ováricas dado los avances obtenidos en la terapéutica hormonal sustitutiva del tratamiento del anestro en animales suplementados con Cu. La inmunosupresión que acompaña esta deficiencia explica su relación con las infecciones uterinas. La respuesta a la suplementación de Cu vía oral o parenteral resulta ser eficiente para resolver este problema en las hembras bovinas en pastoreo. Se concluye, que la identificación de los cambios moleculares y celulares que acompañan a la hipocuprosis en los ovarios, hipófisis y embriones cultivados in vitro puede aportar datos de importancia al conocimiento y facilitarían la aplicación de los nuevos procedimientos biotecnológicos. Palabras clave: hipocuprosis deficiencia, cobre, reproducción, anestro, desarrollo embrionario EFECT OF COPPER DEFICIENCIES ON THE REPRODUCTION AND EFFECTIVENESS OF NEW BIOTECHNOLOGIES FOR BOVINE CATTLE IN CUBA. REVIEW ABSTRACT The impact of copper (Cu) deficiency on the reproduction and efficacy of new biotechnologies is reviewed and some aspects of the action mechanism are identified. Hypocuprosis is the second most frequent mineral deficiency found in grazing ruminants in Cuba, affecting more than 30% of the cattle. Routine diagnosis in the animal is based on the predictive cupremia value in population studies, the measurements of liver Cu and the activity of the Cu-dependent enzymes in the confirmative verdict. Hypocuprosis is associated to anoestrus reproductive failures, heat repetitions, abortion and uterine infections, poor development rate and embryonic growth. The participation of the hypothalamus-hypophysis axis in its action mechanism has not been proven. New explanations to these phenomena are searched for in the synthesis failures or the secretion of ovarian hormones, given the progress reached in substitutive hormonal therapy of the anoestrus treatment in Cu supplemented animals. Immunesuppresion accompanying this deficiency accounts for its relationship with uterine infections. The response to oral or parenteral Cu supplementation was effective to solve this problem in grazing cows. It is concluded that the identification of molecular and cellular changes linked to hypocuprosis in ovaries, hypophysis and in vitro cultivated embryos can contribute with important data that would facilitate the application of new biotechnological procedures. Key words: hypocuprosis, copper, reproduction, anoestrus, embryo development INTRODUCCIÓN Las deficiencias minerales son una de las causas más importante de la baja productividad del ganado bovino criado en pastoreo y escaso uso de concentrados (McDowell 2005). Actualmente son reconocidos que más de 21 elementos minerales son esenciales en la alimentación de los rumiantes. En el trópico, (Underwood y Suttle 1999) como en otras regiones del mundo (Pavlata et al. 2005) la alimentación a base de pasturas por si misma, no es capaz de suplir los requerimientos de minerales y existe una situación delicada entre el equilibrio y desequilibrio, especialmente de los microelementos que afectan la productividad del ganado (McDowell 2005). En este sentido, la deficiencia de cobre es una de las más importantes y se ha asociado en todo el mundo a los problemas reproductivos y a la disminución en la producción de leche y 101

2 carne, así como al aumento de la susceptibilidad a las infecciones (Kendall et al. 2001, Downs et al. 2008). Sin embargo, escasean los conocimientos sobre el mecanismo de acción mediante los cuales esta carencia nutrimental afecta la reproducción y otras esferas de la producción. Hoy, cuando se incrementa la aplicación de muchas de las nuevas tecnologías de la reproducción, surgen las interrogantes de cómo será el impacto que pueda ejercer esta carencia mineral en la eficacia de los programa de reproducción controlada mediante terapéutica hormonal, la transferencia de embriones y la fertilización in vitro (Gao et al. 2007). Esta revisión de la literatura tiene como finalidad realizar un esbozo sobre el posible mecanismo de acción de la deficiencia de cobre y mostrar su impacto en la reproducción y eficacia de las nuevas biotecnologías. Incidencia de la deficiencia de Cu en el mundo y en Cuba La presentación de hipocuprosis en rumiantes es considerada la segunda carencia mineral más frecuente en bovinos en pastoreo después de la de fósforo (Underwood y Suttle, 2001, Picco et al. 2004) y ha sido señalada en muchos de los principales países productores de ganado bovino en diferentes regiones, entre ellas: Gran Bretaña, Holanda, Escocia, Nueva Zelanda, Canadá, Australia y Estados Unidos (Grace y Wilson 2002, McDowell 2004) y en la República Checa (Pavlata et al. 2005, Slavik et al. 2006). En América Latina esta carencia mineral está ampliamente distribuida en Argentina (Titarelli et al. 2001, Pico et al. 2004), en México (Ávila et al. 1997, Hernández 2006, Huerta 2007) y en varios estados de Brasil (Da Silva et al. 2008) En Cuba, esta ha sido señalada en rebaños bovinos lecheros (González 1982) y productores de carne (Pedroso et al. 1985) y su distribución territorial afecta tanto la región central, occidental (García y Cuesta 2004, Gutiérrez et al. 2006, García 2008) y oriental de Cuba (Fajardo, 2001, Fajardo et al. 2004). En estos estudios se ha encontrado un elevado número de animales con bajos tenores de Cu en suero sanguíneo y tejido hepático con un valor promedio de 25 ppm. En previos estudios, Pedroso et al. (1984). Encontraron hipocupremia leve en rebaños mestizos Holstein x Cebú. En estos hatos la hipocupremia afectó al 30 % de las hembras investigadas y esta deficiencia estuvo asociada al anestro, la repetición del estro y las retenciones de placentas. Además, fue demostrada la influencia de la época del año (P<0.001) en las concentraciones de Cu tanto en los pastos como en el suero sanguíneo. Acorde con los resultados, en el período lluvioso los valores de la cupremia eran superiores (16.48 µmol/l) respecto al período poco lluvioso (11.93 µmol/l) P<0.001, aunque el promedio animal fue de µmol/l. No existen estudios que caractericen la influencia de los antagonistas tales como el molibdeno, azufre o el hierro. Las causas de la hipocuprosis en el país se han asociado al consumo de aguas salobres, baja disponibilidad de las mezclas minerales y los contenidos en las pasturas y el estado de acidosis metabólica. Sin embargo, se ha corroborado el efecto de la estación y el estado del ciclo reproductivo y se determinó que durante la primavera era el período más crítico en la incidencia de hipocuprosis. En estos meses, las hembras mostraron valores de Cu sérico dentro del rango de cupremia severa que afectan preferentemente las categorías de recentinas y gestantes de 7-9 meses. Mientras, las vacas de 4 a 6 meses de gestación mantuvieron niveles de hipocupremia leves durante todo el año. Este resultado probablemente estuvo relacionado, por una parte, al efecto del amamantamiento y, por el otro, al aumento de los requerimientos del feto. Este hallazgo indica, que la disponibilidad y requerimientos de Cu eran insuficientes para satisfacer las necesidades de las hembras en estas condiciones ambientales (Tabla 1). Ello indica que bajo los sistemas de producción en estos hatos, la estrategia más adecuada de suplementación a esta deficiencia debe realizarse en el inicio y final del período de lluvioso con el fin de prevenir las pérdidas económicas ocasionadas por esta carencia nutricional (Ramírez et al. 1997). 102

3 Tabla 1. Variaciones estacionales de la cupremia en vacas Santa Gertrudis (Pedroso et al.1985) Categoría Meses Febr.-abri Mayo-julio Agost-oct. Nov.-ene. Variaciones estacionales Recentinas Gestantes 1-3 meses Gestantes 4-6 meses Gestantes 7-9 meses En ganado mestizo lechero Holstein x Cebú recientemente, se ha informado la deficiencia de Cu en la zona oriental (Fajardo et al. 2004) y la región central de Cuba (García y Cuesta 2004). Estos hallazgos muestran, que las carencias de cobre constituyen, uno de los principales problemas de la nutrición mineral de los bovinos en pastoreo. Las evidencias experimentales existentes explican que en estos animales, la disponibilidad y requerimientos de Cu son insuficientes para satisfacer las necesidades de las hembras bovinas, bajo estas condiciones ambientales de producción. Ello justifica las investigaciones encaminadas a determinar los requerimientos de los bovinos en pastoreo bajo las condiciones de producción del trópico. En este sentido, los estudios realizados al respecto muestran la importancia de la raza y ello debe ser un punto que se debe considerar en los climas cálidos donde está generalizada la existencia de rebaños mosaicos compuestos por genotipos cuyo origen ha sido los cruzamientos del Bos taurus con el Bos indicus. En la Tabla 2 se muestran algunos hallazgos de las concentraciones de Cu en pasto, suero sanguíneo e hígado de rebaños bovinos de diferentes regiones en Cuba afectado por hipocuprosis. Tabla 2. Niveles de cobre en pasto, suero sanguíneo e hígado de bovinos afectados con hipocuprosis de diferentes regiones de Cuba Autores -año Genotipos Regiones Pastos (ppm) Suero sanguíneo (µmol\ L) Hígado (ppm) González et al. Mestizos (1984) H x C y BS x C SS 8.53 ± ± ± 1.00 Pedroso et al. Pedroso et al. Santa Gertrudis H x C y BS x (1985) (1996) Mestizos C CA SS 5.74 ± 1.77 \\\\\\\\\ 8.36 ± ± ± ± 4.09 Fajardo (2001) Mestizos 1 H x C G ± ± 0.10 \\\\\\\\\ García (2008) Mestizos H x C VC 5.30 ± ± ±26.88 SS = Sancti Spiritus, CA = Ciego de Ávila, G= Gamma, VC = Villa Clara H=Holstein, C= Cebú, BS= Brown Swiss Diagnóstico de la deficiencia de cobre en animales afectados El diagnóstico de la hipocuprosis puede plantearse bajo dos aspectos diferentes: por un lado, cuando se busca identificar la deficiencia en los animales y por el otro lado, cuando se quieren conocer las causas que la provocan. El 103 primero, permite conocer el balance de Cu en los animales, mientras que el segundo, incluye estudios medioambientales que identifican las zonas de riesgo y caracterizan el comportamiento epidemiológico de la enfermedad. Hasta el presente no se ha identificado un parámetro preciso que indique el momento exacto en que los animales comienzan

4 a sufrir las alteraciones clínicas o subclínicas de la hipocuprosis. Por ello, en el diagnóstico se emplea la determinación de las concentraciones de Cu en hígado (Kincaid 1999, De Rosa y Muttioli 2002, Mee 2004) y en la sangre (Mulligan et al. 2006) como indicadores indirectos, y la actividad de varias cuproenzimas como indicadores directos del desbalance (Quiroz y Bouda 2001, Gao et al. 2007). Las concentraciones normales de Cu hepática se encuentran entre 100 a 400 ppm sobre base seca, es el primer indicador afectado y guarda una relación lineal con la absorción intestinal cuando la dieta no cubre los requerimientos. Por tal razón, el Cu hepático es un buen indicador de depósito, pero un insensible indicador de deficiencia. Esto queda de manifiesto en las diferentes concentraciones hepáticas sugeridas como indicadores de pérdidas productivas (Kincaid 1999, De Rosa y Mattioli 2002, Mee 2004). La obtención de la muestra se realiza por biopsia hepática o se obtiene de animales sacrificados. Este análisis es muy necesario en trabajos experimentales pero de uso más limitado en el diagnóstico de rutina (Whitaker et al. 1999). El análisis de cupremia por su parte, es un indicador sensible de la etapa de deficiencia. Los valores normales de Cu en suero sanguíneo se encuentran por encima de 10 µmol\l (Mulligan et al. 2006). En la práctica resulta útil subdividir los valores de cupremia en tres rangos: por encima de 10 µmol\l (normocupremia), entre 4.7 y 10 µmol\ L (hipocupremia leve) y aquellos menores de 4.7 µmol\ L (hipocupremia severa). La normo cupremia sugiere que los animales no se hallan expuestos al desbalance. La hipocupremia leve, es indicativa de que la reserva hepática de Cu ya no es capaz de mantener el nivel plasmático normal, pero posiblemente no se vean afectadas las enzimas Cu dependientes a nivel tisular, debido a que los animales no suelen mostrar signos clínicos importantes de la enfermedad y algunos informes sostienen que tampoco responden a la suplementación con Cu en los ensayos dosis-respuesta (Ferrer et al. 1989). Sin embargo, el problema principal radica en que existe mucha variabilidad entre la aparición de la deficiencia de Cu y el desarrollo de los cambios patológicos y ello está determinado por la reserva de Cu hepática inicial que posea el 104 animal. Cuando existe un estado de hipocupremia severa y éste se mantiene por más de 30 días puede verse afectado más del 50 % del contenido del Cu hepático (Mills 1987). Es así como, en ensayos experimentales se ha demostrado que de un valor inicial de Cu hepático de 133 ppm base seca (BS) bajo condiciones de depleción se requiere de 70 a 200 días para agotar las reservas y se caiga en estado de deficiencia con valores entre 20 a 25 ppm (Underwood y Suttle 2001). En estos casos, se hace probable el comprometimiento de las enzimas Cu dependientes y se observan los síntomas clínicos de la enfermedad. Consecutivamente, bajo condiciones de repleción con niveles disponibles de Cu entre 15 a 30 ppm de la materia seca, solo se necesitaron 14 días para recuperar las reservas orgánicas y los niveles de cupremia normales (Yost et al. 2002) En experimentos desarrollados en las condiciones de producción en Cuba (Tabla 2), se ha probado, que con valores de cupremia entre 8 a 14 µmol\l se han obtenido respuestas en la tasa de cupremia y productividad del ganado tanto en la suplementación oral (Gonzáles 1984, como parenteral (García et al. 2007). En este sentido, se considera que valores de cupremia entre (Tarrero et al. 1988) ó > 14.0 µmol\l (García 2008), son compatibles con un comportamiento reproductivo normal. Esto resultados sugieren, que el empleo de rangos de cupremia aumenta su valor diagnóstico, aunque no se ha hallado aún un valor exacto de cupremia que asegure una respuesta a la suplementación con Cu. Presumiblemente ello está relacionado con el nivel de la reserva hepática al momento del inicio de la suplementación de Cu. Es evidente, que cuando los valores de Cu hepáticos no son inferiores a los niveles críticos (< 60 ppm) es factible que no se observe una respuesta inmediata, dado que al parecer el organismo primero restablece sus reservas y después eleva los valores de la cupremia en la sangre (Mills 1987). Por tal razón, la detección de Cu en el estado preclínico es un problema que ha motivado el desarrollo de nuevos medios diagnósticos para conocer el comportamiento del cobre en el organismo tomando entonces como base, los cambios metabólicos en los cuales se implican, la medida de actividad o concentración de enzimas que contienen cobre

5 en su molécula y, entre ellas, se citan principalmente las enzimas ceruloplasmina (Cp) y la superóxido dismutasa (SOD). La ceruloplasmina es el principal transportador de cobre en el organismo, aproximadamente el % del cobre circulante se encuentra unido a la Cp. Esta enzima es una proteína de fase aguda y aunque se relaciona con las concentraciones de Cu en el hígado y Cu plasmático, su actividad es influenciada por otros factores como el ingreso en la dieta, procesos inflamatorios, infecciones, sexo y edad del animal. Por ello, cuando se emplea como indicador de la hipocuprosis, es necesario considerar los distintos factores que influyen en la acumulación de Cu en los tejidos (Alonso et al. 2006). La superóxido dismutasa (SOD) es otra enzima cobre dependiente que se ha empleado como indicador del estado de cobre en los animales (Guiroz-Rocha y Bouda 2001). Esta enzima se encuentra principalmente en el eritrocito y los tejidos. Su función es la conversión de radicales superóxidos en peróxido de hidrógeno. Cuando se presenta una disminución en el estado del Cu en los animales, se ha identificado una disminución en la actividad de la SOD. Sin embargo, como todas las enzimas Cu-dependientes, no incrementa su actividad según se aumenta la acumulación de cobre en el hígado, no tiene una aplicación de rutina como método de diagnóstico para el estado de Cu en los animales, aunque sí es empleada en cultivos de tejidos para evaluar los procesos de oxidorreducción que ocurren a nivel celular (Gao et al. 2007). En estudios recientes, Minervino et al. (2008) han considerado que las enzima aspartato-transferasa (AST) y la gamma glutamil-transferasa (GGT) son otros candidatos enzimáticos para el diagnóstico de las deficiencias de cobre. De lo expuesto anteriormente se deduce, que el diagnóstico de la hipocuprosis puede realizarse mediante la determinación de la cupremia, para los diagnósticos de rutina en estudios poblacionales. En este caso su valor predictivo puede emplearse en la implementación de programas de suplementación profiláctica. Mientras, las mediciones del Cu hepático y la actividad de las enzimas Cu-dependientes serían más apropiadas utilizarlas en los ensayos experimentales donde se requiera conocer el estado de las reservas y 105 cuando sea necesario comprobar ciertos fenómenos del metabolismo oxidativo a nivel celular. Relación de la hipocuprosis con la reproducción, eficacia de las nuevas biotecnologías y contribución al conocimiento de su posible mecanismo de acción Numerosas investigaciones desarrolladas en Cuba (Pedroso et al. 1996, García y Cuesta, 2004, García et al. 2007) y el resto del mundo (Royal et al. 2000) demuestran que rebaños bovinos con un deterioro manifiesto en su capacidad reproductiva presentan alteraciones del metabolismo mineral y, en especial, la deficiencia de Cu. En esta dirección, se ha sugerido que la hipocuprosis es causa de trastornos reproductivos funcionales e infecciones del tracto reproductor tales como: las repeticiones del celo e infecciones uterinas, el retardo en la involución del útero, el aborto, el retardo en la aparición de la pubertad, el anestro y, en casos extremos, esterilidad (Pedroso y Roller 1997, Ruiz y Pedroso 2000). Sin embargo, no está esclarecido con exactitud el mecanismo de acción de este microelemento, mediante el cual induce la aparición de estos fenómenos reproductivos. Martínez y Sánchez (1999), plantearon que el Cu influye en la reproducción, debido a que interviene en la conversión enzimática de los precursores de la vitamina A y en la actividad de las enzimas antioxidantes. De aquí la importancia de este microelemento en la reducción del estrés oxidativo a nivel ovárico (Bach 2002).Se ha encontrado una fuerte correlación entre las concentraciones de vitamina A y las concentraciones de Cu en el organismo (Sharma et al. 2003). La deficiencia de Cu además de tener efectos directos en la producción hormonal, integridad del tracto reproductor y función ovárica provoca muerte embrionaria con la consiguiente repetición de servicio (Howard et al. 2001). En varios experimentos se ha demostrado que existe una correlación positiva entre los niveles de beta caroteno precursor de la vitamina-a y la cupremia en las hembras bovinas criadas en pastoreo. Así, un aumento de los niveles de betacaroteno y Cu en suero sanguíneo coincide con el aumento de la tasa

6 fertilidad, especialmente en las hembras Bos taurus (Pedroso 1979)). Es evidente que este fenómeno se justifica por una parte, porque en este período aumenta la disponibilidad de los pastos y mejora la condición física de los animales y, por la otra parte, cabe la posibilidad del efecto de estos componentes de la dieta en la disminución del estrés oxidativo tan importante durante las épocas de mayor temperatura ambiental en el trópico. En otros estudios, se ha atribuido el fallo reproductivo a que esta deficiencia conduce, a un estado de inmunosupresión por lo cual muchas veces se ha relacionado esta deficiencia con las retenciones placentarias, las metritis, la mastitis (Del Pino 2000) y mayor susceptibilidad a las enfermedades infecciones contagiosas (Spears y Weiss 2008) Otros autores han relacionado los fenómenos de infertilidad condicionados por las deficiencias de Cu con ciertos cambios en los perfiles endocrinos de hembras bovinas con hipocuprosis. Así, Phillippo et al. (1987) y Xin et al. (1993), dijeron, que en hembras bovinas deficientes en Cu, es frecuente encontrar una baja tasa de concepción caracterizada por ciclos anovulatorios y anestros que estuvo asociada con una disminución de la amplitud y los picos de LH (P<0.05), al ser comparados con animales normocuprémicos. Estos autores sugirieron, por ende, que el Cu está relacionado con la síntesis y secreción de las hormonas hipofisiarias, modulando la capacidad de liberación de la hormona luteinizante (LH), por lo cual se cree que la subfertilidad, infertilidad y esterilidad son debidas a bajos niveles o inhibición en la síntesis de hormonas gonadotróficas (Corbellini 1998). Al respecto, Ahola et al. (2005) desarrollaron una investigación con el objetivo de evaluar la respuesta hipofisiaria en vacas con hipocuprosis inducida posterior a un tratamiento con GnRH antes y después de una suplementación con Cu. En el ensayo no se mostraron los niveles de Cu en plasma sanguíneo durante las dos fases previstas en los experimentos. Los niveles iniciales de Cu en hígado fueron de 130±10.3 ppm en la fase previa a la suplementación y llegaron hasta < 30 ppm en la fase de hipocuprosis. Acorde con los datos expuestos en la fase de deficiencia en Cu, no se observaron cambios clínicos en los animales y posterior a la suplementación oral con fuentes orgánicas o 106 inorgánicas de Cu no se hallaron diferencias significativas entre los grupos tratados y control respecto a los niveles basales, amplitud y frecuencia de los pulso de LH en respuesta al tratamiento con GnRH. Tomando como base estos hallazgos los investigadores concluyeron que el mecanismo de acción por el cual el Cu afecta la reproducción, no ocurre a nivel del eje hipotálamo-hipófisis. Esta investigación muestra alguna inconsistencia, dado que no se expusieron los datos de los niveles de Cu plasmáticos lo cual pudiera haber permitido valorar con mayor precisión la evolución del estado de deficiencia. En cambio, se exponen valores de Cu contenidos en el tejido hepático que es un buen medidor de la reserva de Cu en el organismo, pero que no es un guía insensible del estado de la deficiencia. En tal sentido, es factible que estos animales estuvieran en estado de hipocupremia leve o moderada puesto que no mostraron cambios clínicos y tampoco respondieron a la suplementación (Ferrer et al. 1989) durante el periodo de repleción. Tal como se ha visto, es evidente que los datos registrados referentes al mecanismo de acción del Cu en la reproducción son inconsistentes, aunque la suplementación de este microelemento en áreas de producción afectadas por la carencia de este mineral contribuyó a mejorar la fertilidad y productividad de esta especie en Cuba (Tarrero et al. 1988) y otras latitudes (Walter 2001). En la actualidad, se están realizando múltiples estudios para descifrar muchos fenómenos que hasta hoy no se habían dilucidado referentes a los mecanismos de acción del Cu en la reproducción. Esto se ha logrado gracias al avance experimentado en la ciencia contemporánea que ha permitido utilizar como herramienta las técnicas de citogenética y el modelo práctico de la tecnología de transferencia y producción de embriones in vivo e in vitro. Picco et al. (2004) señalaron que las métaloenzimas Cu-dependientes forman parte fundamental del mecanismo de defensa del estrés oxidativo en los bovinos. Estos investigadores demostraron la asociación que existe entre las deficiencias de cobre y los daños en el DNA. Ellos comprobaron que la hipocuprosis estaba significativamente (P<0.001) relacionada con la migración y

7 aberraciones cromosómicas y que este fenómeno pudiera explicar el alto porcentaje de animales que presentan estrés oxidativo, cuando se encuentran en estado de hipocuprosis moderada y severa. Prasad y Mauryas (2003) relacionaron la respuesta superovulatoria y la tasa de gestación con los niveles de cobre en suero sanguíneo. En el experimento donde fueron usadas vacas Sahiwal donantes y receptoras de embriones se demostró que la mejor respuesta al tratamiento superovulatorio y la mayor tasa de gestación en las vacas fueron las que mostraron los mayores niveles de Cu sérico. De estos resultados se concluye que es posible que muchas de las causas de infertilidad asociada a las deficiencias de Cu se puedan explicar por el papel que desempeña este microelemento en los sistemas enzimáticos que regulan los fenómenos de oxidorreducción a nivel celular. En Inglaterra, donde las deficiencias de cobre son una de las causas importantes de subfertilidad del ganado bovino, existe un especial interés en conocer el papel del cobre y otros microelementos en el crecimiento y desarrollo celular. En esta dirección, Kendall et al. (2003) realizaron estudios encaminados a demostrar el efecto de la inducción de la deficiencia de cobre en el sistema enzimático lysyl-oxidasa en cultivos in vitro de células de la granulosa. Este sistema enzimático es esencial para la estabilización de la matriz celular, migración y diferenciación celular. En los experimentos desarrollados se demostró que la inducción de deficiencia de cobre con thiomolibdato induce un bloqueo de la expresión de este sistema enzimático y la diferenciación celular inducida por la acción de la FSH. Este fenómeno es reversible y responde a la suplementación de Cu en el medio de cultivo. Más tarde, Kendall et al. (2006) realizaron un experimento para determinar el efecto de la suplementación con Cu a medios de cultivos de células de la teca donde demostraron, que la suplementación con Cu en los medios de cultivo libre de suero sanguíneo, puede mejorar la diferenciación de las células de la teca cultivadas in vitro. Por tal razón, afirmaron, que la subfertilidad provocada por las deficiencias de Cu probablemente sea el resultado en la perturbación de los patrones de crecimiento y desarrollo de los folículos ovárico y patrones hormonales de la esteroidogenesis. Aunque durante el desarrollo de la investigación no se midieron los niveles de hormonas esteroidales producidas por las células de la granulosa, los resultados parciales expuestos en estos dos experimentos, pueden explicar muchos de los casos de infertilidad asociados a trastornos funcionales que afectan integralmente el eje hipotálamo-hipófisis-ovario cuya manifestaciones clínicas en la práctica son el anestro, los ciclos irregulares y anovulatorios que dependen, en gran medida, de la acción de las hormonas de origen ovárico a través de su mecanismo de retroalimentación (feedback) positivo o negativo en el hipotálamo para la liberación de GnRH y, de éste en la hipófisis, en la secreción y liberación de FSH y la LH. En otros estudios se ha realizado un nuevo enfoque del problema y han orientando sus investigaciones hacia la evaluación del efecto de este microelemento en la capacidad de maduración, desarrollo y crecimiento de los ovocitos fertilizados y cultivados in vitro. Así, recientemente Gao et al. (2007) valoraron el impacto de la adicción hierro (Fe) y Cu a los medios de maduración de embriones producidos in vitro. En el estudio se determinó el contenido de estos minerales en el licor folicular de varios diámetros, previo el tratamiento (Tabla 3), durante y después de la suplementación de hierro y Cu al medio de cultivo (Tablas 4 y 5). Tabla 3. Niveles de hierro y cobre en licor folicular de hembras bovinas (Gao et al. 2007) Tamaño del folículo Microelementos < 3 mm 3-7 mm 7-10 mm > 10 Fe (mg\l) Cu (mg\l)

8 Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de cobre en medio de cultivo in vitro en la maduración y subsiguiente desarrollo del embrión (Gao et al. 2007) Cobre(mg/L) Ovocitos (No.) Madurados Células (2) Células (8) Mórulas Embriones (78.5) 88(62) 76(53.5)a 67(47.2)a 48(33.8)a (80.6) 92(59.7) 84(54.5)a 67(43.5)a 57(37.0)a (75.0) 77(55.8) 66(47.8)a 48(34.5)b 33(23.9)b (70.0) 74(55.6) 67(50.4)a 47(35.3)b 34(25.4)b Control (75.9) 77(52.0) 53(35.8)b 36(24.3)c 17(11.5)c Estos autores comprobaron que el añadir estos minerales traza al medio de maduración se ejerce un efecto beneficioso en la maduración y desarrollo del embrión producido in vitro. Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de cobre en los medios de cultivo in vitro en la tasa de apoptosis celular en embriones cultivados in vitro (Gao et al. 2007) Cobre (mg/l) Número de blastocito Total de células de los blastómeros Número (%) de apoptosis en los blastómeros (7.7)a (6.7)a (7.6)a (7.9)a Control (9.5)b Por tal razón, es probable que la subfertilidad provocada por las deficiencias de Cu sea el resultado de la perturbación de los patrones de crecimiento y desarrollo de los folículos ováricos, así como los patrones hormonales de la esteroidogenesis (Kendall et al. 2006). Es incuestionable que añadir este mineral a los medios de cultivo puede ejercer un efecto beneficioso en la maduración y desarrollo del embrión producido in vitro (Gao et al. 2007). En consecuencia, sería atractivo comprobar si la suplementación con Cu puede por una parte, modificar los valores de este microelemento en el licor folicular y por la otra, si esta acción ejerce algún efecto en la maduración, crecimiento y desarrollo de los embriones producidos in vitro. De estos estudios surgen conocimientos que permiten enarbolar hipótesis sobre los posibles mecanismos mediante el cual el cobre influye en la reproducción (Figura.1). Ante la situación planteada, siendo la deficiencia de Cu una de las más importantes en el trópico, sería útil profundizar en su mecanismo de acción antes y después de la suplementación en animales afectados de hipocuprosis, mediante la evaluación de los cambios moleculares y celulares que ocurren en los cultivos de embriones in vitro y los fenómenos endocrinos empleando como material experimental las de hembras donantes y receptoras de embriones. 108

9 Cambios fisiopatológico Hipotálamo Decrece el número y sensibilidad de los receptores de GnRH Decrece la liberación amplitud y frecuencia de los pulsos de FSH y LH Hipófisis Problemas reproductivos Decrece el tamaño del FD Disminuye el nivel de secreción de E2 Decrece el tamaño del CL Disminuye el nivel de secreción de P4 Decrece la capacidad de desarrollo y crecimiento del embrión FSH P4 Ovario E2 LH Anestro, anovulación Repeticiones del celo (Afecta el desarrollo y crecimiento del zigoto Decrece la actividad de las enzimas SDM y Catalasa Depresión del sistema inmune Mayor sensibilidad al estrés del calor Útero Abortos y ME, RP, MP, Figura 1. Esquema del posible celo, MP = Me mecanismo mediante el cual las deficiencias de cobre afectan la reproducción en la hembra bovina. ME = Mortalidad embrionaria, RP= Repeticiones del metritis puerperal. Fuentes de cobre y métodos de suplementación La suplementación mineral en los rumiantes puede realizarse mediante métodos directos e indirectos. Entre los métodos indirectos, se encuentra el empleo de fertilizantes que contengan minerales, la alteración del ph del suelo y el cultivo de ciertas pasturas. Este método presenta ciertos problemas, debido a la complejidad de las interrelaciones entre el suelo, la pastura y los minerales y las dificultades causadas por condiciones climáticas indeseables así, como sus altos costos. En consecuencia, solo son utilizados cuando las condiciones climáticas y económicas son favorables. En este caso es probable que la aplicación de fertilizantes en el suelo constituye un medio eficaz de mejorar tanto el rendimiento como la composición mineral de las pasturas (Underwood y Suttle, 2001). En efecto, aunque el mayor contenido mineral de los forrajes obtenido mediante la fertilización, presenta la ventaja de asegurar un consumo más uniforme de minerales a menos que se produzca un aumento manifiesto y rentable de la producción de forraje que pueda ser aprovechado eficazmente por el ganado en pastoreo, el aumento de la producción de carne o leche por el empleo de fertilizantes para cubrir carencias minerales en los animales resulta prohibitivo desde el punto de vista económico. Los métodos directos se pueden subdividir en obligados y ad libitum. Dentro de estos métodos se encuentran, la utilización de bolos (Arthington y Spears 2007), balas y píldoras pesadas y el agua de bebida que en cierta época tuvo gran predicamento (McDowell 2005). Los bolos, balas y píldoras consisten en minerales comprimidos con un inerte de disolución lenta, que administrado por vía bucal, debería quedar en redecilla hasta su disolución total, hecho que en un porcentaje de casos no ocurre. Además son procedimientos caros, de administración engorrosa en rodeos grandes y sus resultados no son mejores que otros sistemas de administración oral. La utilización de mezclas minerales en agua de bebida se ha empleado en muchas regiones y si bien cumple con los requisitos de ser por vía oral y por toma diaria, algunos autores consideran que la suplementación mineral en el agua de bebida es un método de suministro de suplementación mineral muy irregular, no fisiológico, con pérdidas posibles de algunos 109

10 elementos, y con posibilidades de toxicidad (McDowell 2003). Otros procedimientos de amplia utilización es la incorporación de los minerales a los concentrados que se expenden en el mercado pecuario (Ruiz y Pedroso 2000). Este procedimiento asegura un suministro uniforme y eficaz de los minerales necesarios, con la ventaja de una mayor exactitud para cubrir los requerimientos si se toman los recaudos necesarios. Los métodos directos ad libitum, de libre elección o consumo voluntario (saladeros o saleros) tienen como principal problema que algunos animales consumen cantidades excesivas o insuficientes de suplemento mineral. Sin embargo, es el método práctico de mayor utilización para el ganado en régimen de pastoreo. Otro procedimiento de amplia utilización son los panes o bloques de minerales con melaza en muchos casos con agregado de nitrógeno no proteico. Se emplean con buenos resultados en rodeos de cría en invierno con pastoreos de rastrojos y pasturas diferidas y consumo de aguas salobres (Arthington y Pate 2002). En los experimentos de suplementación con cobre se ha tomado como fuente tradicional, el sulfato de cobre CuSO4 (Colombatto 2007), aunque en algunos ámbitos se sigue promoviendo el uso de óxido de cobre (CuO). No obstante, esta fuente es esencialmente no disponible para rumiantes, salvo por el uso reciente de bolos intraruminales a base de óxido (Pechin et al. 2006, Sprinke et al. 2006) siempre que la administración de Cu por esta vía no sobrepase 60 ppm por los efectos negativos que puede inducir en la acumulación de reservas de Cu en el hígado, la utilización de los forrajes y la ganancia en peso (Arthington 2005). La relativa eficacia de los bolos con respecto al óxido en polvo puede ser explicado por el lento pasaje de los bolos o agujas de óxido comparado con la forma en polvo. Sin embargo, son relativamente ineficaces cuando la concentración de antagonistas como el molibdeno y el azufre es alta. Con estos argumentos, una de las opciones presentes para mejorar la disponibilidad y absorción de Cu en presencia de antagonistas, es la utilización de fuentes quelatadas estas fuentes incluyen proteínicos, citratos de Cu y combinados con aminoácidos como lisina (Sogut et al. 1996, Ward et al. 1996). Esta unión de la molécula de Cu a moléculas orgánicas permite la formación de complejos solubles y altamente estables, que pueden resistir la acción de antagonistas. En algunos estudios, se ha demostrado que la disponibilidad de las fuentes quelatadas de Cu es superior a la del cobre en forma de sulfato en presencia de antagonistas, pero en ausencia de los mismos esta diferencia desaparece (Spears 2003). Otra fuente recientemente empleada es el cobre tribásico (CU2OH3CL), compuesto que posee una baja solubilidad en el ambiente ruminal y que le permite evitar la acción del molibdeno y el azufre (Arthington y Spears 2007) y evitar la acción del Molibdeno y el Azufre estando disponible para la absorción una vez solubilizado por el ambiente ácido del abomaso (Spears et al. 2004, McDowell 2005). De estos datos resulta evidente, que la nutrición de Cu puede afectar el consumo y digestibilidad de los forrajes y la tasa de crecimiento en dependencia de la presencia de antagonistas, la forma de presentación del suplemento y el nivel suplementado. Estos aspectos son destacados en la Tabla 6, proveniente de los resultados de las investigaciones realizadas por Ward et al. (1996). 110

11 Tabla 6. Efecto de la fuente de Cu en consumo de materia seca (MS), ganancia diaria (GD) y concentración de Cu en hígado de novillas alimentadas con altos niveles de molibdeno (Ward et al. 1996) Variables Control SO 4 Cu CO 3 Cu Proteinato de Cu SE N Peso vivo inicial(kg) Consumo de (MS)kg Ganancia diaria (kg) Cu en hígado (ppm) BS inicial Cu en hígado ppm BS final Diferencia Otra fuente recientemente empleada es el cobre tribásico (Cu 2 OH 3 CL), compuesto que posee una baja solubilidad en el ambiente ruminal que le permite evitar la acción del molibdeno y el azufre (Arthington y Spears, 2007) posee una baja solubilidad bajo condiciones ruminales que le permite evitar la acción del molibdeno y el azufre. Está disponible para la absorción una vez solubilizado por el ambiente ácido del abomaso (Spears et al. 2004). Con relación a lo anterior, (McDowell 2005) revisó la concentración de algunas fuentes y Cu disponibles y su biodisponibilidad relativa, encontró que con excepción del óxido de cobre (prácticamente no disponible para rumiantes), el cobre tribásico era el que más concentración del elemento tenía. En términos prácticos, esto quiere decir que se necesitan menos kilogramos de cobre tribásico para obtener la misma cantidad de Cu en el suplemento. Dentro de los métodos obligados, son agrupados los productos inyectables que por lo general no son usados como suplementos sino, tratamientos curativos. Sin embargo, en la actualidad, este concepto ha sido modificado ya que existen productos comerciales que por su formulación son de liberación lenta y de alta eficiencia y son utilizados como suplementos (Castelli et al. 2001, Pedroso et al. 2005, García et al. 2007). En la actualidad son numerosos los trabajos realizados con minerales inyectables, esto se debe en gran parte, a la facilidad para experimentar con lotes tratados y testigos que se pueden manejar en un mismo potrero, a diferencia de cuando se quiere trabajar con minerales por vía bucal o ad libitum. La dosis de minerales inyectados en cada aplicación es baja, 111 pudiendo alcanzar a cubrir los requerimientos totales, según el producto, desde menos de 30 días hasta 180 días y además permite conocer exactamente la dosis aplicada a cada uno de los animales (Quiroga et al. 1995). Recientemente, se está utilizando la administración de soluciones inyectables que contenga casi todos los minerales necesarios o solamente uno o dos de los cuales exista carencia (cobre, selenio, cobre y cobalto, cinc y cobre, fósforo y calcio, fósforo, calcio y magnesio simultáneamente o separados con o sin la adicción de ciertas vitaminas (Johnson et al. 1997). Estos productos pueden ser de absorción inmediata o preparada de absorción lenta para que su efecto se prolongue en el tiempo y se pueden inyectar simultáneamente con vacunas o antiparasitarios y combinarlos con mezclas minerales por vía oral ad libitum en forma permanente, lo que contribuye a mejorar la microflora y fauna del rumen. Por lo general, se utilizan dosis de 50 a 200 mg por vía subcutánea la cual resulta efectiva para elevar la cupremia (Ferrer et al. 1989, García et al. 2007) y la reserva hepática (Viejo y Casaro 1993), por lo que es considerado un tratamiento efectivo para suplir las deficiencias de este microelemento (Castelli et al. 2001).La industria farmacéutica tiene hoy en día disponible diversos productos que pueden ser utilizados estratégicamente para solucionar diverso estados de deficiencia presentes o al que pueden ser susceptibles los rumiantes durante su ciclo reproductivo o estado productivo especifico (Vanegas et al. 2004, Aparicio et al. 2007).Esto aspectos tienen singular importancia cuando se tiene en cuenta que los requerimientos de Cu señalados en la literatura no tienen en

12 cuenta las necesidades de la producción, la raza y las derivadas de la magnitud del estrés oxidativo del ganado criado en los trópicos. Según se ha citado en los acápites anteriores, son variados los métodos y fuentes de cobre disponibles para la suplementación del ganado lo que permite contar con la herramienta fundamental para prevenir y corregir las deficiencias y toxicidades que se presentan a menudo en el ganado criado en pastoreo. Esto aspectos tienen singular importancia cuando se tiene en cuenta que los requerimientos de Cu citados en la literatura no tienen en cuenta las necesidades de la producción, la raza y las derivadas de la magnitud del estrés oxidativo del ganado criado en los trópicos. Efecto de la corrección de las deficiencias Cu en la reproducción del ganado bovino en Cuba. La suplementación de Cu en hembras bovinas deficientes en Cuba ha ejercido un efecto beneficioso en la reducción de los intervalos entre partos e incremento significativo en la tasa de pariciones, disminución de la tasa de abortos (Pedroso 2003) y ha contribuido al mejoramiento de la eficacia de los tratamientos de inducción y sincronización de celo (Pedroso et al. 2005). Similares resultados fueron informados por Walter, (2001) y Brem et al. (2002) quienes demostraron que la suplementación de Cu por vía parenteral en zonas con carencias de Cu provocó una mejoría en el comportamiento reproductivo de los rebaños productores de leche. Estos resultados difieren a los informados por Vanegas et al. (2004) quienes no encontraron efecto beneficioso alguno en la tasa de concepción, incidencia de mastitis o retención de placenta en vacas primíparas o multíparas tratadas antes o después del parto con una solución inyectable que contenía minerales traza. Esta discrepancia probablemente se deba en estos estudios a que las hembras bovinas utilizadas se hallaban bajo sistema intensivo de producción cuyo consumo de microelementos en la dieta era capaz de satisfacer los requerimientos y no se conocía previamente el estado de deficiencia o toxicidad de los minerales incorporados en el tratamiento de suplementación por vía subcutánea. En las condiciones de producción de Cuba después de múltiples estudios donde se caracterizaron las principales zonas y rebaños carenciales en cobre (González et al. 1988, Fajardo 2001), se efectuaron diversos experimentos para demostrar el efecto beneficioso de la suplementación corregida de este microelemento en la fertilidad del ganado. En este sentido, González et al. (1988) expusieron los resultados de un estudio realizado en hatos de vacas Santa Gertrudis afectados por esta deficiencia relacionada al consumo de aguas salobres. Según los resultados obtenidos, la suplementación produjo un incremento significativo en la tasa de pariciones y se redujo la tasa de abortos (Tabla 7). Tabla 7. Efecto de la suplementación mineral con mezcla mineral enriquecida en cobre en el comportamiento reproductivo de hembras Santa Gertrudis que cosumieron aguas salobres (González et al. 1988) Índices ME MC Período de servicio (días) 91 b 123ª Gestación (%) 90ª 88.7 b Natalidad (%) 96.8 b 85.0 b Abortos (%) Beneficio económico unitario ( Pesos) Letras diferentes por línea difieren entre sí P<0001, ME= mezcla experimental con un 0.35 % de óxido de cobre. MC= mezcla control con % óxido de cobre 112

13 En un experimento realizado en una zona de la región central de Cuba en un rebaño de vacas Holstein x Cebú diagnosticadas con hipocupremia leve fueron suplementadas más tarde con una mezcla mineral completa a voluntad con diferentes concentraciones de cobre. Como fuente de este microelemento se empleó el óxido cúprico (Pedroso 2003). Acorde con los resultados obtenidos, se logró reducir la tasa de abortos y se incrementó la tasa de preñez significativamente (Tabla 8). Los niveles de acumulación de Cu hepático posterior al tratamiento de suplementación fueron de 365, 240 y 55 ppm en los grupos tratados (T-I y TII) y control, respectivamente. Tabla 8. Efecto de la suplementación mineral con diferentes niveles de cobre en la tasa de preñez y aborto de vacas lecheras mestizas H x C en la región central de Cuba (Pedroso 2003) Índices TI TII TIII Beneficio económico unitario( pesos) Número de animales Tasa de preñez 77ª 74ª 69 b 551 Tasa de abortos 2ª 2ª 7 b 514 Niveles Cu hepático al inicio del experimento de ± 10 ppm.ti= 3499 (ppm); TII=1749 (ppm); TIII=350 (ppm) Se utilizo como fuente de cobre el oxido cúprico con un 80% del elemento (Cu) en dietas a base de forraje, melaza /urea Las deficiencias de Cu ocurren cuando la dieta contiene menos Cu que el requerido o cuando la absorción y utilización en la dieta es inhibida por otros minerales. Mientras que los requerimientos de Cu son específicos de especie y pueden verse afectados por la raza (Mullis et al. 2003). Basado en estos datos experimentales es posible inferir que la suplementación por vía parenteral sea más efectiva que la oral. Así, Walter (2001) demostró que los tratamientos con cobre parenteral en zonas caracterizadas con carencia provocaron una mejoría en el comportamiento reproductivo del rodeo lechero. Más tarde, Pedroso et al. (2005) evaluaron el impacto de la suplementación de cobre 50 mg por vía-parenteral, en hembras bovinas anéstricas sometidas a tratamiento hormonal de inducción de celo, En este estudio fueron tratadas 4747 hembras bovinas mestizas Holstein x Cebú no lactantes en estado de anestro, hipocuprémicas y alimentadas a base de pastos. Según los resultados obtenidos fue evidente, que la suplementación de cobre por la vía subcutánea contribuye a mejorar la fertilidad en hembras anéstricas con o sin terapéutica hormonal en áreas deficientes durante el período de menor disponibilidad de los pastos. Ello confirma el efecto positivo de usar la suplementación de cobre por vía parenteral, con el fin de mejorar la fertilidad y eficiencia del tratamiento de inducción y sincronización del celo (Tabla 9). Tabla 9. Efecto de la suplementación con cobre (vía parenteral) en la eficiencia de la terapéutica hormonal mediante el tratamiento combinado de P4 + BE2 aplicado en hembras bovinas mestizas H x C anéstricas durante el período de menor disponibilidad de los pastos en áreas deficientes en cobre (Pedroso et al. 2005) Inseminada Concepción Preñez Tratamientos N N % % % A ª 19.0a 18.5a B a 24.5bc 23.5bc C b 44.6c 37.2 c Letras diferentes por columnas difieren entre sí P< Grupo A : Placebo 2 ml vía subcutánea 10 días previo tratamiento hormonal seguido de progesterona (P4) más benzoato de estradiol (BE2) consistente en tres inyecciones de progesterona (P4) a intervalo de 48 h en dosis de 100, 50 y 50 mg de progesterona oleosa vía intramuscular respectivamente., seguida de 1mg de benzoato de estradiol (BE2) vía intramuscular 48h más tarde. Grupo B: Tratadas administrado SO 4 Cu 50 mg inyectable por vía subcutánea + Terapéutica hormonal similar al Grupo A Grupo C: Tratadas administrando SO 4 Cu 50 mg inyectable vía subcutánea sin tratamiento hormonal. 113

14 En investigaciones previas Brem et al. (2002) comprobaron, que el tratamiento de cobre por vía parenteral en dosis de 50 a 100 mg en hembras bovinas hipocuprémicas es capaz de incrementar la cupremia y las reservas hepáticas así como mejorar el desenvolvimiento reproductivo de animales cíclicos y anéstricos alimentados con pasturas. Sin embargo, Vanegas et al. (2004) no encontraron efecto beneficioso alguno en la tasa de concepción, incidencia de mastitis o retención de placenta en vacas primíparas o multíparas tratadas antes o después del parto con una solución inyectable que contenía minerales traza (Multimisim, Animali Stllenbrose Republic South Africa). Aunque, estos experimentos fueron desarrollados en hembras bovinas bajo sistema intensivo de producción cuyo consumo de microelementos en la dieta era capaz de satisfacer los requerimientos y no se conocía previamente el estado de deficiencia o toxicidad de los minerales incorporados en el tratamiento de suplementación por vía subcutánea. Este hecho sugiere que no existe una receta única mediante la cual el tratamiento pueda resolver las múltiples situaciones que se presentan en las condiciones prácticas. Si bien, hasta el presente este procedimiento de suplementación ha demostrado su eficacia en bovinos en pastoreo. Estos datos sugieren que para probar la hipótesis de que el tratamiento parenteral con Cu puede ser más eficaz que otros métodos de suplementación, es necesario conocer con exactitud la dosis capaz de satisfacer los requerimientos del animal durante el ciclo reproductivo en las condiciones de producción de climas tropical y los genotipos que allí se explotan. En este sentido, los estudios efectuados por (Garcia et al. 2007) proporcionaron una contribución importante en la solución de esta problemática. Este investigador realizó un experimento con el fin de determinar la dosis parenteral de Cu que restablezca las concentraciones séricas y hepáticas en animales hipocuprémicos sin provocar efectos tóxicos en hígado ni residuales en la leche de vacas lecheras mestizas Holstein x Cebú criadas en condiciones de pastoreo. En este ensayo se demostró, que las dosis de 50 y 100 mg de Cu en una solución de (SO 4 Cu- Glicerol-EDTA) por vía subcutánea son eficaces para restaurar las concentraciones de Cu sérico y las reservas hepáticas por 60 días, sin provocar alteraciones de la funcionalidad hepática ni residuos en la leche. En posteriores estudios confirmó, que el tratamiento incrementó los porcentajes de presentación de celo y gestación en vacas lecheras tratadas con dosis del 50 mg (Tabla10). Tabla 10. Efecto del tratamiento parenteral de cobre en la tasa de presentación de celo y preñez de novillas vacas mestizas Holstein x Cebú cíclicos en pastoreo (García et al. 2007) Indicadores Tratadas Controles Significación Número de animales Cobre sérico µmol/l P< Porcentaje de presentación de celo P< 0.01 Porcentaje de preñez P< Es evidente que este método de suplementación puede contribuir a mejorar el desenvolvimiento reproductivo de los bovinos en el trópico, aunque, es insuficiente los estudios en los cuales se determine su eficacia para mejorar la eficiencia en la aplicación de las nuevas biotecnologías de la reproducción. En ese contexto, las investigaciones en esta dirección tienen una gran importancia. Estos hechos muestran, que no existe una receta única mediante la cual el tratamiento pueda resolver las múltiples situaciones que se 114 presenta en las condiciones prácticas. Estos datos apuntan que para probar la hipótesis de que el tratamiento parenteral con Cu puede ser más eficaz que otros métodos de suplementación, es necesario conocer con exactitud la dosis capaz de satisfacer los requerimientos del animal durante el ciclo reproductivo en las condiciones de producción de climas tropical y los genotipos que allí se explotan y aunque es evidente que la suplementación de Cu en hatos donde persiste esta deficiencia puede contribuir a mejorar el desenvolvimiento reproductivo, aún son

15 insuficientes los estudios en los cuales se determine su eficacia para optimizar la eficiencia en la aplicación de las nuevas biotecnologías de la reproducción. En ese contexto, las investigaciones con este enfoque tienen gran importancia. CONCLUSIONES La carencia de cobre constituye aún en Cuba uno de los principales problemas de la nutrición mineral de los bovinos alimentados a base de pasturas. El diagnóstico de rutina deberá basarse en el valor predictivo de la cupremia en los estudios poblacionales para facilitar la implementación de los programas profilácticos. Las mediciones de Cu hepáticos y la actividad de las enzimas Cu dependientes pueden utilizarse en los ensayos experimentales donde se requiere conocer el estado de las reservas y de la respuesta productiva y reproductiva posterior a la suplementación con este microelemento. Son variados los métodos y fuentes de cobre disponibles para la suplementación del ganado, lo que permite contar con la herramienta fundamental para prevenir y corregir las deficiencias y toxicidades que se presentan a menudo en el ganado criado en pastoreo. Las investigaciones encaminadas a conocer el mecanismo fisiopatológico mediante el cual las deficiencias de cobre afectan la reproducción muestran notables avances, pero aún no está plenamente aclarado. El esquema de los posibles mecanismos de acción en esta carencia nutrimental muestra que se asocia a múltiples manifestaciones de infertilidad y puede afectar directamente la eficacia de la aplicación de las nuevas biotecnologías de la reproducción, como lo demuestran los resultados experimentales en el laboratorio. Ante la situación planteada siendo la deficiencia de Cu una de las más importantes en el trópico, sería útil profundizar en su mecanismo de acción antes y después de la suplementación en animales afectados de hipocuprosis y evaluar los cambios moleculares y celulares que ocurren en los cultivos de embriones in vitro y los endocrinos de hembras donadoras y receptoras de embriones, con el fin de mejorar la eficiencia en la aplicación de las nuevas biotecnologías de la reproducción. 115 REFERENCIAS Ahola, J.K, Engle, T.E., Burns, P.D. Effect of copper status supplementation and source on pituitary responsiveness to exogenous gonadotropin-releasing hormone in ovariectomized beef cows. J. Anim Sci. 83:1812, Alonso, Marta, Crespo, L.A., Miranda, Marta, Castillo, Cristina, Hernández, J., Benedito, J.L. Assessment of some blood parameters as potential markers of hepatic copper accumulation in cattle. J. Vet. Diag. Invest.18:71, 2006 Álvarez, J.L. Nutrición y fertilidad. II Encuentro sobre Reproducción Animal. [CD-ROM] En: Memorias del VI Congreso internacional de Ciencias Veterinarias, La Habana, de abril de Aparicio, R., Torres, R., Astudillo, L., Cordova, L., Carrasquel, J. Supplementación parenteral con cobre sobre el peso de becerros en crecimiento. Zootecnia Trop 13:14-16, Arthington, J. D. Effect of copper oxide bolus administration on high-level copper supplementation on forage utilization and copper status in beef cattle. J. Anim. Sci. 83:2894, Arthington, J.D., Pate, F.M. Effect of cornversus molasses- based supplements on trace mineral absorption in beef heifers. J. Anim. Sci. 80:2787, Arthington, J.D., Spears, J.W. Effects of tribasic copper chloride versus copper sulphate provided in corn- and molasses-based supplement on forage intake and copper status of beef heifers. J. Anim. Sci. 85:871, Ávila, G.J., Bouda, J., Quiroz R.G.F., Yabuta, O.A. Impacto de deficiencias minerales sobre la reproducción de vacas lecheras. En: Memorias del XXI Congreso Nacional de Buiatria, julio 9-12, Colima. Colima. México (DF): Asociación Mexicana de Médicos Veterinarios Especialistas en Bovinos, AC P Bach, A. La reproducción del vacuno lechero: nutrición y fisiología. [en línea]. En: XVII Curso de Especialización. Avances en nutrición y alimentación animal. FEDNA. Purina, España, Disponible en:

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