3.1. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA A PLAGAS Y ENFERMEDADES

Transcripción

1 3. Aplicaciones

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3 3.1. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA A PLAGAS Y ENFERMEDADES Las plantas, como otros seres vivos, se encuentran sometidas a condiciones ambientales cambiantes, en muchas ocasiones a condiciones desfavorables, ante las cuales deben adaptarse para sobrevivir. Son muchos los organismos potencialmen-te perjudiciales para la planta, desde agentes infecciosos (virus, viroides, bacterias, hongos), hasta organismos consumidores de vegetales (insectos, nematodos). En la figura 1, se ilustran las grandes diferencias que se observan al comparar el tamaño de posibles organismos patógenos para las plantas con el tamaño de una célula vegetal. Cualquiera de estos organismos es capaz de interferir de una u otra manera en los procesos normales del desarrollo, crecimiento o reproducción de una planta. En la naturaleza, sin embargo, la situación más frecuente es aquella en la que una planta no es el huésped natural de un organismo potencialmente patógeno, con lo cual no se produce ningún efecto perjudicial en la planta. Por el contrario, cuando una planta es huésped natural, se establece una interacción entre ambas partes, planta y patógeno, que puede concluir bien en el desarrollo de una enfermedad (interacción planta-patógeno de tipo compatible), bien en una resistencia frente al patógeno agresor (interacción planta-patógeno de tipo incompatible). Las enfermedades causadas por patógenos y plagas son la causa más importante de pérdidas en las cosechas, pudiendo representar hasta el 30-40% de las pérdidas en todo el mundo, y si a esto se añaden las pérdidas que se producen en periodos postcosecha, el porcentaje asciende al 60-70%. No hay que olvidar que existe una limitación en la superficie cultivable de la tierra, por no decir una reducción progresiva de la misma a causa de la erosión del suelo, acumulación de productos tóxicos, etc. Por otra parte, la población mundial sigue en continuo crecimiento. Ello hace que sea imprescindible la utilización de nuevas variedades de especies vegetales, sobre todo en aquellas especies destinadas a la alimentación, variedades que resulten más productivas, mejor adaptadas al entorno, o más resistentes al ataque de patógenos y plagas. * Blanca San Segundo. Departamento de Genética Molecular. Instituto de Biología Molecular de Barcelona. Centro de Investigación y Desarrollo (CID). Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Barcelona.

4 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA Evidentemente, el control de enfermedades en plantas puede y debe abordarse contemplando diferentes estrategias, el éxito o fracaso de cada una de ellas dependerá del problema concreto frente al que nos enfrentemos. Históricamente, la solución al problema de las enfermedades y las plagas se ha abordado con diferentes estrategias. En muchos casos la utilización de las técnicas tradicionales de entrecruzamiento de especies para la obtención de variedades resistentes ha resultado útil para la mejora genética de especies concretas. Hasta finales el siglo XIX, los agricultores dependían exclusivamente de prácticas de cultivo organizadas, esto es, de la alternancia de cultivos. El tratamiento con agentes químicos se inicia en la década de 1870 con la utilización de insecticidas (compuestos Figura 1. Diagrama ilustrativo de los posibles patógenos de plantas y su relación con el tamaño de una célula vegetal. Tomado de Plant Pathology (1988).

5 APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA derivados del cobre y arsénico). Un hito importante fue la aparición del DTT (diclorodifeniltricloroetano), momento a partir del cual las compañías químicas rápidamente expandieron sus áreas de investigación hacia el desarrollo de pes-ticidas sintéticos. Estos agentes fueron extensamente utilizados en el periodo de 1940 a Fue entonces cuando surgió la crisis de los pesticidas, como consecuencia directa del uso indiscriminado de estos agentes, los cuales estaban siendo responsables de la aparición de resistencias en los organismos que se pretendían combatir, de la destrucción de poblaciones naturales beneficiosas, y de la deterioración progresiva del medio ambiente, además del impacto negativo que se observaba en la alimentación humana. Una nueva solución surgió, esta vez por parte de la comunidad de entomólogos, con el uso de programas integrados para el control de plagas (IPM, «Integrated Pest Management»). De esta manera, las plagas que afectan a los cultivos pueden ser combatidas mediante el empleo de enemigos naturales, es decir, mediante el empleo de organismos que son depredadores naturales del organismo perjudicial (lucha biológica o control biológico de plagas). En la actualidad, son muchos los programas que se han desarrollado para el control de plagas y enfermedades. Por citar un ejemplo, mencionar el importante papel que los ácaros fitoseidos desempeñan en el control biológico de las poblaciones de ácaros fitófagos en cultivos de vid y frutales. En el caso del control de enfermedades producidas por hongos, probablemente el ejemplo que mejor ilustra esta estrategia es el empleo de cepas del hongo Trichoderma para combatir hongos fitopatógenos. No obstante, el diseño de programas para el control integrado de plagas es lento en cuanto a su desarrollo y además resulta de difícil implantación en la comunidad de agricultores. Para un agricultor resulta más complejo introducir un programa diseñado para el control biológico de una plaga concreta que, por ejemplo, seguir un calendario predeterminado de tratamientos químicos. Fue a mediados de la década de los 90 cuando los avances de la biología molecular se vieron reflejados en la agricultura. En la actualidad, la Biotecnología Vegetal, integrada de una manera adecuada con los sistemas de mejora genética tradicionales, representa una herramienta de gran utilidad para la obtención de variedades resistentes al ataque por patógenos o plagas. Una de las mayores ventajas de la Biotecnología Vegetal es que permite diseñar múltiples estrategias para la mejora genética de plantas, estrategias que además pueden ser aplicadas a muy diferentes especies cultivables. Sin embargo, para llegar a este punto, esto es a la posibilidad de obtener plantas transgénicas resistentes a enfermedades, ha sido necesario recorrer un largo camino en el estudio de los procesos naturales por los cuales una planta se protege frente a organismos perjudiciales. En otras palabras, el esclarecimiento de los mecanismos moleculares asociados a la respuesta natural de defensa de las plantas y de los compuestos y proteínas que participan en este proceso, ha sido la clave del éxito de la moderna biotecnología aplicada a la mejora genética de las plantas.

6 82 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA Mecanismos de defensa en plantas Las plantas presentan diferentes tipos de defensas. Entre ellas se encuentran las defensas «pasivas», que consisten en acumular en sus tejidos compuestos que pueden resultar tóxicos para microorganismos o fitófagos. Así, en muchos órganos (frutos, hojas, tubérculos) se acumulan compuestos fenólicos y taninos en elevadas concentraciones, compuestos que poseen propiedades antifúngicas frente a fitopatógenos {Botrytis, Phytophthora, Fusarium). Las saponinas son un ejemplo de metabolitos con propiedades antifúngicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. No está claro, sin embargo, que una planta sea resistente a un patógeno concreto por el mero hecho de acumular este tipo de compuestos. En la mayoría de los casos, sin embargo, se produce una respuesta de defensa «activa» por parte de la planta, respuesta que está asociada a importantes cambios en la expresión génica.todo ello conduce a la puesta en marcha de una serie de procesos bioquímicos, que constituyen lo que se ha definido como resistencia inducida. En algunas interacciones planta-microorganismo se observa una resistencia que viene determinada genéticamente, basada en el modelo gen-a-gen descrito por Flor ya en Estas resistencias presentan una alta especificidad en lo que hace referencia a los genotipos de ambas partes (cultivar en la planta huésped y raza del patógeno), ya que dependen de la interacción entre el producto de un gen de resistencia en la planta (gen R) con el producto de un gen de avirulencia complementario (gen avr) en el patógeno. En 1984 se clonó el primer gen de avirulencia de un patógeno (Pseudomonas syringae pv glycinea race 6), lo cual representó la primera evidencia molecular que corroboraba el modelo gen-a-gen. Hubo que esperar casi diez años, hasta que se identifico el primer gen de resistencia, el gen Pío de tomate, que codifica para una quinasa serina/treonina. Desde entonces, se han identificado numerosos genes de resistencia, tanto en mono-cotiledóneas como en dicotiledóneas, cuyos productos génicos correspondientes presentan una serie de características estructurales en común: repeticiones ricas en leucina, cremalleras de leucina, dominios de unión a nucleótidos, dominios transmembrana, dominios quinasa. La existencia de estos dominios estructurales, que se sabe participan en interacciones proteína-proteína, apunta a una función de los productos de los genes de resistencia como intermediarios en la serie de reacciones en cascada, muy probablemente dentro de la ruta de señalización para la activación de genes que participan en la respuesta general de defensa de la planta. Resulta particularmente interesante el hecho de que, además de la conservación que se observa entre los diferentes genes de resistencia vegetales descritos hasta la fecha, existe un subgrupo de genes de resistencia vegetales que presentan una gran similitud con dos proteínas animales, la proteína Toll de Dro-sophila y el receptor de interleukina-1, proteínas que están implicadas en el proceso de immunidad innata de insectos y mamíferos, respectivamente. Ello apunta a que plantas y animales pueden haber desarrollado mecanismos similares para

7 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA defenderse de patógenos. Desde un punto de vista práctico, la elevada especificidad que presentan las resistencias basadas en el modelo gen-a-gen, hace que en muchos casos no se disponga de variedades comerciales resistentes a cepas de patógenos establecidos localmente. Sin embargo, la disponibilidad de genes de resistencia tiene una clara aplicación para la mejora de las propiedades de resistencia en plantas transgénicas. Por citar un ejemplo, la introducción del gen de resistencia N de tabaco (el gen N que confiere resistencia al virus TMV en tabaco) en plantas de tomate ha permitido obtener líneas de tomate resistentes a TMV. Otro éxito de la biología molecular ha sido la aplicación de las técnicas de marcadores moleculares ligados a genes de resistencia para la identificación y selección temprana de genotipos en programas de mejora vegetal. La situación más frecuente en la naturaleza es aquella en la cual la planta manifiesta resistencia frente a un patógeno o a un fitófago (insectos o nemato-dos) en función de la activación de mecanismos generales de defensa, o resistencia inducida. Este es un proceso complejo y a su vez altamente coordinado que está asociado a importantes alteraciones de la expresión génica en la planta huésped. En definitiva, se basa en la inducción de la expresión de genes de defensa, proceso que se desencadena como consecuencia directa del ataque por patógenos o predadores. En estas situaciones, no se trata de resistencias condicionadas genéticamente, y por tanto no presentan especificidad en cuanto a los genotipos del huésped y del patógeno. Es importante por tanto diferenciar un gen de resistencia de un gen de defensa vegetal Resistencia inducida frente a patógenos y fitófagos Durante varias décadas, entomólogos y fitopatólogos han investigado de manera independiente las respuestas de las plantas bien frente a fitófagos bien frente a patógenos. A medida que se van conociendo los mecanismos moleculares por los cuales las plantas se protegen frente a estos organismos, resulta cada vez más claro que se trata de procesos relacionados entre si. La resistencia inducida en plantas presenta una serie de características generales. Un primer aspecto a considerar, es que en el proceso de resistencia inducida participan múltiples mecanismos y vías metabólicas, todo ello integrado de una manera sumamente coordinada. Un segundo aspecto, es la falta de especificidad que se observa tanto en cuanto a los agentes inductores como a los organismos que resultan afectados por la respuesta de la planta. Como se verá a lo largo de este capítulo, esta idiosincrasia en la respuesta defensiva de las plantas es lo que en cierto modo permite modificar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos y plagas mediante transformación genética. Se desarrollan a continuación con más detalle cada uno de estos aspectos. 1. La resistencia inducida en plantas viene determinada por diferentes vías y mecanismos. Frecuentemente, la resistencia frente a determinados pa-

8 84 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA tógenos se manifiesta mediante la respuesta hipersensible. En este caso, las células que se encuentran en la proximidad del foco de infección sufren una muerte controlada, hecho que contribuye a limitar la progresión de la infección del tejido. Hay un aparente paralelismo entre el fenómeno de muerte celular programada que se produce en la respuesta hipersensible con el proceso de apoptosis en el sistema animal. Sin embargo, en muchos sistemas planta-patógeno la resistencia se produce en ausencia de esta respuesta hipersensible. Por otra parte, la resistencia puede ser localizada, esto es, limitada al punto de infección o de ataque por un fitófago; en otros casos, se observa una resistencia sistémica, en zonas de la planta alejadas del punto de infección. Frecuentemente, se observa un efecto de Ímmunización en la planta según el cual una planta que ha estado expuesta y, ha superado una infección, se encuentra protegida frente a infecciones posteriores y no únicamente frente al patógeno inicial sino también frente a otros patógenos. Asimismo, esta protección se manifiesta no sólo en el tejido inicialmente infectado, sino también en puntos distantes de la planta. Este fenómeno es conocido como resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Acquired Resistance»). Por último, mencionar que algunas respuestas defensivas se desencadenan rápidamente, en cuestión de minutos u horas; otras por el contrario, se producen al cabo de varios días después de la inducción. Esta diversidad de fenómenos y respuestas pone de manifiesto que la resistencia frente a patógenos y fitófagos se basa en la expresión de múltiples mecanismos que se integran en un proceso general coordinado de resistencia inducida. Las respuestas de defensa inducidas presentan una sorprendente falta de especificidad, no solo en lo que se refiere a las señales a las que la planta responde, sino también a los efectos que su respuesta produce. Son muchos los organismos capaces de desencadenar una respuesta defensiva en la planta, tales como virus, bacterias, hongos o tratamientos con agentes químicos, además de predadores, insectos y nemátodos. En determinados casos, patógenos y fitófagos pueden activar las mismas respuestas en la planta, mientras que en otros se activan respuestas diferentes. A pesar de esta multiplicidad de respuestas, resulta sorprendente el hecho de que el reconocimiento planta-patógeno sea un proceso altamente específico. Una vez la planta ha activado sus mecanismos de defensa en respuesta a un agente agresor concreto, se da la circunstancia de que estos mecanismos pueden estar dirigidos, y ser efectivos, frente a una gran variedad de organismos. Esta respuesta de defensa de las plantas sólo se explica por la existencia de múltiples vías de señalización que desencadenan múltiples respuestas que pueden ser efectivas frente a un amplio espectro de organismos. Algunos de los componentes individuales que se producen pueden ser específicos mientras que otros pueden no serlo.

9 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA Las plantas sintetizan compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida Las plantas desarrollan diferentes estrategias defensivas que van dirigidas a contrarrestar el paso o penetración del patógeno, o el consumo de las mismas por fitófagos. Una primera línea de defensa frente a patógenos es la creación de barreras físicas, a través del reforzamiento de la pared celular. Por ejemplo, se sabe que el metabolismo de los fenilpropanoides desempeña un papel importante en la respuesta de defensa frente a patógenos (la incorporación de compuestos fenólicos en la pared celular es una de las reacciones de defensa que ocurre más rápidamente). La lignificación, junto con la incorporación de proteínas estructurales en la pared (proteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina), tiene como resultado el reforzamiento de la pared vegetal y por lo tanto tiene un efecto obstaculizador a la penetración del patógeno. La formación de depósitos de callosa en papilas, es una reacción que se observa frecuentemente, tanto en respuesta al ataque por patógenos como en respuesta a herida (efecto que se produce cuando un fitófago se alimenta de la planta). Asimismo, las plantas tienen la capacidad de sintetizar compuestos, metabo-litos o proteínas, que poseen ya un efecto nocivo directo sobre el organismos agresor, esto es, compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida. Desde el punto de vista bioquímico, estos compuestos son de naturaleza muy heterogénea. Las fitoalexinas, compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, son también productos del metabolismo de los fenilpropanoides. Cada especie vegetal produce fitoalexinas características, cuya síntesis depende de la activación transcripcional de los genes que codifican para los diferentes enzimas involucrados en su biosíntesis (fenilalanina.amonio liasa, 4-cumarato:CoA ligasa, etc). Por citar unos ejemplos, la camalexina y la pisatina son fitoalexinas producidas por Arabidopsis y guisante, respectivamente. La síntesis y acumulación de fitoalexinas en los puntos de infección es una respuesta rápida por parte de la planta. En líneas generales, dentro de la respuesta de defensa que conduce hasta la síntesis y acumulación de productos con actividad antimicrobiana o insecticida pueden distinguirse diferentes etapas: I a etapa: Reconocimiento del organismo agresor por parte de la célula vegetal. Una respuesta defensiva eficiente frente a un patógeno es dependiente de la detección rápida de su presencia. Ello se produce a través de la unión de moléculas inductoras a receptores específicos localizados en la membrana de la célula vegetal. Estas moléculas, de naturaleza química muy diversa, pueden tener un origen externo (moléculas provenientes del patógeno), o interno (moléculas derivadas de la pared celular del huésped como consecuencia de la actividad degradadora por parte del patógeno). El resultado de este reconocimiento, es la puesta en marcha de una serie de reacciones en cascada, en la propia membrana plasmática y lúe-

10 86 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA go en el citoplasma, que culminan en el núcleo de la célula vegetal con la inducción de la expresión de genes de defensa (Fig. 2). Las primeras reacciones que se observan son alteraciones en el flujo de iones a través de la membrana (entrada de H + y Ca 2+, salida de K + y Cl~), y producción de moléculas reactivas de oxígeno (por la acción del complejo de oxidasas dependientes de NADPH, y peroxidasas). Más recientemente, se ha podido comprobar como el óxido nítrico, un poderoso activador de la respuesta inmune animal, tiene una función importante en la respuesta defensiva de las plantas frente a patógenos. Estas moléculas (especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico), no sólo pueden tener un efecto tóxico directo sobre el patógeno, sino que además pueden actuar como moléculas señalizadoras para la activación de mecanismos de defensa (respuesta hipersensible, activación de la expresión de genes de defensa). 2 a etapa: Transmisión de la señal hasta el núcleo de la célula vegetal. El proceso que se desencadena con el reconocimiento del organismo agre sor al nivel de la membrana citoplasmática, hasta la activación transcripcional de genes de defensa, tiene todavía muchos puntos oscuros. Se sabe que participan procesos de fosforilación y defosforilación de pro teínas, procesos que son dependientes de los niveles de Ca ++ citoplasmático (Fig. 2). Por otra parte, se han identificado factores de transcrip ción que participan en la regulación de la expresión de genes de defensa concretos. La acumulación de los transcritos correspondientes a genes de defensa se detecta ya desde los minutos hasta las primeras horas, en el caso de aquellos genes cuya expresión se activa localmente en torno al lugar de infección o del ataque por un fitófago. En el caso de genes que se expresan sistémicamente, la acumulación de los transcritos de ge nes de defensa se observa desde las primeras horas hasta varios días más tarde. Quedan, sin embargo, muchos aspectos por aclarar para poder co nocer como se integran todos estos procesos dentro de la célula vegetal. 3 a etapa: Acumulación de compuestos capaces de contrarrestar la pene tración de un patógeno o el consumo por fitófagos. Además de los com puestos anteriormente mencionados, tales como las fitoalexinas, las plan tas sintetizan y acumulan una serie de proteínas que de una manera genérica se han denominado proteínas asociadas a la patogénesis, o pro teínas PR (Pathogenesis-Related). Las proteínas PR son proteínas de la planta huésped cuya expresión se induce en situaciones de patogénesis, o en situaciones relacionadas. Las situaciones de patogénesis incluyen la infección por diferentes tipos de patógenos, virus, viroides, bacterias y hongos. Por situaciones relacionadas se entiende la herida (efecto aso ciado al ataque por predadores) y el tratamiento con agentes químicos u otros agentes inductores. El sistema mejor caracterizado en cuanto a la expresión de proteínas PR es el de la interacción de tabaco con el virus

11 APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA Pcroxinlh'ico -.. Rcsistencia Sistemica Adquirida ( mediada por Acido Salicilico ) r Oxido Nitrico Membrana plasmatica Acido IInoleico Figura 2. Componentes principales de La cadena que se inicia con el reconocimiento del pat6geno par receptores especfficos de la membrana plasmatica y conduce hasta La activaci6n de La expresi6n de genes de defensa en el nucleo de la celula vegetal. Adaptado a partir de Somssich y Hahlbrock (1998). TMV (TMV, «Tobacco Mosaic Virus»). La informacion recogida en el campo de las protefnas PR en muy diferentes sistemas de interaccion planta/patogeno ha permitido agrupar estas protein as en familias independientes, atendiendo a sus secuencias nucleotidicas 0 proteicas, relaciones serologicas 0 a su funcion (Tabla 1). Se ha demostrado la actividad antifungica, tanto in vitro como in vivo (plantas transgenicas), para varias protein as PRo Este serfa el caso de las quitinasas, ~-1,3-glucanasas, defensinas, tioninas y proteinas transportadoras de Ifpidos. Dentro de las proteinas PR, se ha incluido una familia de proteinas, los inhibidores de proteinasas (PR 6), cuya funcion esta directamente relacionada con la proteccion frente al ataque por predadores (insectos, nematodos). 4 a etapa: Transmision de la sefial para la activacion de la respuesta de defensa en la planta entera. Las plantas activan sus defensas no solo en el punto concreto en el cual se produce la infeccion 0 el ataque por el fitofago (respuesta local), sino tambien en puntos distantes de la planta (respuesta sistemica). Se han descrito diferentes moleculas que, de una manera u otra, estan implicadas en la activacion de los mecanismos de defensa a escala sistemica. Asi por ejempl0, se sabe que el acido salicflico estimula la respuesta local de defensa de la planta, siendo ademas necesario que se acumule en niveles importantes en los tejidos de la planta para que se

12 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA manifieste la respuesta sistémica adquirida. La posible función de la vía mediada por el ácido salicílico frente a fitófagos es un aspecto más desconocido. Aunque el ácido salicílico es necesario para que se manifieste la respuesta sistémica adquirida, se piensa que no es la molécula señalizadora que se mueve a través de la planta. Algunas rizobacterias no patogénicas activan una respuesta diferente, no mediada por ácido salicílico, y que también protege a la planta frente a virus, bacterias y hongos patogénicos. La particularidad de este mecanismo es que no va asociado a la reacción hipersensible ni a la producción de proteínas PR. Esta respuesta ha sido definida como resistencia sistémica inducida (ISR, «Induced Systemic Resistance») para diferenciarla del fenómeno de resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Adquired Resistance»). Otra vía de señalización de la respuesta de defensa a escala sistémica es- TABLA 1 Familia de proteínas PR («Pathogenesis-Related») Familia Representante Propiedades/actividad PR-1 PR-la de tabaco Desconocida PR-2 PR-2 de tabaco (3-1,3-glucanasa PR-3 Proteína P, Q de tabaco Quitinasa tipo I, II, IV, V, Vi y VII PR-4 Proteína R de tabaco Quitinasa I y II PR-5 Proteína S de tabaco Tipo taumatina PR-6 Inhibidor I de tomate Inhibidor de proteinasas PR-7 Proteína P 69 de tomate Endoproteinasas PR-8 Quitinasa de pepino Quitinasa tipo III PR-9 Peroxidasa de tabaco Peroxidasa PR-10 Proteína PR1 de perejil Tipo ribonucleasa PR-11 Quitinasa clase V de tabaco Quitinasa tipo I PR-12 Proteína Rs-AFP3 de rábano Defensina PR-13 Proteína THI2.1 de Arabidopsis Tionina PR-14 Proteína LTP4 de cebada Proteína transportadora de lípidos Tomado de von Loon y col. (1999).

13 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA ta mediada por el etileno. Así, en respuesta a infección o herida se observa una producción importante de etileno en la planta, seguido de un incremento de una serie de compuestos de defensa (lignina, proteínas PR, etc.). El ácido jasmónico. un regulador del crecimiento vegetal, también interviene en la respuesta de defensa de la planta frente a fitófagos y microorganismos. La sistemina. una hormona polipeptídica vegetal, y no el ácido jasmónico, es la molécula señalizadora que se transporta a través de la planta, activando la producción de jasmonatos. Por último, el ácido abscísico. otra fitohormona reguladora de diferentes procesos fisiológicos de la planta implicada en estrés abiótico (p.e. sequía), también participa en la respuesta de defensa de las plantas frente a herida, probablemente en una etapa anterior a la vía del ácido jasmónico. Dependiendo de la especie vegetal, se observan diferencias en cuanto a la participación de cada una de las posibles rutas de señalización indicadas. En definitiva, frente al ataque por patógenos y fitófagos se produce un reajuste importante en los procesos fisiológicos de una planta en el que participan múltiples vías de señalización mediadas por hormonas. Estas mismas hormonas, realizan funciones reguladoras de los procesos fisiológicos propios del desarrollo de la planta. Por lo tanto, estas hormonas adquieren nuevas funciones con el fin de proporcionar a la planta una defensa rápida y efectiva.un hecho comprobado es que las diferentes rutas de señalización interaccionan entre ellas, interacciones que pueden tener un efecto de sinergismo o de antagonismo. Por ejemplo, en tabaco se observa un efecto sinérgico entre etileno y metiljasmona-to en cuanto a la indución de genes PR. Por otra parte, se ha descrito que el ácido salicílico inhibe la ruta del ácido jasmónico y la acumulación de inhibidores de proteinasas. La existencia de esta multiplicidad de vías de señalización y de conexiones entre las mismas explicaría los efectos de resistencia cruzada que se observan frente a diferentes organismos, patógenos o fitófagos Respuesta de defensa frente a insectos La respuesta que las plantas desarrollan frente al ataque por insectos es una respuesta altamente sofisticada. Por una parte, se produce una respuesta directa según la cual la planta sintetiza y acumula en sus tejidos proteínas con actividad «insecticida». Este es el caso de los genes para inhibidores de proteinasas. Estos inhibidores de proteinasas se acumulan de modo natural en órganos de reserva (tubérculo de patata) y en semillas, pero además su expresión se induce en hojas como respuesta a herida (ataque por insectos). La función defensiva de estas proteínas reside en su capacidad para inhibir actividades proteoliticas de origen animal o microbiano, pero no de proteinasas vegetales. Así, éstos inhibidores de proteinasas inhiben las actividades proteoliticas digestivas de las larvas de insectos, cuando éstas se alimentan de la plan-

14 90 BIOTECNOLOGÍA APLICADA ALA AGRICULTURA ta, disminuyendo de esta manera la calidad nutricional del material del que se alimentan. Ello, además de producir un efecto disuasorio tal que el insecto deja de alimentarse, en muchos casos conduce a retrasos importantes en el crecimiento e incluso a la muerte del insecto. La inducción de la expresión de los genes de inhibidores de proteinasas se observa tanto a escala local como sistémica. De hecho, este ha sido el modelo más exhaustivamente estudiado en relación con las moléculas señalizadoras implicadas en la respuesta sistémica frente a herida en plantas (ácido abscísico, ácido jasmónico y sistemina). Estos estudios se han realizado fundamentalmente en solanáceas (patata, tomate). Resulta interesante el hecho de que la ruta biosintética que conduce hasta la síntesis del ácido jasmónico en plantas (ruta de los octadecanoides) es similar a la ruta de biosíntesis de prostaglandinas y leucotrinas en animales. De nuevo nos encontramos ante un paralelismo entre animales y plantas. Pero además, las plantas se protegen frente a insectos por una vía indirecta, que consiste en la emisión de compuestos volátiles capaces de atraer a depredadores o parásitos que son enemigos naturales del fitófago que se encuentra atacando a la planta (Fig. 3). Además, la emisión de estos compuestos al entorno es capaz de activar las respuestas de defensa en las plantas vecinas. Más concretamente, se ha podido comprobar que en la saliva de determinados fitófagos se encuentran compuestos, p.e. la volicitina de las larvas de la polilla Spodoptera exigua, que son capaces de inducir la emisión de compuestos volátiles atrayentes de avispas depredadoras cuando las larvas se alimentan de plantas de maíz. De todo ello se desprende el hecho de que una planta es capaz de discriminar entre una herida mecánica y el mordisco de un fitófago. Si bien los mecanismos por los cuales la planta regula la síntesis de estos compuestos volátiles no son del todo conocidos, se piensa que la vía de los octadecanoides, vía que la planta utiliza para regular la expresión de los inhibidores de proteinasas, también está implicada en este proceso de liberación de compuestos volátiles al medio ambiente Aplicaciones de la resistencia inducida en agricultura Una práctica común en medicina preventiva es la vacunación o inmunización de pacientes por inoculación con cepas atenuadas de patógenos. Técnicas de «inmunización» han sido aplicadas para la protección de especies vegetales frente a enfermedades, si bien, ésta no es una práctica generalizada. En esta dirección, existe la posibilidad de inducir una resistencia de manera artificial en plantas mediante la aplicación de agentes químicos capaces de actuar como inductores de la respuesta defensiva. La actividad de estos agentes inductores, no es una actividad an-tibiótica propiamente dicha, ni tampoco se debe a una modificación de los mismos hasta compuestos con actividad antimicrobiana. Por el contrario, estos agentes tienen la propiedad de producir un efecto de «vacunación» a través de la inducción de la expresión de los mecanismos naturales de defensa de la planta. De esta manera, la planta se hace más resistente frente a posteriores infecciones por pa-

15 APLICACIONES BIOTECNOL6GlCAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA t6genos. Como ejemplo, cabe citar compuestos como el BTH y eiina, inductores de la respuesta mediada por acido salicflico, capaces de desencadenar respuestas simi lares a la que se observan en respuesta a infecci6n por pat6genos. Eslas moleculas son ademas inductoras de la resistencia sistemica adquirida y producen un efecto protector frente a un amplio espectro de pat6genos. La utilizaci6n de elicitores qufmicos frente a fit6fagos se encuentra en una fase menos Com puestos vohi tiles f-m,rae Avispas deprcdadoras ' -Je' M',:'". M Hedda.., Ruta oaadecanoi(lesnh~'(fo'jasm6ilico Figura 3. Respuesta de defensa de las plantas frente al ataque por fit6fagos. En respuesla a l ataque por insectos fit6fagos y a la herida se induce la expresi6n de genes que codifican para inhibidores de proleinasas. Estos inhibidores lienen efectos nocivos en el proceso digestivo del insecto. causando el retraso en el crecimiento e incluso la muerte deimismo. Ademas la planta que est a siendo atacada e mile una serie de compuestos volatiles que atrae a avis pas, que son enemigos naturales del fit6fago que se esta alime ntando de la planta. Adaptado a partir de Pare y Tumlinson (1999).

16 92 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA desarrollada. Recientemente, se ha comprobado como la aplicación exógena de ácido jasmónico induce resistencia frente a fitófagos en plantas de tomate. La «vacunación» de una planta con organismos vivos (agentes de control biológico) tiene la ventaja de que proporciona todas las señales ante las cuales la planta reacciona. Sin embargo, la situación más frecuente es que la aplicación de organismos vivos puede resultar de difícil control. De ahí el interés que tiene el desarrollo de métodos de inmunización basados en la utilización de compuestos inductores de la respuesta defensiva en lugar de organismos vivos. A medida que se vaya ampliando nuestro conocimiento acerca de las rutas implicadas en la activación de las respuestas defensivas de las plantas, sin duda se ampliarán las posibilidades para la utilización de inductores químicos en la protección frente a patógenos y/o fitófagos. En último término, la aceptación de agentes químicos como inductores de resistencias en plantas por los agricultores vendrá determinada por consideraciones económicas, esto es, dependerá del coste que la utilización de esta estrategia implica para el agricultor y de los beneficios que ello representa para las compañías que producen y comercializan estos compuestos. Un aspecto negativo acerca del uso de estos compuestos en agricultura es que su utilización extensiva podría tener consecuencias negativas desde el punto de vista medioambiental. Sin duda, la utilización de genes de defensa para la transformación de plantas y obtención de variedades resistentes a plagas y enfermedades, ha tenido el impacto más importante en la agricultura moderna Obtención de variedades transgénicas resistentes a plagas y/o patógenos Las técnicas de la biología molecular han contribuido enormemente al desarrollo y obtención de variedades que presenten mejoradas sus propiedades de resistencia frente a infección por patógenos, o frente al ataque por depredadores (insectos, nematodos). En el transcurso de los últimos años se ha recogido una gran cantidad de información acerca de los procesos de defensa naturales de las plantas y se han identificado una colección importante de genes que participan en dichos procesos. Es ahora cuando se están obteniendo los resultados prácticos del trabajo anterior, al aplicarse toda esta información y elementos de trabajo para la mejora genética de especies vegetales de interés en el sector agroalimentario. De las propias características de la respuesta natural de defensa de las plantas, se desprende el hecho de que los genes de defensa vegetales resulten herramientas de utilidad en la mejora genética de especies vegetales. Tal y como se ha comentado anteriormente, la expresión de genes PR se induce de manera ines-pecífica no sólo con respecto al agente inductor sino también en cuanto al efecto que producen sobre el organismo agresor. Ello explica el hecho repetidamente observado de que un gen PR obtenido a partir de un sistema de interacción planta-patógeno concreto pueda ser utilizado con éxito para obtener resistencias

17 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA frente a otro tipo de patógeno, y ello no únicamente en la especie de la cual proviene dicho gen sino también en otras especies. El ejemplo que mejor ilustra estos aspectos es la utilización de genes que codifican para quitinasas y 3-l,3-giu-canasas de tabaco, genes cuya expresión se induce en respuesta a infección por el virus del mosaico del tabaco (TMV), y que han sido utilizados para la obtención de resistencias frente a hongos en otras especies, por ejemplo tomate. Por otra parte, se sabe que la expresión de genes que codifican para proteínas de defensa se induce tanto en interacciones de tipo incompatible (resistencia frente al patógeno, incluyendo en respuesta hipersensible) como de tipo compatible (susceptibilidad frente al patógeno). Por lo tanto, la resistencia o la susceptibilidad frente a un patógeno, es dependiente de diferencias en: a) la intensidad con que se expresan estos genes de defensa; b) el momento o el tiempo durante el cual se expresan; c) los tejidos que los están expresando (expresión local o sis-témica), y d) la correcta combinación de genes que se expresan en cada caso. Por consiguiente, la modificación de cualquiera de estos parámetros (p.e. la sobreex-presión de un gen concreto en la propia planta) nos permite mejorar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos o ataque por insectos. La utilización de genes de defensa para la obtención de plantas transgenicas empezó a dar sus frutos en especies dicotiledóneas, debido a la facilidad con que estas especies pueden ser transformadas por una bacteria del suelo, Agrobacteñum. Esta bacteria, que infecta de modo natural muchas especies de plantas dicotiledóneas, es capaz de integrar en el genoma de la planta huésped fragmentos de ADN, es decir, que lleva a cabo un proceso de transformación genética en la planta huésped. Las especies monocotiledóneas, y dentro de ellas especies de evidente interés agro-económico como son los cereales, han sido tradicionalmente especies más difíciles de transformar. Así pues, durante varios años la posibilidad de obtener plantas transgenicas resistentes de especies monocotiledóneas estuvo frenada por la metodología de la transformación propiamente dicha y por la dificultad de regenerar plantas fértiles a partir del material transformado. La técnica de bombardeo con microproyectiles ha venido a solucionar muchos de estos problemas. Así, la posibilidad de introducir ADN directamente en células, tejidos u órganos regenera-bles proporciona un método adecuado para la transformación de especies de cultivo. Simultáneamente, se han ido desarrollando las técnicas de transformación mediadas por Agrobacteñum, de manera que se ha ampliado significativamente el número de especies susceptibles de ser transformadas por esta metodología. Por ejemplo, se ha conseguido ya que Agrobacteñum transforme cereales (arroz). En la literatura son muchos los ejemplos descritos, que demuestran que los genes PR son útiles para la obtención de plantas transgenicas mejoradas en sus propiedades de resistencia frente a patógenos, hongos y bacterias fundamentalmente. En general, la expresión simultánea de estos genes de defensa, por ejemplo quitinasas junto con [3-1,3-glucanasas, tiene un efecto protector superior al que aporta la expresión individual de cada uno de ellos. En el caso de qui-

18 94 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA tinasas y 3-l,3-glucanasas e l mecanismo por el cual se consiguen las resistencias a hongos está claro, ya que los substratos naturales de estas hidrolasas, quitina y [3-1,3-glucano, son los componentes estructurales mayoritarios de la pared de muchas familias de hongos. Para otras proteínas PR, se desconoce el mecanismo exacto por el cual se produce esta resistencia. Mientras que en el campo de las resistencias frente a hongos o bacterias ya se han obtenido resultados importantes mediante manipulación de la expresión de genes que codifican para proteínas de defensa de origen vegetal, no es éste el caso para las resistencias frente a virus. Únicamente, una proteína de la familia de las proteínas inactivadoras de ribosomas (proteínas RIP, o «Ribosome Inactivating Protein»), al ser introducida en plantas de tabaco y patata protege parcialmente frente a varios virus no relacionados. Desgraciadamente, las plantas transgénicas muestran fenotipos anormales, aparentemente a causa de efectos tóxicos del producto del transgén. Más recientemente se ha comprobado que la expresión en plantas de tabaco de una forma mutada de esta proteína RIP tiene efectos protectores frente a virus sin que cause efectos tóxicos para la planta. Los logros más espectaculares obtenidos en la protección frente a virus provienen de estrategias diferentes. En este campo, se han conseguido muy buenos resultados en las resistencias definidas como «resistencias derivadas de patógeno» («Pathogen Derived Resistance») basadas en la introducción de material genético viral en el genoma de la planta huésped. Así, en 1986 se demostró por primera vez que plantas transgénicas que expresan la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV) mostraban resistencia frente atmv. Este mecanismo de resistencia determinado por la expresión de la proteína de cubierta ha sido observado para otros diferentes virus (CMV, «Cucumber Mosaic Virus», etc.). Se han descrito además resistencias mediadas por la introducción de otras secuencias virales, tanto secuencias codificantes (replicasas, proteínas de movimiento) como secuencias no codificantes (secuencias antisentido, ge-nomas defectivos y secuencias de ARN satélite). Se sabe ahora que en muchos casos estos mecanismos de resistencia se encuentran mediados por ARN. Se trata de procesos de degradación específica de las moléculas de ARN virales como consecuencia de la formación de moléculas híbridas (doble cadena de ARNs), mecanismos similares al fenómeno de cosupresión o silenciamiento post-trans-cripcional de genes endógenos por parte de la célula vegetal. Sin embargo, las estrategias basadas en la utilización de genes que codifican para proteínas con actividad antimicrobiana de origen vegetal no han permitido hasta la fecha poder obtener variedades de interés comercial con mayor resistencia a patógenos o plagas, debido sobre todo al limitado espectro de hongos fitopatógenos frente a los cuales la planta resulta protegida. Muy probablemente, ello se debe a que no se conoce todavía cuál es la combinación adecuada, dentro del conjunto de genes que participan en la defensa, que es efectiva para combatir un número importante de patógenos. Es por ello, que en la ac-

19 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA tualidad se está dedicando un esfuerzo importante hacia la identificación de genes de defensa de origen no vegetal para la mejora genética de plantas. La idea de utilizar genes que codifican para proteínas o péptidos con actividad antimicrobiana, que se producen en la respuesta natural de defensa de otros organismos para aumentar las propiedades de resistencia en plantas amplia las posibilidades, y representa una estrategia alternativa a la utilización de genes de defensa de origen vegetal. Los organismos que potencialmente pueden resultar de mayor interés como fuente suministradora de genes antimicrobianos pueden ser hongos antagonistas o micoparásitos, como es el caso de Tri-choderma spp.. Estos hongos, que por otra parte son frecuentemente utilizados como controladores biológicos de hongos patógenos, han evolucionado específicamente para atacar a otros hongos del suelo, pero no a las plantas. Los genes que codifican para péptidos que participan en la respuesta inmune de insectos (defensinas, cecropinas) son también candidatos válidos para ser utilizados como transgenes en la mejora genética de plantas. A diferencia de lo que se observa con los genes de defensa de origen vegetal, los resultados ya obtenidos con la introducción de genes de defensa de origen no vegetal en plantas indican que las plantas transgénicas quedan protegidas frente a un espectro más amplio de patógenos. La utilización de genes de origen no vegetal es precisamente una de las estrategias que ha dado mejor resultado en relación a la protección frente al ataque por insectos. Este es el caso de los genes que codifican para toxinas con actividad insecticida de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (genes Sí). Así por ejemplo, los genes Bt han sido expresados en diferentes plantas dicotiledóneas, tabaco, tomate, patata, así como en monocotiledóneas, maíz y arroz. De hecho, es bien conocido el caso del maíz Bt, cultivo protegido frente al taladro, y uno de los primeros cultivos transgénicos que han sido comercializados. Se han obtenido también resistencias frente a insectos mediante la introducción de genes concretos de origen vegetal, genes que codifican para inhibidores de proteinasas (familia 6 de las proteínas PR). Así por ejemplo se han obtenido plantas transgénicas de arroz en las que se ha introducido el genpin2 (gen que codifica para un inhibidor de serín proteinasas de patata) bajo control de su propio promotor (inducible por herida), plantas que muestran resistencia a Sesamia inferens (lepidóptero minador del tallo). Sin embargo, el efecto de protección observado tras introducir el gen de un inhibidor de proteinasas en una planta parece ser transitorio, en el sentido de que con el paso del tiempo los insectos han demostrado una capacidad de adaptación a la presencia del transgén en la planta huésped. Esta adaptación resulta del incremento en la producción de actividades proteolíticas no susceptibles de inhibición por el inhibidor so-breexpresado, y que compensan el efecto inhibidor inicial. Ello apunta a que deben emplearse estrategias que garanticen un efecto de protección más duradero, como puede ser la introducción de varios inhibidores de proteinasas que

20 96 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA presenten diferentes propiedades inhibitorias, es decir que inhiban diferentes tipos de actividades proteolíticas digestivas de los insectos. La línea de investigación más actual va en la dirección de poder manipular mediante transformación genética vías concretas de señalización para la activación de las respuestas de defensa. Ello permitirá regular la expresión de varios genes de defensa simultáneamente. La utilización de esta estrategia requiere no obstante un conocimiento preciso de la ruta de señalización que se desea modificar, así como, de las posibles rutas secundarias que puedan resultar afectadas Nueva generación de plantas transgénicas Son relativamente pocos los años que han transcurrido desde que se introdujo en el mercado mundial el primer cultivo modificado genéticamente (1995). En el año 1996, agricultores de Estados Unidos y Canadá sembraron maíz tolerante al taladro, el maíz Bt. En 1999, aproximadamente el 50% del maíz, algodón y soja cultivado en Estados Unidos ha sido modificado genéticamente (bien para producir la proteína insecticida Bt, bien para introducir resistencia a herbicidas). Los cultivos transgénicos con los que más ensayos de campo se han realizado son algodón, maíz, cañóla, melón, patata, soja, tomate y tabaco. Las ventajas que se derivan de la utilización de estas variedades modificadas genéticamente incluyen el incremento en la producción y la reducción en el uso de productos químicos en el campo (pesticidas), con el consiguiente beneficio que ello supone para la conservación del medio ambiente y la reducción de los costes de producción. Paralelamente, durante este corto periodo de tiempo, la biotecnología vegetal aplicada a la mejora de plantas ha sufrido un espectacular avance. Las características de las nuevas variedades de plantas transgénicas, están significativamente mejoradas con respecto a las que se liberaron inicialmente. Se han superado así algunos de los aspectos criticados sobre la producción de plantas transgénicas que han sido el origen de importantes debates públicos que, en mayor o menor grado, dificultan la aceptación de estas tecnologías por la sociedad. En la percepción pública de los cultivos modificados genéticamente existen dudas y preocupaciones, en aspectos que quizás la comunidad científica no ha contribuido a aclarar suficientemente, pero ante los cuales existen soluciones con una base científica bien fundada. Sin entrar en detalles técnicos, examinaremos algunos de los aspectos considerados negativos en las plantas transgénicas de primera generación y las soluciones encontradas para cada uno de ellos. Partiendo de la base de que se dispone de un gen concreto cuyo producto se sabe es efectivo para combatir un patógeno o plaga determinada, y que por tanto su utilización como transgen resulta de interés, el primer objetivo a conseguir es que el gen en cuestión se exprese en niveles adecuados y suficientes para conferir resistencia a la planta transgénica. Este objetivo anteriormente se conseguía mediante la utilización de promotores (secuencias que dirigen la expresión de un gen)

21 APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA constitutivos capaces de dirigir la expresión de genes antifúngicos o insecticidas en niveles importantes en los diferentes tejidos de la planta transgénica. Por el contrario, la nueva generación de plantas transgénicas se basa en la utilización de promotores inducibles. De esta manera, el gen se expresará únicamente en aquellos momentos en los que es requerida la presencia de su producto (proteína antifún-gica o insecticida), o sea, cuando la planta se encuentra infectada por un patógeno o cuando es atacada por un fitófago. También con relación al promotor que se emplea para la transformación, otro aspecto al que se presta una atención especial es que el promotor confiera una expresión de tejido controlada, y no una expresión generalizada en todos los tejidos de la planta. Ello permite que la proteína antimicrobiana o insecticida se produzca únicamente en los tejidos de la planta que son susceptibles de ser atacados por el agente agresor, pero no en tejidos u órganos que se destinan al consumo humano. Por citar un ejemplo, es posible obtener una planta transgénica de maíz o arroz que exprese un gen insecticida (gen Bt, gen para un inhibidor de proteinasas) en las hojas y el tallo, tejidos de los que se alimentan las larvas de insectos, pero que dicho gen no se exprese en el grano. Una crítica muy generalizada en la opinión pública es la incorporación de genes que confieren resistencia a antibióticos en el genoma de las plantas transgénicas. La función de estos antibióticos es esencial en la etapa inicial del proceso para la obtención de plantas transgénicas ya que permiten la selección del material que ha sido transformado (permite el crecimiento de las células transformadas, frente a las que no lo han sido, en medios apropiados). Dejando aparte el hecho de que no se ha podido demostrar la existencia de transferencia génica horizontal, esto es de que un gen de una planta pueda ser transferido a otros microorganismos, se han desarrollado estrategias que permiten prescindir de la utilización de genes de resistencia a antibióticos. Así por ejemplo, se pueden utilizar genes de selección que confieren resistencia a herbicidas o genes que producen fitohormonas. Otra alternativa válida es llevar a cabo la co-transformación del material vegetal con dos vectores diferentes, uno portador del gen de interés (antifúngico, insecticida) y el otro portador del gen para la selección del material transformado. De esta manera, los genes se integran independientemente en el genoma de la célula vegetal para dar lugar a transformantes primarios portadores de ambos genes. Por tanto, es posible segregar (eliminar) el gen de selección de una línea transgénica, quedando únicamente presente en su genoma el gen de interés, en generaciones posteriores. En definitiva, se trata de utilizar técnicas de transferencia de ADN más depuradas, que permitan introducir el gen de interés (angifúngico, insecticida) pero no genes indeseables (p.e. genes de resistencia a antibióticos). Otra preocupación general en el tema de las plantas transgénicas hace referencia a la posibilidad de transmisión de un transgén a través del polen hasta variedades salvajes relacionadas. Sin embargo, existen metodologías que permiten eliminar este posible factor de riesgo, como es el caso de la transformación cloroplástica (introducción del gen de interés en el genoma del cloroplas-