José L. Domínguez-Alpizar, Roger I. Rodríguez-Vivas, Christopher Oura, Ligia A. Cob-Galera.

Transcripción

1 17 Rev Biomed 1995; 6: Determinación de la especificidad y sensibilidad de las técnicas de Ensayo Inmunoenzimático Indirecto y de inmunoflorescencia indirecta para el diagnóstico de Babesia bovis. José L. Domínguez-Alpizar, Roger I. Rodríguez-Vivas, Christopher Oura, Ligia A. Cob-Galera. Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México. RESUMEN. Introducción. Babesia bovis produce grandes pérdidas a la ganadería bovina en climas tropicales. Sus principales formas de diagnóstico son la observación de los parásitos en la sangre y la determinación de los niveles de anticuerpos. El ensayo inmunoenzimático (ELISA) e inmunoflorescencia indirecta (IFI) son entre otras las técnicas serológicas más confiables para la detección de anticuerpos. En este trabajo se reporta la especificidad y sensibilidad de dos métodos de estas técnicas. Material y métodos. Ciento noventa y seis bovinos procedentes de Wisconsin E.U. fueron introducidos a Yucatán, México. Ciento ochenta y un animales de este grupo fueron inmunizados con una vacuna atenuada de B. bovis y quince animales fueron usados como controles. Todos los animales fueron estudiados antes y después de la inmunización mediante las técnicas de ELISA e IFI para determinar anticuerpos contra B. bovis. Se determinó la sensibilidad y especificidad de ambas técnicas. Resultados. La IFI mostró sensibilidad y especificidad de 98 %. El punto de corte para el ELISA fue de 10 %, y se obtuvo una sensibilidad de 97 % y una especificidad de 93 %. Solicitud de sobretiros: José L. Domínguez-Alpizar. Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán. Km Carretera Mérida-Xmatkuil, A.P Mérida, Yucatán, México. Recibido el31/mayo/94. Aceptado para publicación el 11/Oct./94.

2 18 JL Domínguez-Alpizar, RI Rodríguez-Vivas, C Oura, LA Cob-Galera. Discusión. Ambas técnicas resultaron ser eficientes para utilizarlas en estudios epidemiológicos; sin embargo, se discute la mayor ventaja del ELISA sobre la IFI, debido a que el ELISA puede evaluar un mayor número de muestras por hombre/día y se obtienen resultados automatizados, que no dependen de la subjetividad de la interpretación. Palabras clave: Babesia bovis, ensayo inmunoenzimático, inmunoflorescencia indirecta. for epidemiological surveys; however, ELISA has more advantages than IFAT because ELISA can evaluate a higher number of samples per man/day, and its automatized results does not depend on the subjetivity of the interpretation. Key words: Babesia bovis, vaccine, enzime-linked immunosorbent assay, indirect fluoroscent antibody test. SUMMARY. DETERMINATION OF SENSIBILITY AND SPECIFICITY OF ENZYME-LINKED INMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) AND INDIRECT FLUORESCENT ANTIBODY TEST (IFAT) FOR THE DIAGNOSIS OF BABESIA BOVIS. Introduction. Babesia bovis cause damage to cattle production in tropical climates. The principal diagnosis is the observation of parasites in blood smears and the determination of antibody levels. ELISA and IFAT are among others, the most accurate tests to detect antibodies. Material and methods. One hundred and ninety six cattle from Wisconsin, USA were introduced to Yucatan Mexico and 181 animals of this group were vaccinated with an attenuated Babesia bovis vaccine; the remaining 15 animals were used as a control group. Serum samples were obtained from all animals before and after vaccination and were evaluated by ELISA and IFAT techniques to determine antibodies levels against B. bovis. The sensitivity and specificity of both techniques were determined. Results. IFAT had a sensitivity and specificity of 98% and ELISA had a sensitivity of 97% and specificity of 94%. Discussion. Both techniques showed to be efficient INTRODUCCION. La babesiosis, también conocida como piroplasmosis, es causada por un protozoario intracelular del género Babesia, Starcovici, 1893 (1,2). La enfermedad generalmente se caracteriza por fiebre, anemia hemolítica y en casos severos produce la muerte (2). Babesia bovis y Babesia bigemina infectan los glóbulos rojos del bovino y son transmitidas por la garrapata, Boophilus microplus. Se estima que a nivel mundial más de un billón de bovinos están en riesgo de adquirir la enfermedad (3,4). La babesiosis empieza a tener auge con el desarrollo de la industria ganadera en el trópico, donde están siendo introducidas razas exóticas para mejorar la productividad en los hatos (5). El diagnóstico de la babesiosis aguda en bovinos es relativamente fácil cuando los signos clínicos son evidentes y están apoyados por el examen microscópico de frotis sanguíneos teñidos con Giemsa (5). Por otro lado, las infecciones leves e inaparentes son más difíciles de reconocer en función de que la parasitemia en sangre periférica fluctúa y frecuentemente no alcanza niveles detectables microscópicamente. Aunque las técnicas serológicas clásicas de babesiosis han probado ser útiles, tienen algunas limitaciones. En términos generales, estas limitaciones están relacionadas con un diagnóstico inadecuado, Revista Biomédica

3 19 Diagnóstico de Babesia bovis. rapidez y/o alto costo. Debido a que las técnicas de inmunoflorescencia Indirecta (IFI) y ensayo inmunoenzimático (ELISA) resuelven potencialmente la mayoría de estos problemas, en este trabajo se determinó la especificidad y sensibilidad de dos métodos de estas técnicas, con el propósito de usarlas en futuras investigaciones epidemiológicas de la babesiosis bovina del Estado de Yucatán, México. MATERIAL Y METODOS. Obtención de muestras de suero. Ciento noventa y seis bovinos de 18 meses de edad (Bos taurus) provenientes de Wisconsin, E.U., fueron importados al Estado de Yucatán, México. Todos los animales fueron sangrados al siguiente día de su arribo al Estado de Yucatán (sueros prevacunales). Desde el día del arribo de los animales hasta los 60 días después, todos los animales recibieron piretroide pour on (flumetrina) cada siete días para controlar garrapatas y moscas hematófagas. Después de un período de adaptación de una semana, 181 animales fueron inoculados intramuscularmente con 1 ml de una vacuna de B. bovis (dosis 1 x 10 7 ), viva y atenuada mediante 56 pases en cultivo celular (6). Al mismo tiempo, 15 animales recibieron intramuscularmente 1 ml de diluyente para ser utilizados como controles. Sesenta días después de la vacunación todos los animales fueron sangrados nuevamente (sueros postvacunales). Los sueros prevacunales y postvacunales fueron procesados mediante las técnicas de ELISA e IFI. Los resultados obtenidos se categorizaron en verdaderos positivos (animales vacunados que dieron reacción de positividad), falsos positivos (animales que fueron no vacunados pero dieron reacción de positividad), verdaderos negativos (animales que no fueron vacunados y no dieron reacción de positividad) y falsos negativos (animales que fuero vacunados y no dieron reacción de positividad). Procedimiento de la técnica de ELISA. El procedimiento utilizado en este estudio es similar al descrito por Waltisbulh y col (7). El conjunto de archivos fue proporcionado por la Food and Agriculture Organizatoin/International Atomic Energy Agency (FAO/IAEA) y el antígeno fue preparado de ácido desoxirribonucleico de B. bovis altamente purificado obtenido del CSIRO, Australia (8). La técnica fue llevada a cabo en microplacas de ELISA de 96 pozos con fondo plano (Nuncimmunoplate, Denmark). El antígeno se diluyó (1/ 200) en un amortiguador de carbonato-bicarbonato, 0.05M (amortiguador de cubierta) con ph 9.6. Cien ml del antígeno diluido se añadieron a cada pozo de la microplaca de ELISA y ésta se incubó a 4 C durante 24 h. Después de la incubación el antígeno diluido fue descartado y se añadió 150 ml de una segunda solución de cubierta (5% de leche descremada en amortiguador de cubierta) a cada pozo y se incubó la placa durante 1 h a 37 C. Después, la placa fue lavada tres veces en solución salina de fosfatos (PBS) 0.002M ph 7.4, conteniendo 0.05 % de Tween 20 (PBS-T). Los sueros de referencia positivos (fuerte y débil) fueron obtenidos de animales inoculados experimentalmente con B. bovis y el suero negativo fue obtenido de una zona libre de la enfermedad y negativo a B. bovis y Anaplasma marginale mediante la técnica de fijación de complemento. Todos los controles fueron diluidos 1:200 y añadidos en cuatro réplicas a los pozos con antígeno fijado. Los sueros de prueba fueron diluidos en la misma proporción y añadidos a los pozos en duplicado. La placa fue incubada durante 1 h a 37 C y lavada tres veces en PBS-T. Cien µl de conjugado (anti- IgG bovina producida en conejo y conjugada con peroxidasa de rábano picante) diluido 1:11000 en PBS-T con leche, fueron añadidos a cada uno de los pozos y la placa fue incubada durante 1 h a 37 C. Después de este tiempo, la placa fue lavada tres veces con PBS-T, y se le añadió la solución de

4 20 JL Domínguez-Alpizar, RI Rodríguez-Vivas, C Oura, LA Cob-Galera. cromógeno-sustrato, 2.2 mm (Ortofenilenodiamina); a los 10 minutos se detuvo la reacción añadiendo a la placa 100 µl de ácido sulfúrico 2M. El color desarrollado durante la reacción se evaluó utilizando un lector de ELISA equipado con un filtro de 492 nm. Los resultados de la absorbancia se reportaron como porcentaje de positividad (PP) (9). Los valores de PP para el control de calidad de cada suero control se obtuvieron de la siguiente forma: Densidad óptica de cada réplica de cada control (Positivo débil, positivo fuerte, negativo y PBS). PP= x 100 Media del valor de densidad óptica del control positivo fuerte Las placas fueron aceptadas cuando los controles estuvieron entre los siguientes intervalos de PP: positivo fuerte ( %), positivo débil (43-23 %), negativo (15-0 %) y PBS (4-0 %). Los valores de PP para la interpretación de los sueros de prueba fueron calculados como sigue: Densidad óptica de cada réplica del suero a evaluar PP= x 100 Media del valor de densidad óptica del control positivo fuerte. El valor del punto de corte fue determinado tomando en cuenta la suma de tres desviaciones estándares del promedio de la densidad óptica del control negativo (se expresó después como PP). Procedimiento de la técnica de IFI. La técnica de IFI utilizada fue similar a la descrita por Todorovic y Long (10). Se utilizaron frotis de antígenos de B. bovis producidos en cultivo celular. El control positivo fue obtenido de animales esplenectomizados e inoculados con una cepa de B. bovis. El control negativo fue obtenido de un animal adulto de una zona libre, negativo a B. bovis y A. marginale mediante la prueba de fijación de complemento. Los sueros controles y de prueba fueron diluidos 1:80 en solución buffer de fosfatos, 0.002M con un ph de 7.4. El conjugado utilizado fue anti IgG bovina producida en conejo y conjugada con isotiocianato de fluoresceina en dilución 1:60 en PBS. La observación microscópica se hizo con un microscopio de fluorescencia y los resultados se interpretaron de la siguiente manera: 1) positivo, observación de parásitos con una coloración fluorescente, y 2) negativo, no se observa fluorescencia. Determinación de sensibilidad y especificidad. Para cada técnica se determinó la especificidad y sensibilidad, según las siguientes fórmulas (11): No. animales postvacunados que resultaron positivos a la prueba Sensibilidad= x 100 No. total de animales vacunados No. animales antes de la vacunación que resultaron negativos a la prueba Especificidad= x 100 No. total de animales RESULTADOS. El punto de corte utilizado para la técnica de ELISA fue de 10% (más tres desviaciones estándares del promedio del control negativo). Esto es que los valores de PP iguales o menores de 10% fueron considerados como negativos y los valores de PP superiores a 10% fueron considerados positivos. En el cuadro 1 se indica los resultados obtenidos de las pruebas serológicas de los animales antes y después de la vacunación con una cepa viva de B. bovis. Se puede observar que antes de la Revista Biomédica

5 Cuadro 1 Especificidad y sensibilidad de las técnicas de ELISA e IFI para la detección de anticuerpos (IgG) contra Babesia bovis en bovinos de 18 meses de edad, antes y después de la inoculación de una vacuna de Babesia bovis. Prevacunados Postvacunados Sensibilidad Especificidad (%) (%) ELISA (-) 6 (-) 12 (+) * 175 (+) IFI 192 (-) 4 (-) 4 (+) * 177 (+) (-) Verdadero negativo (+) Verdaderos positivo (-) Falso negativo * (+) Falso positivo ELISA=Ensayo inmunoenzimático. IFI=Inmunoflorescencia indirecta 21 Diagnóstico de Babesia bovis. vacunación de los 196 animales, IFI solamente detectó 4 animales falsos positivos y ELISA detectó 12. Estos resultados determinan que la especificidad de la prueba de IFI sea del 98% y la de ELISA del 94%. En el caso de los resultados después de la vacunación, la IFI detectó 4 animales falsos negativos y el ELISA detectó 6; esto demuestra la similitud entre los resultados de sensibilidad de ambas pruebas (IFI 98% y ELISA 97%). Cuatro animales después de la vacunación fueron seronegativos a ambas pruebas. A los 60 días después de la vacunación, los 15 animales controles dieron resultados negativos a IFI y ELISA. DISCUSION. Las técnicas evaluadas de IFI y ELISA para la detección de anticuerpos contra B. bovis mostraron alta sensibilidad y especifidad. Resultados similares han sido reportados por Ramírez (12).. Si una técnica perfecta fuera diseñada, todos los animales infectados/enfermos deben ser positivos (100 % de sensibilidad) y todos los animales no infectados deben ser negativos (100% de especificidad). Sin embargo, las variaciones en la técnica por parte del personal y las variables biológicas entre los animales evaluados, hacen imposible diseñar una técnica perfecta (13). Por lo tanto se debe estar satisfecho con los resultados que simplemente predicen el estado de infección/ enfermedad en un animal. Jacobson (13) indica que para valorar la confiabilidad de los resultados de las técnicas se debe considerar tres factores: la reproducibilidad; la sensibilidad y especificidad y la prevalencia de la infección/enfermedad en una población. A este respecto, Jacobson (13) menciona que las pruebas con alta sensibilidad y especificidad son adecuadas para predecir la condición de enfermedad/infección en un hato, siempre y cuando su prevalencia sea alta; pero cuando la prevalencia de infección es muy baja (por ejemplo 0.1%), una técnica teniendo el 99% de sensibilidad y 99% de especificidad es

6 22 JL Domínguez-Alpizar, RI Rodríguez-Vivas, C Oura, LA Cob-Galera. pobremente predictiva de la infección/enfermedad de los animales. En este caso un resultado positivo tendrá un error del 91 %. En el estado de Yucatán existe una estabilidad enzoótica a la babesiosis (12), lo que significa que más del 75 % de los animales a los 9 meses son reactores positivos. En estas condiciones, la IFI y el ELISA pueden ser utilizadas exitosamente en los estudios epidemiológicos. La interpretación de los resultados del ELISA se basa en el valor del punto de corte entre los animales positivos y negativos. Davison (14) analizó un número diferente de procedimientos para calcular el punto de corte y la interpretación de resultados está influenciado por el procedimiento utilizado. Este autor concluyó que la interpretación de resultados puede ser altamente dependiente del método usado para calcular el punto de corte. En el presente estudio no se utilizó la densidad óptica para determinar el punto de corte, debido a que éste es solamente un dato crudo de expresión de la técnica y raramente tiene correlación con las concentraciones de antígenos y anticuerpos. El principal problema del ELISA es la complejidad en la producción de antígenos libres de proteínas contaminantes del huésped. En este estudio, se usó un antígeno de fracciones purificadas de la lisis de eritrocitos infectados con B. bovis. Waltisbuhl (7) usó este antígeno para estudios epidemiológicos y obtuvo una alta sensibilidad y especificidad; sin embargo, este antígeno así como otros han mostrado algunas reacciones cruzadas con A. marginale. La IFI tiene un número de limitaciones prácticas, especialmente debido a la subjetividad de la interpretación de resultados, al requerimiento de personal altamente calificado y con experiencia para diferenciar los casos positivos de los negativos. Aunque el ELISA es más complicado para realizar que la IFI, el uso de esta técnica en investigaciones epidemiológicas de babesiosis se ha incrementado en la actualidad (7). Esto probablemente sea atribuido a la similitud de resultados entre ambas pruebas y a que el ELISA tiene la ventaja de ser utilizado a gran escala por la facilidad de evaluar un número elevado de muestras por hombre/día (15) y además de obtener resultados automatizados que no dependen de la subjetividad del personal para su interpretación. Sin embargo se ha reconocido que la estandarización de la técnica es el principal problema para la introducción rutinaria del ELISA en el diagnóstico de la babesiosis. Un número de intentos se han hecho para resolver este problema y la FAO/IAEA está contribuyendo a la solución mediante el abastecimientos de reactivos para ser evaluados en distintas condiciones. En este estudio se encontró que 4 animales postvacunales fueron negativos a las técnicas de ELISA e IFI. Esto significa que ambas técnicas no son lo suficientemente sensibles para detectar niveles bajos de anticuerpos o que la vacuna no produjo anticuerpos. Sin embargo, esto no comprueba que la vacuna haya fallado en estos animales, ya que la inmunidad mediada por células juega un importante papel en la protección de la babesiosis (16). Se concluye que las técnicas de IFI y ELISA pueden ser usadas rutinariamente con resultados satisfactorios en los estudios epidemiológicos de B. bovis en el estado de Yucatán. AGRADECIMIENTOS. Este estudio fue realizado con el apoyo de la Agencia Internacional de Energía Atómica (FAO/ IAEA) bajo el contrato No. 6528SD. Los autores agradecen al Dr. Gale Wagner de Texas A & M por su gran apoyo en la realización de este estudio. REFERENCIAS. 1.- Kuttler, KL. Chemotherapy of Babesiosis. A review. En: Ristic M, ed. Babesiosis. New York: Academic Press, 1988: Revista Biomédica

7 23 Diagnóstico de Babesia bovis. 2.- Soulsby, AJL. Parasitología y enfermedades parasitarias de los animales domésticos. 7a. Edición. México: Interamericana, 1988: McCoster PJ. The global importance of Babesiosis. En: Ristic M, Kreier JP, ed. Babesiosis. New York: Academic Press, 1981: Konigshoefer HO. En: FAO-WHO-OIEA, ed. Animal Health Yearbook. Rome: Food and Agriculture Organization, 1977: Mallick KP, Dwivedi SK, Srivastana NK, Kumar, SA. Report on the occurence of haemoprotozoan infections in rural livestock. Ind J Parasitol 1987; 11: Todorovic RA, Long RF. Comparison of indirect fluorescence antibody (IFA) with complement fixation (CF) test for diagnosis of Babesia spp. infections in Columbian cattle. Tropenmed Parasitol 1976; 27: Waltisbuhl DJ, Goodger BV, Wright IG, Commins MA, Mahoney DF. Immunosorbent assay to diagnose Babesia bovis infection in cattle. Parasitol Res 1987; 73: Goodger BV, Wright IG, Waltisbuhl DJ. The lysate from bovine erythrocytes infected with Babesia bovis. Analysis of antigens and report on their immunogenicity when polymerized with glutaraldehyde. Z Parasitenkd 1983; 69: Wright PF, Nilsson E, Van Rooij EMA, Lelenta M, Jeggo MH. Standarization and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev Sci Tech Int Epiz 1993; 12: Proceedings of the Ninth International Veterinary Hemoparasite Disease Conference. Merida: Veterinary Hemoparasite Research Workers, 1993: Morilla GA, Bautista GC. Manual de Inmunología. México: Diana, 1986: Ramírez CG. Epidemiology of bovine babesiosis in the state of Yucatan, Mexico. Central for Tropical Veterinary Medicine, MPhil thesis, Scotland, U.K., 1993: Jacobson HR. How well do serodiagnostic tests predict the infection or disease status of animals?. FAO ed. IAEA Regional network for Latin America on animal disease diagnosis using immunoassay and labelled DNA probe techniques. Rome: FAO, 1992: Davison HC. The application of the enzymelinked immunosorbent assay in the serodiagnosis of bovine babesiosis and anaplasmosis. Central for Tropical Veterinary Medicine, MSc thesis. Scotland, U.K., 1991: O Donoghue PJ, Fridhoff KT, Vizcaino OG, Weyreter H. The detection of IgM and IgG antibodies against Babesia bigemina in bovine sera using semi-defined antigens in enzyme immunoassays. Vet Parasitol 1985; 18: Valentin A, Precigout E, L Hosytis M, Carcy B, Gorenflot A, Schrevel J. Cellular and humoral immune response induced in cattle by vaccination with Babesia divergens cultured-derived exoantigens correlate with protection. Infec Immunol 1993; 61: Wagner G, Holman P, Cruz D, et al. Cell culture derived vaccine for babesiosis. Goff W ed.