99mTc-F11: Nuevo péptido radiomarcado para la detección gammagráfica de tumores.

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1 99mTc-F11: Nuevo péptido radiomarcado para la detección gammagráfica de tumores. Alejandro Perera Pintado, 1 Anaís Prats Capote, 1 Osvaldo Reyes Acosta, 2 Mónica Bequet, 2 Nelson Santiago, 2 Abel Hernández Cairo, 1 René Leyva Montaña, 3 Maria A. Bécquer, 4 Yecenia Moreno León, 3 Eduardo Fernández Sánchez 4 y Gilmara Pimentel González. 5 1 Centro de Investigaciones Clínicas. CNIC. 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. CP Tel.: Fax: alejandro.perera@infomed.sld.cu 2 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. 31 e/ 158 y 190, Cubanacán, Playa, C. Habana. CP Apartado Postal Centro de Isótopos. Ave. Monumental y Carr. La Rada, Km. 3, Guanabacoa, C. Habana. 4 Instituto de Farmacia y Alimentos. Calle 222, La Coronela, La Lisa, C. Habana. 5 Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. F y 29, Vedado, Plaza, C. Habana. Dirección: 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfonos: cic@infomed.sld.cu RESUMEN: La integrina α V β 3 es un receptor de adhesión celular que se sobreexpresa en la membrana citoplasmática de estas células malignas, así como en la neovasculatura que se desarrolla en el tumor y sus metástasis. Su presencia se correlaciona con la capacidad metastásica y malignidad de las células. La secuencia Arg-Gly-Asp de la vitronectina muestra afinidad por las integrinas del tipo α V β 3. El objetivo del trabajo fue sintetizar un nuevo péptido lineal, que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser, desarrollar una formulación para marcarlo con 99mTc y valorar su comportamiento in vivo en un modelo animal. Materiales y Métodos: El péptido F11 fue obtenido por síntesis en fase sólida. Se empleó la secuencia Ala-Gly-Gly-Gly dentro de la estructura del péptido, como quelatante para el 99mTc. La molécula se marcó a ph neutro, variando la relación molar F11: Sn +2 entre 1:0.5 y 1:4.0. Se inyectó 1µg ( MBq) de 99mTc-F11 por el plexo ocular de ratones C57BL6 machos sanos para estudiar su biodistribución y farmacocinética hasta 24 h. Se realizaron imágenes gammagráfícas hasta 16 h después de la administración de 13 µg (67-74 MBq) de 99mTc-F11 por el plexo ocular de ratones C57BL6 injertados con melanoma murino de la línea B16 y ratones desnudos injertados con tumores murinos de la línea A431. Resultados: Se obtuvo un marcaje de 95.2±2.1% estable por 24 h, para una relación molar F11:SnF 2 =1:1.3. La captación en riñones varió de 9.5 %DI/g (1h) hasta 4.0 %DI/g (24h), lo que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación. El resto de los órganos mostraron captaciones inferiores al 2.0% DI/g. La farmacocinética en suero se ajustó a un modelo bicompartimental con T 1/2α = 43.1±13.5 min y T 1/2β = 327±149 min. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en los tumores (relación tumor/región contralateral sana de 4 a las 15 h). Conclusiones: El péptido F11 marcado con 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráfica de los tumores malignos. ABSTRACT: Integrin α V β 3 is a celular adhesion receptor, which is overexpressed in the plasmatic membrana of malignant cells, as well as in the new vessels developed in the tumors and its metastases. It is related with the metastatic capacity and malignity of neoplasms. Sequence Arg-Gly-Asp of the vitronectin shows high affinity for integrins α V β 3. The aim of the present work was to synthesize a new lineal peptide with the sequence Arg-Gly- Asp-Ser, to develop a formulation for its 99mTc-labeling and assess its in vivo behaviour in an animal model. Materials and Methods: Peptide F11 was obtained by solid phase synthesis. Lineal sequence Ala-Gly-Gly-Gly in the peptide structure was employed as chelating core for 99mTc. Molecule was labeled at neutral ph, varying molar ratio F11: Sn +2 between 1:0.5 and 1:4.0. One microgram ( MBq) of 99mTc-F11 was injected through ocular plexus of healthy male mice C57BL6 to study the pharmacokinentics and biodistribution of peptide up to 24 h. Scintigraphic images were performed up to 16 h after administration of 13 µg (67-74 MBq) of 99mTc-F11 through ocular plexus of mice C57BL6 xenoinjerted with murine melanoma cells B16. Results: Labeling yield was 95.2±2.1% stable for 24 h, for a molar ratio F11:SnF 2 =1:1.3. Renal uptake was in a range from 9.5 %ID/g (1h) to 4.0 %ID/g (24h), which suggest that it should be the main excretion pathway. Rest of the organs took up less than 2.0% ID/g. Serum pharmacokinetics data were fitted to a bicompartmental model with T 1/2α = 43.1±13.5 min and T 1/2β = 327±149 min. Scintigraphic images showed an intense uptake of

2 radiopharmaceutical in the tumor (tumor/couterlateral region of 4 at 15 h). Conclusions: Peptide F11 labeled with 99mTc could be a useful radiopharmaceutical for scintigraphic visualization of malignant tumors. Palabras clave: Péptidos RGD, integrinas, Tecnecio-99m, cáncer Key words: RGD-Peptides, integrins, Technetium-99m, cancer INTRODUCCIÓN El cáncer ocupa, tanto en Cuba como en el mundo, la segunda causa de morbi-mortalidad. 1,2 El diagnóstico precoz y correcto estadiamiento de esta enfermedad incide decisivamente en la conducta a seguir con el paciente, así como en su sobrevida. Las integrinas forman una importante clase de receptores, que participan en los procesos de adhesión celular. Estas son glicoproteínas de transmembrana que forman heterodímeros (una cadena α y otra β). 3 Un importante miembro de esta familia es el receptor vitronectina (α V β 3 ). Esta integrina es sobreexpresada en el tejido endotelial recién formado, por lo que se considera un marcador para la neoangiogénesis. 3,4 Además, este receptor aparece aumentado en la membrana de diferentes células malignas, tales como: osteosarcomas, neuroblastomas, melanomas y carcinomas de pulmón, mamas, próstata y vejiga. 5 Se plantea que la integrina α V β 3 juega un rol importante en el crecimiento tumoral, la invasividad local y el potencial metastásico. 6,7 La secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) está considerada el sitio de unión primario a esta integrina. Es por eso que diferentes autores han reportado péptidos marcados, que contienen esta secuencia para detectar tumores y sus metastasis. 4,7,8 El objetivo del trabajo fue sintetizar un nuevo péptido lineal, que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser, desarrollar una formulación para marcarlo con 99mTc y valorar su comportamiento in vivo en un modelo animal. MATERIALES Y METODOS Síntesis del péptido El F11 es un péptido lineal de 12 aminoácidos, que tiene la siguiente secuencia: AGGG-Abu-GRGDSPK, donde Abu es el ácido 4-aminobutanoico, empleado como espaciador. La cadena Ala-Gly-Gly-Gly, que queda hacia el N-terminal se adicionó con el fin de que actuara como quelatante del 99m Tc, permitiendo así el marcaje de la molécula. La otra parte, contiene la secuencia Arg-Gly-Asp, que debe poseer afinidad por la integrina α V β 3, según los datos consultados en la literatura. 9 Este péptido fue obtenido por síntesis en fase sólida. Se emplearon aminoácidos protegidos (Boc) y resina MBHA (Bachem, Suecia). Una vez obtenido, el F11 fue purificado por HPLC de fase reversa a través de una columna RP-C18 (25x250 mm), empleando un gradiente de acetonitrilo:agua de 15 a 45% y una velocidad de flujo de 4 ml/min. El péptido fue caracterizado por espectrometría de masas. Marcaje del F11 con 99m Tc El péptido se marcó a ph neutro. La formulación se optimizó, tomando como factor la relación molar F11: Sn +2, que se varió en el rango: 1:0.5, 1:1, 1:2 y 1:4. La variable de respuesta fue la pureza radioquímica del 99m Tc- F11. Los resultados obtenidos se graficaron para determinar el valor óptimo. El control de calidad del marcaje se realizó por cromatografía de papel ascendente en tiras de papel Whatman 3MM de 5x80 mm y como fases móviles metiletilcetona ( 99m TcO - 4, Rf 1, 99m Tc-F11 y radiocoloide, Rf 0) y acetonitrilo ( 99m TcO - 4 y 99m Tc-F11 Rf 1 y radiocoloide, Rf 0). Estudio de biodistribución y farmacocinética Se inyectó 1µg (28.3 MBq) en 50µL de 99m Tc-F11 por el plexo ocular de ratones C57BL6 machos sanos con un peso de 19 a 22 g. Los animales fueron divididos en grupos de tres y fueron colocados en jaulas metabólicas para determinar el porciento de la dosis inyectada excretada a través de la orina y las heces. Para el estudio farmacocinético se tomaron muestras de sangre a los 5, 15, 30 y 45 min y 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas. La cinética del radiofármaco se determinó en suero y sangre total. La biodistribución se estudió a 1h, 4h, 12h y 24h. Los animales por cada tiempo fueron anestesiados con éter etílico y posteriormente sacrificados para llevar a cabo la extracción y pesaje de los siguientes órganos: corazón, hígado, riñones, bazo, pulmones, estómago, intestino grueso, intestino delgado, páncreas, timo y fémur. Todas las determinaciones de velocidad de conteos se realizaron en un contador automático (Wallac, EEUU). Los datos de porciento de dosis en sangre y suero de cada animal fueron graficados y las curvas se ajustaron a un modelo multiexponencial mediante regresión no lineal por el método de Gauss-Newton, empleando el

3 programa WinNonlin Professional v 2.1 (Pharsight Co. 1998). Para determinar el modelo más apropiado, que describiera el comportamiento farmacocinético del radiofármaco se tuvieron en cuenta los criterios de Akaike H y Schwarzt. 10 Estudio gammagráfico en modelo animal Se emplearon 3 ratones C57BL6 hembras de g de peso, a los cuales se les habían injertado células de melanoma murino B16 en el muslo de una pata trasera (la otra quedaba como control negativo). Se les administró a través de una vena lateral de la cola, aproximadamente, 13 µg del péptido marcado con MBq 99m Tc, en un volumen de 70 µl. Se realizaron imágenes seriadas a las 1, 3, 6 y 16 horas post-inyección, en una cámara gamma Sopha DS-7 (Sopha Medical, Francia), empleando un colimador de pinhole de 2mm de abertura, la ventana centrada en el fotopico de 140 kev ± 20% y una matriz de adquisición de 256x256 pixels y 500 Kconteos como condición de parada. Los animales fueron sedados mediante una inyección intraperitoneal de Ketamina. Las imágenes fueron procesadas en una estación de procesamiento Power Vision (SMV, EEUU). Todas las determinaciones de actividad se realizaron en un curímetro (COMP-U-CAL II, Victoreen, EEUU). RESULTADOS Marcaje del F11 con 99m Tc El péptido F11 fue sintetizado con una pureza química superior al 95%. Se obtuvo una dependencia entre la cantidad de F11 e iones Sn +2 y el porciento de marcaje con 99mTc del péptido, en la cual se detectó un máximo a una relación molar F11: Sn +2 igual a 1: 1 (tabla 1). Tabla 1. Dependencia entre la pureza radioquímica del 99m Tc-F11 y la relación molar F11: Sn +2. Relación molar F11: Sn +2 Pureza radioquímica del 99m Tc-F11 (%) 1: ±1.2 1: ±1.6 1: ±0.8 1: ±2.0 A partir de los resultados de la tabla I, se determinó realizar el marcaje del péptido con un exceso molar del reductor de 1.3, obteniéndose (95.2±2.1)% de pureza radioquímica del 99m Tc-F11 (n=3), por lo que se decidió trabajar con esa formulación en el futuro. Estudio de biodistribución y farmacocinética En la tabla 2 se muestran los principales parámetros farmacocinéticos del 99m Tc-F11 administrado a través del plexo ocular a ratones C57BL6 machos sanos a una dosis de 1µg (28.3 MBq) en 50µL, calculados a partir de un modelo bicompartimental. Tabla 2. Principales parámetros farmacocinéticos del 99m Tc-F11 en suero. Parámetros Estimado (Media ± DE) Desviación Relativa (%) Cmax (%DI/mL) 56.6± AUC (%DImin/mL) 8814± T 1/2 α (min) 43.1± T 1/2 β (min) 327± MRT (min) 346± Vd (ml) 6836± Cl (ml/min) ± Cmax: conc. máxima en sangre, AUC: área bajo la curva, T 1/2 : tiempo medio de aclaramiento, MRT: tiempo medio de residencia, Vd: volumen de dilución, Cl: aclaramiento. En la figura 1 se aprecia la biodistribución del péptido marcado en los principales órganos estudiados (las dosis en corazón, timo y páncreas fueron despreciables). El mayor acúmulo del radiofármaco fue detectado en riñones ( %DI/g), detectándose en orina una elevada actividad (para un total de 49.2±6.7 %DI en 24h), lo que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos mostraron captaciones inferiores al 2.0 %DI/g.

4 10 8 %DI/g Tiempo (h) Riñones Hígado Int. Delgado Int. Grueso Estómago Fémur Bazo Pulmones Fig. 1. Biodistribución del 99m Tc-F11en los principales órganos estudiados. Estudio gammagráfico Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en el tumor (figura 2). Se puso una máscara sobre la vejiga, debido a la elevada actividad presente en la misma. La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min) hasta 8.5 (24 h). Tumor Fig. 2. Imagen gammagráfica de un ratón 16h post-inyección.

5 DISCUSION La cadena tripeptídica Arg-Gly-Asp (RGD) es el sitio primario de reconocimiento a la integrina α V β 3, es por ello que se han sintetizado péptidos que contienen esta secuencia y reconocen con elevada afinidad a este receptor de la vitronectina. Algunos de ellos han sido marcados con isótopos radiactivos para poder valorar in vivo la expresión de este receptor. Por ejemplo el decapéptido (αp2), que contiene dos secuencias RGD y un residuo de cisteína, para facilitar el marcaje con 99m Tc. 8,9 Haubner R. y cols. sintetizaron varios péptidos que contenían la secuencia ciclo-rgdfv en su estructura, los marcaron con 131 I y probaron su potencial, en imágenes de autoradiografía, para detectar la expresión de la integrina α v β 3 en ratones desnudos xenoinjertados con melanoma M21, carcinoma de mamas MaCaF y en ratones Balb/c a los que se les provocó osteosarcomas. 4 Posteriormente, Haubner R y cols marcaron esos péptidos con 18 F y obtuvieron imágenes de ratones desnudos xenoinjertados con melanoma humano M21 mediante tomografía por emisión de positrones. 7 En el presente trabajo se partió de la experiencia existente para diseñar la secuencia animoacídica del compuesto a sintetizar, eligiendo una cadena lineal para simplificar la obtención del péptido. Por otra parte, la secuencia empleada para la quelación del 99m Tc, ya había sido reportada anteriormente con resultados de marcaje satisfactorios. 11 Cadenas similares han sido empleadas también por Thakur ML y cols. 12,13 Según se plantea en la literatura, en los péptidos con secuencias aminoacídicas quelatantes el tecnecio se acompleja en estado oxidación +5 (TcO +3 ). 14,15 De esta forma, un exceso de agente reductor podría provocar la reducción del tecnecio en forma de pertecnetato (TcO - 4 ) hasta grados de oxidación inferiores, favoreciendo la formación de radiocolides y una cantidad insuficiente de iones Sn +2 permite que existan cantidades significativas de tecnecio libre (ver tabla I). Lister-James J y cols. plantean que, de forma general, los péptidos pasan a las nefronas mediante filtración glomerular y posteriormente son reabsorbidos en el túbulo proximal, donde pueden ser degradados por la acción de las peptidasas. 16 Esto ocurre en mayor medida en péptidos de cadena lineal que tienen mayor carácter hidrofílico. Estos factores permiten explicar la alta actividad encontrada en riñones y orina. Algunos autores han propuesto el empleo de péptidos sintetizados a partir de D-aminoácidos, con el objetivo de hacerlos más resistentes a la acción de las proteasas y aumentar la estabilidad in vivo de los mismos. Por otra parte, De Jong M y cols. demostraron que una infusión intravenosa de lisina antes de la administración de péptidos marcados reduce sustancialmente la retención renal por disminución de la reabsorción tubular. 17,18 De forma general, los datos de biodistribución tisular obtenidos en el presente estudio son similares a los reportados en la literatura para péptidos lineales de este tipo. 8 Los péptidos cíclicos muestran menor excreción renal y una captación hepática superior, debido a su mayor carácter lipofílico. 4,7 La rápida cinética en sangre de los péptidos de bajo peso molecular, puede ser atribuida fundamentalmente a su pequeño tamaño. 16, 19 A pesar de que algunos muestran cierto nivel de unión a proteínas plasmáticas, la mayoría experimentan un rápido aclaramiento sanguíneo, con T 1/2α de alrededor de unos pocos minutos. 16 El perfil farmacocinético de los péptidos está determinado, además, por la suceptibilidad de éstos a la degradación proteolítica, que puede ocurrir en el plasma o durante el tránsito a través del hígado, los riñones o el tracto gastrointestinal. Este proceso puede destruir no sólo el fármaco, sino romper el enlace entre el isótopo radiactivo y el resto de la molécula. 16 Los elevados valores de Vd (6836±660 ml) son indicativos de la baja afinidad del radiofármaco por proteínas plasmáticas, por lo que pasa a distribuirse por todo el espacio vascular y el fluido extravascular. 20 El proceso de reabsorción de un fármaco ocurre después que éste ha sido filtrado a través de los glomérulos e incide en el valor del aclaramiento. Este parámetro farmacocinético puede variar, por tanto, desde 0 para el caso de los fármacos que se reabsorben totalmente (como el caso de la glucosa) hasta valores similares a la velocidad de filtración glomerular (130 ml/min para humanos) cuando el compuesto no sea reabsorbido. 20 Para el 99m Tc-F11 se determinó que Cl = ± ml/min en ratones, lo cual sugiere que este compuesto pudiera ser reabsorbido de forma significativa en los riñones. Las imágenes gammagráficas confirman los resultados de la biodistribución. La elevada relación tumor/región contralateral desde los primeros momentos post-inyección, permite suponer la factibilidad de este péptido marcado para la detección de melanomas. Por otra parte, su baja eliminación a través del tracto gastrointestinal hacen de este radiofármaco un posible diagnosticador útil para la detección de lesiones abdominales en comparación con otros radiofármacos. 10,11 CONCLUSIONES El péptido F11 marcado con 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráfica de los tumores malignos.

6 BIBLIOGRAFIA 1. Ministerio de Salud Pública. Anuario Estadístico. La Habana, MINSAP, Parker S.L., Tong T., Bolden S., Wingo P.A. Cancer Statistics. American Cancer Society, Inc., Atlanta, GA, Reynolds L.E., Wyder L., Lively J.C., Taverna D., Robinson S.D., Huang X, et al. Enhanced pathological angiogenesis in mice lacking β 3 integrin or β 3 and β 5 integrins. Nature Med., 8, 27, Haubner R., Wester H.J., Reuning U., Senekowitsch-Schmidtke R., Diefenbach B., Kessler H., et al. Radiolabeled α V β 3 integrin antagonists: A new class of tracer for tumor targeting. J. Nucl. Med., 40, 1061, Stromblad S., Cheresh D.A. Integrins, angiogenesis and vascular cell survival. Chem. Biol., 3, 881, Clezardin P. Recent insights into the role of integrins in cancer metastasis. Cell Mol. Life Sci., 54, 541, Haubner R., Wester H.J., Weber W.A., Mang C., Ziegler S.I., Goodman S.L., et al. Noninvasive imaging of α V β 3 integrin expression using 18 F-labeled RGD-containing glycopeptide and positron emission tomography. Cancer Res., 61, 1781, Sivolapenko G.B., Skarlos D., Pectasides D., Stathopoulou E., Milonakis A., Sirmalis G., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RDG-containing synthetic peptide. Eur. J. Nucl. Med., 25, 1383, Boerman O.C., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M. Radiolabeled receptor-binding peptides: A new class of radiopharmaceuticals. Sem. Nucl. Med., 30, 195, Akaike H. Statistical criteria for selecting a pharmaceutical model. Math. Sci., 14, 5, Quesada W. Brazo aminoacídico como alternativa noble para el marcaje directo de péptidos con 99mTc. Tesis de Maestría, ISCTN, Pallela V.R., Thakur M.L., Chakder S., Rattan S. 99mTc-Labeled vasoactive intestinal peptide receptor antagonist: Functional studies. J. Nucl. Med., 40, 352, Thakur M.L., Pallela V.R., Cosigny P.M., Rao P.S., Vessileva-Belnikolovska D., Shi R. Imaging vascular thrombosis with 99mTc-labeled fibrin α-chain peptide. J. Nucl. Med., 41, 161, Barnerjee S., Pillai M.R.A., Ramamoorthy N. Evolution of Tc-99m in Diagnostic Radiopharmaceuticals. Sem. Nucl. Med., 31, 260, Mease R.C., Lambert C. Newer methods of labeling diagnostic agents with Tc-99m. Sem. Nucl. Med., 31, 278, Lister-James J., Moyer B.R., Dean R.T. Pharmacokinetics considerations in the development of peptidebased imaging agents. J Nucl. Med., 41, 111, De Jong M., Rolleman E.J., Bernard B.F., Visser T.J., Bakker W.H., Breeman W.A.P., et al. Inhibition of renal uptake of 111-indium-DTPA-octreotide in vivo. J. Nucl. Med., 37, 1388, Behr T.M., Goldenberg D.M., Becker W. Reducing the renal uptake of radiolabeled antibody fragments and peptides for diagnosis and therapy: present status, future prospects and limitations. Eur. J. Nucl. Med., 25, Blok D., Feitsma R.I.J., Vermeij P., Pauwels E.J.K. Peptide radiopharmaceuticals in nuclear medicine. Eur. J. Nucl. Med., 26, 1511, Fernández Sánchez E. Introducción a la farmacocinética. En: Fernández Sánchez E (Ed.) Biofarmacia (Tomo I). EMPES, MES, La Habana, , 1988.