11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 31/70

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 31/70 C07H 7/027 A61K 31/71 A61P 43/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Remedio para la endotoxinemia y disfunciones de órganos múltiples inducidos por la misma. k 30 Prioridad: JP 12628/9 k 73 Titular/es: NGK INSULATORS, LTD. 2-6, Suda-cho, Mizuho-ku Nagoya-shi, Aichi 467, JP Biseiken Co., Ltd. k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 72 Inventor/es: Ohta, Michio; Hasegawa, Takaaki; Nadai, Masayuki; Yoshida, Yasuko; Kawase, Mitsuo y Inukai, Tadahiko k 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Remedio para la endotoxinemia y disfunciones de órganos múltiples inducidos por la misma. La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una composición de un medicamento terapéutico para el tratamiento del síntoma de endotoxina en la sangre y de la disfunción multi-orgánica inducida por el mismo. Antecedentes de la invención Las endotoxinas son lipopolisacáridos que constituyen las membranas celulares de las bacterias gram-negativas, de las que se conocen sus diferentes actividades fisiológicas como la pirexia, la disminución de la presión sanguínea, la disminución de plaquetas en sangre, la coagulación intravascular, el aumento de la permeabilidad capilar, la activación de los complementos, etc. Por consiguiente, si se produce una sepsis mediante una infeccióncon bacterias gram-negativaso si las bacterias gram-negativas se propagan anormalmente por el intestino grueso, la concentración de endotoxina en la sangre aumenta de manera que puede aparecer el síntoma de endotoxina en la sangre. Igual que para varias disfunciones causadas por el síntoma de endotoxina en la sangre, se conoce que éste puede causar la muerte súbita o la disfunción multi-orgánica. Como disfunción multi-orgánica se considera la hepatocirrosis, la hepatitis fulminante, la insuficiencia renal aguda, la insuficiencia respiratoria, la hemorragia gastrointestinal, DIC (coagulación intravascular diseminada), etc. Con el objetivo de prevenir el síntoma de endotoxina en la sangre, se han administrado antes antibióticos con el propósito de suprimir la propagación de bacterias gram-negativas como fuente de generación de las endotoxinas. No obstante, si se administra una gran cantidad de antibióticos, aparecen bacterias resistentes al medicamento, representadas por MRSA, que dificultan la terapia y el síntoma de endotoxina en la sangre se agravapor laliberación de endotoxinas de las bacterias gram-negativas muertas bajo el efecto del antibiótico. Por consiguiente, es necesario desarrollar un medicamento terapéutico diferente de los antibióticos. Con este objetivo, se han desarrollado anticuerpos contra una endotoxina o un lípido A como componente constituyente de la endotoxina. No obstante, esta medida tiene el inconveniente de que, de la misma manera que el efecto neutralizado es diferente en función de los tipos de bacterias gram-negativa, el efecto terapéutico también es diferente. Además, esta medida tiene otro inconveniente consistente en que la producción de un anticuerpo contra el anticuerpo de la endotoxina mediante la administración de un tipo diferente de una proteína, es decir, el anticuerpo, produce la aparición de efectos secundarios en un tratamiento continuado tales como alergias, ataques, etc. La patente US-A describe la utilización de ácido siálico para el tratamiento de enfermedades renales, tales como la nefritis y el síndrome nefrótico. Descripción de la invención La presente invención pretende proporcionar un procedimiento de preparación de una composición de un medicamento terapéutico para el tratamiento del síntoma de endotoxina en la sangre y la disfunción multi-orgánica inducida porelmismo,composición de medicamento terapéutico que no producirá bacterias resistentes al medicamento, a diferencia de la utilización de antibióticos, que puede exhibir efectos terapéuticos excelentes contra diferentes bacterias gram-negativas, y que permite tratamientos continuados con una elevada seguridad para el cuerpo humano. Con el fin de resolver los problemas anteriores, los inventores de la presente invención han estudiado enfermedades inducidas por las actividades fisiológicas de las endotoxinas, y han buscado medicamentos para reducir la aparición de dichas actividades fisiológicas. En consecuencia, los inventores han buscado medicamentos capaces de reducir la muerte súbita provocada por las endotoxinas. Como resultado, han descubierto que la muerte súbita que puede ser causada por la administración de endotoxinas se puede disminuir con ácido siálico y sus polímeros. La presente invención se establece en la reivindicación 1. Se puede utilizar preferentemente como polímero del ácido siálico, los polímeros compuestos de dos a trece unidades de ácido siálico. Se establece un límite superior de un polímero compuesto por trece unidades de ácido siálico porque los polímeros compuestos de hasta trece unidades de ácido siálico se pueden producir satisfactoriamente. Por lo que se refiere a los polímeros compuestos de dos a trece unidades de ácido siálico y a las sales de dichos polímeros, se pueden esperar efectos fisiológicos similares a los del ácido siálico y sus sales. Se pueden utilizar diferentes sales farmacológicamente aceptadas como sales de ácido siálico y sus polímeros. Como sales de monómero de ácido siálico, se utilizan habitualmente una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de calcio y una sal de magnesio. Como sales de los polímeros de unidades de ácido siálico, se utilizan habitualmente sales de sodio. El ácido siálico utilizado en la presente solicitud se refiere al ácido N-acetilneuramínico. Entre las preparaciones farmacéuticas producidas según la presente invención, se pueden enumerar las preparaciones de administración vía oral, como pastillas, cápsulas o preparados en polvo, preparaciones de absorción percutánea, como supositorios y supositorios vaginales, e inyecciones, como las inyecciones subcutáneas, las inyecciones intraperitoneales y las inyecciones intravenosas. Las preparaciones de administración vía oral son las más preferidas para la prevención de enfermedades, mientras que las inyecciones son más preferidas en caso de uso de emergencia. Las preparaciones de administración vía oral, las preparaciones de absorción percutánea, y las inyecciones se pueden formular según procedimientos habituales de preparación de medicamentos. A continuación se presentan ejemplos de formulación de una preparación de administración vía oral y de una inyección. 1) Ejemplo de una preparación inyectable Después de disolver 0 g de ácido siálico o su polímero en 1000 ml de agua destilada (libre de

3 3 ES T3 4 pirógeno), la solución resultante se ajusta a un ph 7,0 utilizando una solución de hidróxido de sodio, y se filtra y se esteriliza según procedimientos rutinarios. A continuación, el filtrado esterilizado se carga de manera aséptica y precintada, en una muestra de 20 ml en forma de inyección. 2) Ejemplo de un preparado de administración vía oral Una preparación en cápsulasseproducecar- gando 280 mg de ácido siálico o su polímero, habiendo pasado por una malla del 60, en una cápsula de gelatina del número 3. En el caso de que la preparación se empiece a administrar a una persona infectada, particularmente cuando él o ella aparecen infectados por bacterias gram-negativas, se puede obtener un mayor efecto de la administración de la preparación farmacéutica de la presente invención en comparación con el caso en que la administración se empiece después de la confirmación de cualquier síntoma de endotoxina en la sangre. A pesar de que la dosis administrada depende de la edad, el sexo, la gravedad de la enfermedad, etc. del paciente, la dosis generalmente no se puede definir. No obstante, cuando se calcula como la sal de sodio del ácido siálico o sus polímeros contenidos en una inyección, se pueden administrar a un adulto, por día, de 1 a 2000 mg/kg, preferiblemente de 10 a 00 mg/kg. El número de administraciones es convenientemente de una a seis veces por día. La instilación venosa es una vía de administración efectiva. Puesto que el ácido siálico es una sustancia contenida principalmente en terminales de sacáridos presentes en las capas superficiales de células que constituyen el cuerpo humano, y terminales de sacáridos presentes en la sangre y otros fluidos corporales, las preparaciones farmacéuticas de la presente invención son medicamentos que causan pocos efectos extremadamente negativos en el cuerpo humano. El ácido siálico y sus polímeros utilizados en la presente invención puede ser cualquiera de los productos químicos sintetizados, productos de síntesis catalizado enzimáticamente, obtenidos utilizando ácido siálico aldolasa, el enzima de síntesis citosina ácido monofosfato-nacetilneuramínico (CMP-NANA) o CMP-NANA transferasa, y un producto hidrolizado del ácido colomínico obtenido mediante la descomposición de ácido colomínico con un ácido. Ninguno de ellos es limitativo. El síntoma de endotoxina en la sangre y disfunción multi-orgánica inducida por el mismo se pueden tratar de manera efectiva médicamente con el medicamento terapéutico según la presente invención. Breve descripción de las figuras La Figura 1 es una gráfica que ilustra los efectos del ácido siálico sobre el shock endotóxico en ratones del tipo SMA. La Figura 2 es una gráfica que ilustra los cambios en la relación de la velocidad de filtración glomerular (Velocidad de filtración glomerular en un determinado momento de tiempo/velocidad de filtración glomerular antes de la administración de una solución salina fisiológica o ácido siálico). La Figura 3 es una gráfica que ilustra los cam bios de la proporción del flujo de plasma renal (Flujo de plasma renal en un determinado momento de tiempo/flujo de plasma renal antes de la administración de una solución salina fisiológica o ácido siálico). Realización preferida de la invención La presente invención se describe a continuación CON más detalle por referencia a ejemplos. (1) Efecto del ácido siálico en la disminución del shock endotóxico Se realizaron ensayos con respecto a la sensibilidad a endotoxina, se utilizaron ratones machos deltiposma(de20a30g): (1)dieciséis ratones de control, (2) ocho ratones a los que se administró ácido siálico, y (3) seis ratones a los que se administró un polímero de ácido siálico. (1) Con relación a los ratones de control, se les administró porvía peritoneal 0,1 ml/10 g de solución salina fisiológica 30 minutos antes de la administración de una endotoxina. (2) Con relación a los ratones a los que se administró ácido siálico, se administró alratón por vía peritoneal a una velocidad de 0,1 ml/10 g de ratón, una solución en donde se disuelven 100 mg de ácido siálico con 10 ml de solución salina fisiológica o una solución de la misma disuelta 10 veces (dosis: 100 mg/kg, 10 mg/kg). (3) Con relación a los ratones a los que se administró elpolímero de ácido siálico, se administró alratón por vía peritoneal a una velocidad de 0,1 ml/10 g de una solución en donde se disolvieron 100 mg de un dímero o un trímero de ácido siálico con 10 ml de solución salina fisiológica o una solución del mismo disuelta 10 veces (dosis: 100 mg/kg). Treinta minutos después de la administración, se administró al ratón, por vía peritoneal, a una velocidad de 0,1 ml/10 g de una solución salina fisiológica de endotoxina (10 mg/ml) (dosis: 100 mg/kg). A continuación, se controló elnúmero de ratones vivos al cabo de 24 horas. Los resultados del mismo se exponen en la Figura 1. Como muestra la Figura 1, (1) con relación a los ratones a los que no se les había administrado ni ácido siálico ni sus polímeros, solamente cinco de los dieciséis han sobrevivido (proporción de supervivencia: 83,3 %). Por otro lado, (2) con relación a los ratones a los que se les había administrado 10 mg/kg o 100 mg/kg de ácido siálico, sobrevivieron cuatro de los ocho (proporción de supervivencia: 0 %) y siete de los ocho (87, %) respectivamente, y (3) con relación a los ratones alosqueseleshabía administrado 100 mg/kg de un dímero o un trímero de ácido siálico, sobrevivieron cinco de los seis (proporción de supervivencia: 83,3 %). Se identificó la significación de proporciones de riesgo de no más del 1 % (indicado por en la Figura 1) y no más del % (indicado por en la Figura 1) con relación a los ratones a los que se administró 100 mg/kg de ácido siálico y sus polímeros, respectivamente. Esto significa que el ácido siálico y sus polímeros controlan algún paso en la provocación de la muerte debida a diferentes actividades fisiológicas inducidas por la endotoxina. Entonces, queda claro que el ácidosiálicoysus polímeros tienen la función de disminuir el shock endotóxico. Por consiguiente, suponiendo que el 3

4 ES T3 6 ácido siálico y sus polímeros tienen un efecto terapéutico sobre la disfunción multi-orgánica inducida por el síntoma de endotoxina en la sangre, este efecto se examina mediante la adopción de un sistema experimental para la insuficiencia renal inducida por la endotoxina, como una enfermedad típica de la misma. (2) Efecto sobre la insuficiencia renal A cada una de diez ratas del tipo Whister (de 8 o 9 semanas de edad) con canulación del canal carótido se les administró por goteo por vía intravenosaalavejigaunasolución de manitol al 4 % que contiene inulina ( mg/ml) y ácido paraaminohipúrico (2, mg/ml) a una velocidad de 0,1144 ml/min. Treinta minutos después de esto, se administró una solución fisiológica salina de ácido siálico ( mg/ml), a una velocidad de 0,2 ml/100 g (dosis: 10 mg/kg), a cada una de las ratas a las que se había administrado ácido siálico, mientras que a las ratas de control se les administró rápidamente por vía intravenosa la misma cantidad de solución fisiológica salina. Otros treinta minutos más tarde, se les administra por vía intravenosa una solución fisiológica salina de endotoxina (dosis: 0,2 mg/kg). Posteriormente, al cabo de 90 minutos, se tomó una muestra de sangre y de orina y se midieron las concentraciones de inulina y ácido paraaminohipúrico. El índice de aclaramiento del riñón se calculó según la fórmula siguiente. Se recogió laorina a intervalos de 1 minutos después de la administración del ácido siálico o de la solución salina (en lafigura2,de-1a0minutos,de0a1minutos, de 1 a 30 minutos, de 30 a 4 minutos y de 4 a 60 minutos), y se tomó la muestra de sangre a la mitad del intervalo entre dos tomas de muestras de orina. Los valores de aclaramiento se presentan para dichos momentos intermedios, para cada una de las respectivas fracciones. Aclaramiento del riñón = cantidad de medicamento recuperada en la orina en el periodo de tiempo de recogida + concentración del medicamento en el plasma en el punto intermedio. La concentración de inulina se midiómediante el procedimiento de Dishe & Borefreund s (Z. Dishe and E. Borefreund, J. Biol. Chem., 192, (191)), y la concentración de ácido paraaminohipúrico se midió mediante el procedimiento de Marshall s (E. K. Marshall, J. Biol. Chem., 122, (1937)). Los resultados de la proporción de la velocidad de filtración glomerular se muestran en la Figura 2, y los resultados de la proporción del flujo de plasma renal se muestran en la Figura 3. En ambas figuras, el eje de ordenadas signfica la proporción de la velocidad de filtración glomerular o la proporción del flujo de plasma renal durante 30 minutos entre la infusión intravenosa de dip de inulina y ácido paraaminohipúrico y la inyección intravenosa de ácido siálico o solución salina fisiológica. Como muestran las figuras 2 y 3, con relación a las ratas de control a las que no se administró ácido siálico, la proporción de la velocidad de filtración glomerular y la proporción ón de flujo de plasma renal, disminuyen rápidamente después de la administración de endotoxina, y disminuyeron hasta el 40 % de sus respectivos valores normales. Comparando con esto, y con relación a las ratasalasqueseadministróácido siálico, la disminucióndetantolaproporción de la velocidad de filtración glomerular como de la proporción de flujo de plasma renal debida a la administración de endotoxina se previno significativamente hasta un nivel de riesgo del % (indicado por en la Figura 3). Con relación a las ratas a las que se administró ácido siálico, la proporción de la velocidad de filtración glomerular y la proporción del flujo de plasma renal disminuyeron gradualmente, sin hacerlo rápidamente, después de la administración de endotoxina, y disminuía solamente en un 30 % y 20 %, respectivamente, 30 minutos después de la administración. Dado que no se observa ninguna influencia de la razón de la velocidad de filtración glomerular y la proporción del flujo de plasma renal con relación a las ratas a las que solamente se administró ácido siálico (- 30 minutos a 0 minutos en las figuras), el ácido siálico no previene completamente, pero previene claramente la insuficiencia renal inducida por la endotoxina. El ácido siálico utilizado en cada uno de los Ejemplos 1 y 2 era ácido siálico obtenido mediante la descomposición de ácido colomínico, que tiene origen en Escherichia coli, con un ácido, y separando y purificando la substancia resultante, obteniendo un ácido siálico con una pureza del 98,%, se utilizó nomás de un 1 % de análogos. Los dímeros y los trímeros de ácido siálico se separaron y purificaron a partir de un líquido de Escherichia coli de ácido descompuesto que tiene origen en el ácido colomínico de la misma manera que en el caso del ácido siálico, y se utilizó en forma de sal de sodio. La pureza fue del 99, % para la sal de sodio del dímero y del 98,3 % para la sal de sodio del trímero. Test de toxicidad aguda Se determinó un LD0 en el caso de administración intravenosa a ratas del tipo Whister (machos), según el cual las sales de sodio tanto del ácido siálico como del trímero (PH7) presentaban valores anormales de 200 g/kg. Campo de aplicación industrial Los medicamentos terapéuticos compuestos de ácido siálico y sus polímeros como ingredientes efectivos tienen elevados efectos terapéuticos contra la muerte súbita y la insuficiencia multiorgánica inducida por la endotoxina, así como son de una gran seguridad, y son efectivos para el tratamiento del shock endotóxico, insuficiencia hepática aguda, insuficiencia respiratoria aguda, DIC, etc. Además, los medicamentos terapéuticos según la presente invención pueden presentar elevados efectos terapéuticos sin inducir la aparición de bacterias resistentes a medicamentos en el caso de la utilización de antibióticos. 4

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de preparación de una composición de un medicamento terapéutico para el tratamiento del síntoma de endotoxina en la sangre y la insuficiencia multi-orgánica inducida por la endotoxina, que comprende la etapa de incorporar, en la composición, un componente activo seleccionado entre ácido siálico, polímeros de ácido siálico y sales de ácido siálico y polímeros de las mismas Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho componente activo es una sal de ácido siálico seleccionada entre una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de calcio y una sal de magnesio. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho componente activo es un polímero de ácido siálico o una sal del mismo. 4. Procedimiento según la reivindicación 3, en donde dicho componente activo es una sal de sodio de un polímero de ácido siálico NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.

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