ANÁLISIS EPIGENÉTICO Y FUNCIONAL DE LOS RECEPTORES DE DOPAMINA D2, ADENOSINA A1 Y A2A EN LA ESQUIZOFRENIA: MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS

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1 ANÁLISIS EPIGENÉTICO Y FUNCIONAL DE LOS RECEPTORES DE DOPAMINA D2, ADENOSINA A1 Y A2A EN LA ESQUIZOFRENIA: MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS Dra. Marta Barrachina Castillo Hospital Universitari de Bellvitge Dra. Mairena Martín López Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Ciudad Real

2 1. Resumen del proyecto La esquizofrenia es un desorden psicótico cuya etiología y categorización no están aún bien definidas. La heterogeneidad de los resultados de distintas investigaciones y la práctica clínica, que tiende a la definición de subgrupos fenotípicos de pacientes, apuntan la idea de que la esquizofrenia se trata de un síndrome, de un conjunto de síntomas que producen un cuadro similar pero que responden a causas diversas. La teoría más aceptada para explicar la etiología de la esquizofrenia es la de la hiperdopaminergia. Se ha descrito, en tejido post mortem, que los receptores de dopamina están más activos en el caso de las personas diagnosticadas de esquizofrenia. También ha sido propuesta una disfunción del sistema glutamatérgico. Por último, la teoría de la hipoadenosinergia tiene el potencial de integrar las dos anteriores: mientras que la interacción entre los receptores de adenosina A 1 (A 1 R) y A 2A (A 2A R) en la neurona presináptica controla la liberación de glutamato y dopamina, la interacción de estos mismos receptores con los receptores de dopamina regula la sensibilidad a la señal dopaminérgica en las neuronas estriatales. La teoría de la hipoadenosinergia podría tener al menos dos orígenes. Por un lado, la reducción de los niveles de adenosina en el cerebro de las personas con esquizofrenia. Un déficit de adenosina alteraría el equilibrio entre la activación del A 1 R y el A 2A R en favor de la activación del A 1 R, de mayor afinidad por adenosina que los A 2A R, provocando una reducción de los niveles de glutamato liberado. Aunque esto disminuiría también la cantidad de dopamina liberada en la sinapsis, provocaría, por otro lado, una hipersensibilidad del receptor D 2 de dopamina (D 2 R), ya que el A 2A R, que inhibe al D 2 R, no llegaría a activarse. Asimismo, la hipoadenosinergia puede estar relacionada con una variación en los niveles o en la actividad de los receptores de adenosina. Por todo ello, uno de los objetivos del proyecto fue el estudio de los receptores de adenosina y dopamina en las muestras cerebrales post mortem de pacientes con esquizofrenia. En este sentido, analizamos los niveles de expresión de los receptores A 1, A 2A y D 2, así como sus vías de señalización intracelular, observando una expresión diferencial 2

3 de todos ellos en los pacientes con esquizofrenia en función del área cerebral analizada. La esquizofrenia ha sido relacionada previamente con alteraciones epigenéticas, especialmente considerando la existencia de gemelos monozigóticos discordantes para la patología. Algunos genes cuya expresión se ve alterada en la enfermedad han sido relacionados con hipermetilación. Las ADN metiltransferasas están sobreexpresadas en varias regiones cerebrales de personas con esquizofrenia, pudiendo ser responsables de la represión de algunos genes en la enfermedad. Tras la ejecución del presente proyecto, hemos demostrado que la metilación del ADN está implicada en la expresión diferencial del A 2A R y del D 2 R. 2. Resultados 1. Análisis del receptor A 1 de adenosina (A 1 R) Hemos observado que este receptor se encuentra diferencialmente expresado en pacientes con esquizofrenia en función del área cerebral. En este sentido, se ha detectado que los niveles del receptor están disminuidos en el córtex temporal y parietal de los pacientes esquizofrénicos, mientras que sus niveles de expresión no están alterados en el putamen. Sin embargo, los niveles reducidos del receptor no se correlacionaron con cambios en los niveles de su ARNm, sugiriendo la implicación de mecanismos postranscripcionales en la expresión patológica observada en la corteza cerebral. 2. Análisis del receptor A 2A de adenosina (A 2A R) El análisis de las muestras de putamen de personas con esquizofrenia respecto a los casos control ha evidenciado que aproximadamente un 50% de los pacientes presenta una importante reducción de los niveles del A 2A R. Esta disminución tendría un efecto análogo al de la reducción de los niveles de adenosina, conduciendo a una sobreactivación del D 2 R. Además, al analizar la puntuación de la escala PANSS, se observa que este subgrupo de pacientes presenta alteraciones motoras de tipo hipercinético, 3

4 independientemente del tratamiento farmacológico recibido. Asimismo, la disminución de la expresión del A 2A R en el subgrupo de pacientes identificado se produce tanto a nivel de proteína como de ARNm y va acompañada por un aumento en los perfiles de metilación del promotor del gen ADORA2A, codificante del A 2A R. Al igual que con la puntación PANSS, la hipermetilación observada en el promotor de ADORA2A no mostró ninguna correlación con el tipo de tratamiento recibido. A diferencia de los resultados obtenidos en putamen, hemos observado que los niveles de expresión de este receptor parecen preservarse en córtex temporal y parietal de pacientes con esquizofrenia. Tampoco se detectaron cambios significativos en los niveles de expresión del gen ADORA2A en estas áreas. Por tanto, el estudio de este receptor ha resultado en una expresión diferencial en función del área cerebral analizada. 3. Análisis del receptor D 2 de dopamina (D 2 R) Estudios previos en linfocitos demostraron que la metilación del ADN participa en la expresión de este receptor, basándose en el análisis de una isla CpG situada en la región promotora de su gen codificante. Tras la ejecución del presente proyecto, hemos observado que los niveles de expresión de este receptor están aumentados en el córtex parietal de los pacientes con esquizofrenia. Sin embargo, este aumento no se ha correlacionado con una pérdida del porcentaje de metilación en la región promotora, antes al contrario, se ha detectado un aumento en el grado de metilación. Por consiguiente, cabe la posibilidad de que esta hipermetilación sea un reflejo del aumento de los niveles de hidroximetilcitosina (marca activadora) en vez de metilcitosina (marca represora). 4. Análisis del receptor metabotrópico 5 de glutamato (mglu 5 R) Debido a que los receptores de adenosina y dopamina pueden colocalizar con los mglu 5 R y se pueden presentar diferentes tipos de interacciones entre ellos, en el marco del presente proyecto se han estudiado los mglu 5 R en muestras de córtex parietal y temporal de enfermos de esquizofrenia. Se ha observado una disminución en córtex parietal, mientras que en córtex 4

5 temporal no se han visto alterados. De nuevo se comprueba que existe una afectación distinta en función de las áreas analizadas. 5. Análisis de la actividad ectonucleotidasa Hemos demostrado que la actividad ATPasa y ADPasa están disminuidas en el putamen de todos los pacientes con esquizofrenia analizados e independientemente de los niveles del A 2A R. Ambas actividades son responsables de la generación en último término de AMP, sustrato de la enzima CD73 (ecto-5'-nucleotidasa) que lo hidroliza en adenosina. Por tanto, este estudio evidencia que las actividades enzimáticas responsables de la generación de adenosina extracelular están disminuidas en pacientes con esquizofrenia, apoyando la teoría de la hipoadenosinergia como uno de los mecanismos implicados en la etiopatogénesis de la enfermedad. 6. Análisis de la funcionalidad de las vías mediadas por A 1 R, A 2A R, D 2 R y mglu 5 R Se ha observado que la vía inhibidora de la adenilato ciclasa, mediada por A 1 R, está desensibilizada en córtex parietal, mientras que se preserva en córtex temporal de pacientes de esquizofrenia. Sin embargo, la vía estimuladora, mediada por A 2A R, y la inhibidora, mediada por D 2 R, se preservan en ambas áreas cerebrales. Igualmente se preserva en ambas áreas la vía estimuladora de la fosfolipasa C, mediada por mglu 5 R. Los estudios por Proximity Ligation Assay demuestran la formación de heterodímeros en muestras de esquizofrenia. 3. Relevancia y posibles implicaciones La caracterización de un subgrupo de pacientes con niveles estriatales (putamen) reducidos del receptor A 2A y la presencia de un trastorno motor de tipo hipercinético abre las puertas a un estudio clínico encaminado a establecer un posible tratamiento personalizado. Tanto los antipsicóticos de primera como de segunda generación se muestran ineficaces con los síntomas cognitivos y producen efectos secundarios indeseados, por lo que se mantiene el esfuerzo en la búsqueda de tratamientos alternativos para la 5

6 esquizofrenia. En este sentido, los A 2A R pueden ser detectados mediante técnicas de radioimagen o bien se podrían seleccionar los pacientes adoptando el trastorno motor como rasgo diagnóstico. Saber a qué grupo pertenece cada paciente permitiría el diseño de una terapia personalizada si se decide enfocar el sistema adenosinérgico como diana. Si los niveles reducidos del A 2A R desempeñan un papel en la etiología de la enfermedad, el tratamiento con agonistas de este receptor sería una posible estrategia terapéutica complementaria al uso de antipsicóticos, ya que rescatando la actividad del A 2A R se ejercería un efecto inhibidor sobre la transmisión dopaminérgica. Asimismo, cabe señalar que la identificación de un incremento en la metilación de ADORA2A está relacionada con los niveles de expresión reducidos de este receptor. Algunos tratamientos basados en la manipulación de la epigenética están hoy en día en fase clínica, como el ácido valproico, un inhibidor de las histonas acetil-deshidrogenasas, que promueve la desmetilación del ADN recuperando la expresión de algunos genes. Esta propuesta de terapias combinadas podría representar una estrategia farmacológica para disminuir la dosis de los antipsicóticos en determinados tipos de pacientes. Por consiguiente, la ejecución de este proyecto ha generado la necesidad de trasladar esta información a un estudio clínico. También cabe destacar que se ha demostrado experimentalmente en el putamen post mortem de pacientes con esquizofrenia, una actividad ectonucleotidasa reducida. Estos resultados apoyan, de nuevo, la teoría hipoadenosinérgica y aportan nueva información de los mecanismos implicados en la etiopatogénesis de esta dolencia neurológica. Por último, la afectación diferencial de los receptores de dopamina, adenosina y metabotrópicos de glutamato, junto con los procesos de heterodimerización de estos receptores en esquizofrenia, podría abrir la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias farmacológicas basadas en el diseño de fármacos bifuncionales, que modulen simultáneamente la actividad de aquellos receptores dimerizados. 6

7 4. Publicaciones Buira SP, Dentesano G, Albasanz JL, Moreno J, Martín M, Ferrer I and Barrachina M. DNA methylation and Yin Yang-1 repress adenosine A2A receptor levels in human brain. Journal of Neurochemistry (2010) 115: Barrachina M, Moreno J, Villar-Menéndez I, Juvés S, Ferrer I. Histone tail acetylation in brain occurs in an unpredictable fashion after death. Cell and Tissue Banking (2012) 13: Aliagas E, Villar-Menéndez I, Sévigny J, Roca M, Romeu M, Ferrer I, Martín- Satué M, Barrachina M. Reduced striatal ecto-nucleotidase activity in schizophrenia patients supports the adenosine hypothesis. Purinergic Signalling (2013) 9: Villar-Menéndez I, Blanch M, Tyebji S, Pereira-Veiga T, Albasanz JL, Martín M, Ferrer I, Pérez-Navarro E, Barrachina M. Increased 5-methylcytosine and decreased 5-hydroxymethylcytosine levels are associated with reduced striatal A2AR levels in Huntington's disease. Neuromolecular Medicine (2013) 15: Villar-Menéndez I, Díaz-Sánchez S, Blanch M, Albasanz JL, Pereira-Veiga T, Monje A, Planchat LM, Ferrer I, Martín M, Barrachina M. Reduced striatal adenosine A2A receptor levels define a molecular subgroup in schizophrenia. Journal of Psychiatric Research (2014) 51: