PRODUCCIÓN DE BIO-ETANOL POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO, SOBRE ORUJOS DE UVA Y DE REMOLACHA AZUCARERA

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1 PRODUCCIÓN DE BIO-ETANOL POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO, SOBRE ORUJOS DE UVA Y DE REMOLACHA AZUCARERA Rodríguez, L.A. (1) ; Toro, M.E. (1) ; Vazquez, F. (1) ; Correa-Daneri, M.L. (1) ; Gouiric, S.C. (1) ; M.D. Vallejo (1). (1) Instituto de Biotecnología, Facultad de Ingeniería-UNSJ. Av. Libertador Gral. San Martín 1109 oeste San Juan. Argentina. mvallejo@unsj.edu.ar RESUMEN La producción de etanol combustible a partir de residuos agroindustriales es una alternativa válida para sustituir los combustibles de origen fósil. El orujo de uva (OU) es el residuo más abundante en San Juan, y el orujo o coseta de remolacha (CR) podría ser otro muy abundante en la región. La fermentación en estado sólido (FES) es una tecnología que permite transformar los residuos agroindustriales en numerosos bio-productos de alto valor, entre ellos, etanol. En el presente trabajo se reporta la obtención de etanol a escala de laboratorio, mediante FES de levaduras Saccharomyces cerevisiae, sobre orujos de uva y de remolacha azucarera. Las condiciones iniciales del medio de cultivo fueron: azúcares 16.5 % (p/p); ph 4.5; humedad 68 % (p/p). Los cultivos fueron inoculados con 10 8 células/gramo de orujo y se incubaron en ambiente anaerobio, a 28ºC, durante 96 horas. Los resultados obtenidos muestran para las FES, las máximas concentraciones de etanol a las 48 horas, y rendimientos superiores al 80 %, en base al consumo de azúcares fermentables. Estos rendimientos, que superan los encontrados en cultivos sumergidos, generan alentadoras expectativas sobre el empleo de las FES para obtener alcohol combustible. Palabras claves: Bio-etanol, Fermentación en estado sólido, Residuos agroindustriales. 1. INTRODUCCIÓN La producción de biocombustibles a partir de residuos agroindustriales es una alternativa válida ante la necesidad de sustituir, con costos apropiados, los combustibles de origen fósil. El orujo de uva, proveniente de la elaboración de vinos y mostos de uva, es uno de los residuos agroindustriales más abundantes de la región de Cuyo (Argentina). En la provincia de San Juan se produjeron aproximadamente Ton de orujo de uva (OU) durante el último año, según datos de molienda de cosecha 2008 [1]. Entre los usos del OU, se ha propuesto su utilización para la producción de etanol. Por otra parte, de acuerdo con ensayos experimentales llevados a cabo por la delegación local de INTA, la remolacha azucarera se perfila en San Juan como un cultivo apropiado para encarar la producción de bioetanol por fermentación directa sin hidrólisis previa de sus azúcares (sacarosa). Esto significa una ventaja en los costos de producción del etanol, en comparación con los procesos que utilizan materias primas amiláceas o celulósicas. Del procesamiento de las remolachas, queda un residuo sólido (80 % en peso) rico en fibras celulósicas y carbohidratos. La fermentación en estado sólido (FES) es una tecnología que permite utilizar los residuos agroindustriales como materias primas para obtener numerosos bio-productos de alto valor, entre ellos enzimas, pesticidas, abonos, colorantes, ácidos orgánicos, alcoholes, etc. Al mismo tiempo, las FES permiten una importante disminución de la masa de residuos y una disposición final segura [2-4]. En este sentido, en el Instituto de Biotecnología de la Facultad de Ingeniería-UNSJ (IBT) se han ejecutado proyectos de investigación aplicada, tendientes a valorizar residuos de producción local, con alentadores resultados [5-6]. La producción de etanol por FES sobre diversos subproductos o residuos agroindustriales ha despertado interés desde hace aproximadamente 30 años [7 10]. Sin embargo, no se han encontrado reportes sobre este bioproceso aplicado a residuos producidos en San Juan o en la Región de Cuyo. El presente trabajo reporta ensayos de FES, llevados a cabo con el objeto de producir etanol a

2 partir de residuos sólidos: orujo de uva y coseta de remolacha azucarera. Los mismos se comparan con fermentaciones alcohólicas en medio líquido. También se determina la disminución lograda en la masa de residuos. 2. EXPERIMENTAL 2.1 Microorganismo Se empleó la cepa de Saccharomyces cerevisiae PM-16, perteneciente a la colección de microorganismos autóctonos del IBT. Dicha cepa fue mantenida a 4 ºC. 2.2 Medios de cultivo Para mantener la levadura, se empleó medio agar-yepd (yeast extract-peptone-dextrose). Para activarla, medio líquido YEPD. Para preparar los inóculos de las fermentaciones, se empleó medio líquido YEPD-jugo de remolacha (JR) (50% v/v). Para las FES, se empleó: orujo de uva Cabernet (OU), provisto por bodegas locales; y orujo o coseta de remolacha (CR), preparada en el IBT, moliendo remolachas (provistas por INTA-San Juan) y extrayendo su jugo. Los medios sólidos para las FES se prepararon esterilizando los sólidos secos a 121 ºC, y luego agregando JR (previamente esterilizado), en cantidad necesaria para lograr la humedad y la concentración de azúcares requeridas para cada ensayo. Los medios líquidos para fermentación se prepararon con JR, conteniendo 165 g de azúcares/litro. 2.3 Fermentaciones Para las FES, se dispuso el sustrato (OU en un caso y CR en el otro) inoculado con 10 8 células/g seco, en cajas de Petri, que luego se incubaron en ambiente anaerobio a 28 ±1 ºC. Cada 24 horas, se retiraron cajas para realizar extractos y analizar su contenido. Los ensayos se hicieron por triplicado. Para las fermentaciones en medio líquido (FL), se inoculó el medio JR con 4 x 10 7 células/ml (equivalente al inóculo de las FES) y se dispuso en frascos Erlenmeyer con válvula de Müller, conteniendo 100 ml de cultivo cada uno. Las FL también se incubaron en ambiente anaerobio a 28 ±1 ºC. Se tomaron muestras cada 24 horas. Los ensayos se hicieron por triplicado. 2.4 Preparación de extractos Los extractos de FES se hicieron agregando dos volúmenes de agua fría (4 ºC) por unidad de peso de muestra sólida. Se agitó durante 10 minutos en agitador rotatorio a 250 rpm; luego se filtró y se centrifugó el filtrado. El sobrenadante fue reservado para las determinaciones analíticas. 2.5 Determinación del contenido de biomasa, azúcares y etanol El contenido de biomasa se determinó mediante recuentos de células en cámara de Neubauer. Se distinguió las células viables de las no viables, mediante tinción con azul de metileno. La determinación de azúcares totales se realizó mediante el método de Dubios (fenol-sulfúrico). El contenido de etanol se determinó por destilación y valoración; ensayos realizados en INV-San Juan. 2.5 Otras determinaciones En todos los cultivos se midió la pérdida de peso. En las muestras de FES, se determinó el contenido de agua, con balanza para peso seco Ohaus, con lámpara halógena. En las muestras líquidas, se determinó además el ph (ph-metro de mesada, WTW 330) y la densidad en º Brix, mediante un refractómetro. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se llevaron a cabo tres ensayos de fermentación alcohólica, durante cuatro días: FES-OU, FES- CR, y FL-JR. La FL-JR se realizó para confirmar la aptitud, tanto del jugo de remolacha como de la levadura utilizada, para la fermentación alcohólica. Ha sido reportado que el JR (de empresas azucareras japonesas) puede utilizarse para fermentaciones alcohólicas sin correcciones en su composición ni en su ph, utilizando un sistema de FL con levaduras inmovilizadas [11]. Por otra parte, la levadura Saccharomyces cerevisiae PM-16 utilizada en el presente trabajo, sólo ha sido probada en fermentaciones alcohólicas de mosto de uva, mostrando una elevada etanol-tolerancia. La Figura 1 muestra, para la FL-JR, los perfiles de células viables y pérdidas de peso, dos variables que habitualmente se examinan para monitorear las fermentaciones en laboratorio. Las pérdidas de peso se atribuyen a la evolución del dióxido de carbono generado por la

3 fermentación de azúcares, de acuerdo con la reacción (1), en la que glucosa es transformada en etanol y dióxido de carbono. C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2 (1) Figura 1. Población de Saccharomyces cerevisiae PM-16 y pérdidas de peso del cultivo, en fermentaciones en medio líquido jugo de remolacha (FL-JR). Los perfiles mostrados en la Figura 1 revelan un comportamiento normal de las variables, que explican la desaparición de azúcares y la aparición de etanol en los cultivos. La Figura 2 presenta los perfiles de etanol logrados en el transcurso de las fermentaciones, expresados en mg de etanol contenidos en cada gramo húmedo inicial de cultivo (mg/g, h,i ), a fin de hacer comparaciones válidas entre cultivos en estado sólido y en medio líquido. medido (92 g/g, h,i ) se encuentra alrededor de las 48 horas de cultivo. En FES-OU y FL-JR, los valores máximos logrados son, 50 g/g, h,i y 56 g/g, h,i, respectivamente, y también se encuentran alrededor de las 48 horas. Puede notarse que en las FES, después de las 48 horas hay una disminución del contenido de etanol, lo cual es más evidente en FES-CR. Probablemente, la pérdida de etanol en las FES se deba al efecto combinado de la utilización del etanol por parte de las levaduras, como se ha reportado previamente [12]; y a la evaporación de etanol que podría ocurrir por la alta concentración de alcohol presente en el líquido retenido en la matriz sólida de las FES (148 mg etanol/ml en FES-CR), a la temperatura de fermentación (28-30 ºC). Además, estas altas concentraciones de etanol pueden causar la inhibición del crecimiento de las levaduras y de la formación del producto, aunque no se haya agotado el azúcar presente. En la Figura 3, se ve la forma típica en que los azúcares fermentables disminuyen a medida que transcurre la fermentación. A las 48 horas, en FES-OU y en FL-JR, se ha consumido la mayor parte de los azúcares (72.8 % y 83.1 %, respectivamente), mientras que en FES-CR, sólo se ha consumido el 51,4 % de los azúcares fermentables. También se señala que en la FES- CR, se parte de una cantidad mayor de azúcares fermentables, debido a que la coseta de remolacha no ha cedido la totalidad de sus azúcares al jugo extraído. Esta situación es común cuando se trata de residuos de materias azucaradas. Desde el punto de vista de la fermentación, esa mayor cantidad de azúcares no fue inhibitoria para la levadura usada, y no se observaron retrasos en la producción de etanol. Figura 2. Contenido de etanol en fermentaciones de Saccharomyces cerevisiae PM-16: en orujo de uva, FES-OU; en coseta de remolacha, FES-CR; y en jugo de remolacha, FL-JR. En ella se observa que en FES-CR se obtiene la mayor cantidad de alcohol, el valor máximo Figura 3. Contenido de azúcares fermentables durante las fermentaciones de Saccharomyces cerevisiae PM-16 en orujo de uva, FES-OU; en

4 coseta de remolacha, FES-CR; y en jugo de remolacha, FL-JR. A fin de comparar el etanol producido en FES con el que se logra en FL, se calcularon los rendimientos (Y p/s) para cada una de ellas (en gramos de etanol producido/gramos de azúcar consumido) y se compararon con el rendimiento teórico dado por la reacción (1) (Ver Tabla I). FL-JR FES-OU FES-CR Yp/s (g/g) % Y teórico Tabla I. Rendimientos de etanol en base a los azúcares consumidos (Yp/s), y porcentaje del rendimiento teórico, calculados para 48 horas de cultivo. Analizando los valores expuestos en la Tabla I, se advierte que el Yp/s calculado para FES-CR resulta anormalmente alto, si la única fuente de etanol fuese la reacción (1) y los únicos sustratos disponibles en la CR fuesen los azúcares iniciales. Sin embargo, en la literatura se encuentran rendimientos mayores que el 100 % [13] del teórico, en producción de etanol por FES. Por otra parte, se sabe que la composición química de la coseta de remolacha incluye, aproximadamente, 6 % de azúcares y otros sacáridos, 29 % de pectinas y 5 % de proteínas [14], que pueden, en su mayoría, servir como sustrato para la levadura. El rendimiento de etanol en base a todo el sustrato disponible consumido a las 48 horas, resulta Yp/s = g/g, que representa 98.2 % del rendimiento teórico. En cuanto al Yp/s calculado para FES- OU, resulta prácticamente igual al reportado para FES-OU realizada en condiciones similares [7]. El rendimiento logrado en FL-JR (78 % del teórico), resulta satisfacorio, si se compara con los rendimientos reportados para FL-JR llevadas a cabo con levaduras inmovilizadas [11, 12]. Otro aspecto importante de las FES de residuos agroindustriales, es su contribución a la disminución de la masa de residuos. En el caso de las FES que se reportan en el presente trabajo, las pérdidas totales de peso seco final (96 horas), respecto al peso seco inicial (s,i), son: FES-UO: mg/g s,i (18% p/p) FES-CR: mg/g s,i (36% p/p) Estos valores resultan muy significativos desde el punto de vista del tratamiento de residuos, pero además, desde el punto de vista de su valorización, los sólidos no fermentados estarían en condiciones de ser destinados a la elaboración de algunos subproductos comercializables, como enmiendas de suelos o fertilizantes a partir de orujos de uva agotados [15]; o papel, a partir de coseta de remolacha agotada [14]. 4. CONCLUSIONES Los resultados mostraron que la producción de etanol en FES de orujos de uva y de remolacha puede llevarse a cabo con mayores rendimientos que la fermentación en medio líquido. Tanto en OU como en CR, las concentraciones máximas de etanol se obtuvieron a las 48 horas de cultivo. En las FES, el etanol se encuentra más concentrado que en las FL, por lo que su recuperación resultaría menos costosa. En ambos casos se logra además, una importante disminución de la masa de residuos. Las conocidas ventajas tecnológicas y económicas de las FES para fermentar residuos (fácil operación, ahorro de tiempo y energía, materias primas baratas, etc.), sumadas a los resultados del presente trabajo, alientan a profundizar y ampliar los estudios sobre fermentaciones alcohólicas en estado sólido sobre OU y CR, con el fin de optimizar variables y aumentar la escala de producción. 5. REFERENCIAS [1] I.N.V., Informe Cosecha de Uva 2007, Instituto Nacional de Vitivinicultura, [2] Gaitán-Hernández R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 2006, [3] Pandey A., et al., Process Biochem., 35, 2000, [4] Rodríguez Couto, S. y Sanromán, M.A., J. Food Eng., 76, 2006, [5] Gouiric, S. et al., Proy. Biotecnología Aplicada a la Valorización de Residuos Agroindustriales de la Región: Fermentación en Estado Sólido de Orujos. Programación , UNSJ, [6] Gouiric, S. et al., Proy. Bioproductos valiosos a partir de coseta de remolacha y orujos de producción local: FES. Programación , UNSJ, [7] Hang YD, et al., J. Food Sci., 47, 1982, [8] Hang Y. D, et al., Biotechnol. Lett. 8, 1986, [9] Roukas T., Appl Microbiol. Biotechnol. 41, 1994,

5 [10] Kiran Sree N., et al., Process Biochem., 34, 1999, [11] Ogbonna, J. C., et al., Bioresource Technology, 76, 2001, 1 8. [12] Zayed, G., J. of Industrial Microbiology & Biotechnology, 19, 1997, [13] Mohanty, S. K., et al., Applied Energy, 86, 2009, [14] Vaccari, G., et al., Journal of Cleaner Production, 13, 2005, [15] Nerantzis, E. T., P. Tataridis, e-journal of Food Science & Technology, 3, 2006, 1 12.