III. MATERIALES Y METODOS

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1 III. MATERIALES Y METODOS 3.1 Materiales 6 Tubos para la digestión Kjeldahl 10 balones de fondo redondo Thimbles 6 matraces de Erlenmeyer de 500 y 2000 ml. 6 Embudos grandes 2 pinzas (nueces). 1 soporte universal 1 pipeta de 10 ml. 1 Probeta de 100 ml. 1 frasco gotero de 25 ml. 1 pisceta grande con agua destilada. 1 Bureta de 50 ml. 1 par de guantes de Cuero. 1 pinzas largas. Papel de filtro. 3.2 Equipo s Equipo digestor Kjeldahl modelo Velp Scientific Espectrofotómetro de Infrarrojos modelo IFTIR8400S Equipo Destilador Bomba de água Balanza analítica +/ 0,0001 g. Estufa modelo FANEM +/ 105 C Soxhlet 3.3 Reactivo s Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%. Ácido bórico al 2% 4%. Ácido clorhídrico 0.2N (solución valorada) y Concentrado 17

2 Hidróxido de sodio al 30% 40%. Ácido sulfúrico concentrado. Mezcla catalizadora para la digestión 3.5 g de K 2 SO 4. y 0.4g de CuSO 4 5H 2 O. Indicador Tashiro: se prepara de la siguiente manera: o de metilo al 01% en solución alcohólica y azul de metileno al 01% en solución alcohólica Mezclar: 2 partes de Rojo de metilo. Hexano para análisis Muestras de los diez cromotipos de maca Cinta de Magnesio Gelatina FeCl 3 Borntrager Solucion de Fehling Sulfato de cobre Tartrato de sodio y potasio solución de Luff Schoorl Yoduro de potasio Almidón sulfato cúprico (CuSO 4. 5H 2 O) 50 g de ácido Cítrico (C 6 H 8 O 7.H 2 O) CO 2 Na 3 Tiosulfato de sodio 18

3 3.4 Mé todo s Determinación de proteínas Preparación de la muestra para la dige stión a. Pesar la muestra si es sólida aproximadamente 1 g anotar peso. Evitar que las muestras se adhieran a las paredes. b. Añadir el catalizador previamente pesado. c. Adicionar de ml de H 2 SO 4 Concentrado. d. Adicionar perlas de ebullición para evitar que la espu formada rebalse en el tubo de muestra. e. Someter las muestras a digestión. El tiempo dependerá de los programas establecidos (rampas: Tiempo y temperatura). gestión termina cuando el color de la muestra sea azulverde claro. f. Adicionar ml de agua fría cuidadosamente, poco a poco, a La muestra digerida. Mezclar y dejar enfriar. Esto se hace para diluir el H2SO4 Presente en la muestra. Figura 02: Muestras en digestión: T a 400 ºC y tiempo: 60 minutos Fuente: Elaboración propia, SEHS 19

4 Des tilac ión a. Encender y programar el equipo destilador. b. Abrir la llave de agua para tener el agua circulando t o el tiempo. c. Adicionar a 50 ml de NaOH al 30% (Neutralización). Colocar el tubo al equipo de destilación. 68 minutos. d. Colocar en el erlenmeyer donde se recogerá el destilado 20 ml de acido bórico del 2 4% y dejar destilar hasta alcanzar un volumen entre ml. e. Cuando termina el destilado retirar el matraz con el destilado para titular con HCl al 0.2 N, usando como indicador rojo de metilo. f. Al tubo destilado se saca con cuidado y los residuos se colocan en un recipiente para neutralizar (Líquidos contaminantes debemos tratar antes de eliminar al desagüe). Figura 03: Destilador Fuente: Elaboración propia, SEHS 20

5 Nota: Después de cada destilación hay que realizar un avado al equipo con aproximadamente 400 ml de agua y por 5 minutos. Colocar el agua en el tubo y realizar la misma operación como si fuera un destilado Titulación a. Retirar el Matraz del destilador contendiendo el destilado, adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y luego titular con el HCl 0.2 N. Anotar el gasto de la titulación de HCl. Se titula el exceso de acido bórico Po rcentaje de Materia Gras a Método Soxlhets 1. Pesar 5 g de muestra con aprox / 1 g dentro de un cartucho de papel de filtro y sellarlo. 2. Colocarlo dentro de un thimble y taparlo con algodón. 3. Pesar el balón (W1) y luego agregar unos 120 ml de hexano. 4. Luego colocarlo dentro del soxhlet y llevarlo a extracción por lo menos 5 h. 5. Recuperar el solvente y colocarlo el balón dentro de la estufa de 105 ºC x 2 horas hasta eliminar el olor del solvente. 6. Sacar de la estufa, enfriar en el desecador y pesar (W2). Cálculo y Expresión de los res ultados W = Peso en g de la muestra. W1 = Peso en g del Balón W2 = Peso en g del balón + el residuo. % Materia Gras a = W2 W1 x 100 W 21

6 Figura 04: Determinación de % Materia Grasa Fuente: Elaboración propia, SEHS Po rcentaje de Hume dad Pesar cerca de 5 g de muestra preparada con una aproximación de 0.01 g dentro de un vaso tarado. Deje el vaso y contenidos por 1 hora en la estufa a 103 +/ 2 C. Deje enfriar en el desecador y pesar. Repetir e calentamiento y el peso por periodos sucesivos de 30 minutos hasta que la pérdida en masa entre dos pesos sucesivos no excedan en 0.05 g por 100 g de muestra. 22

7 Figura 05: Determinación de % Humedad de las Muestras de Maca Fuente: Elaboración propia, SEHS Cálculos y Resultado s P = Peso de la muestra tomada (g) A = Peso de la muestra después de calentar (g ) Humedad (%) = P A x 100 P Medida en el espe ctro infrarrojo IR a) Preparació n del extracto acuos o Las muestras provenientes de Cerro de Pasco, fueron seleccionadas los diez cromotipos de maca. Se mando moler y se obtuvo harina de maca para la preparación del extracto se requiere 500 g de harina seca, luego se coloco en un m z conteniendo 1500 ml de agua y se dejo en ebullición por dos horas con agitación contantes, se dejo enfriar. Luego filtro el residuo obtenido de seco a temperatura ambiente y luego se llevo a leer en equipo FTIR. (Gonzales et al., 2005) 23

8 Figura 06: Preparación del extracto acuoso para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS. Figura 07: filtración del extracto acuoso para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS. 24

9 Figura 08: secado de las muestras de maca para análisis de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS Figura 09: Colocando la muestra en el equipo de IR Fuente: Elaboración propia, SEHS 25

10 Figura 10: Lectura de los espectros en el equipo de FTIR 8400S Fuente: Elaboración propia, SEHS 26

11 3.4.5 De terminación de anális is fitoquimico Muestra seca y molida (50 g) Colocar a reflujo por 1 hora en etanol a 95% y luego filtrar Concentrar la solución etanólica Ca. 15 g extraer con HCl 5% alcalinizar con NaOH al 20%, extraer con CHCl 3 y CHCl 3 : EtOH (3:2) Ext. Clorofórmico y ext. Clorofórmico: Etanólico (por separado) Ca. 20 g extraer con éter de petróleo Residuo extraer con etanol: agua (1:7) a 60 ºC Identificar Concentrar, extraer con HCl 5% Solución Acida Flavonoide s Shinoda Antraquinonas Borntrager Taninos Gelatina FeCl 3 Saponinas Espuma Alcaloide Dragendorff Mayer Fuente: Lock,

12 3.4.6 Po rcentaje de Azuc ares reductores 1. Preparació n de la muestra Pesar 25 g de muestra, licuar con 200 ml de agua y luego enrazar hasta 50 ml en un fiola volumétrica. Filtrar y tomar una alícuota de 25 ml. Tomar 25 ml de la muestra filtrada (que no contenga más de 50 mg de azúcares) en un matraz con 25 de la solución de Luff Schoorl. Añadir unas perlas de vidrio y conectar al refrigerante de reflujo. Calentar el matraz con potente llama hasta alcanzar en dos minutos la ebullición y mantener esta durante diez minutos exactamente. Enfriar con agua por 5 minutos y cuando el matraz este frío, añadir con cuidado 10 ml de yoduro de potasio, 25 ml de ácido sulfúrico y 2 ml de almidón. Valorar con tiosulfato de sodio hasta viraje del indicador (amarillento blanco). Si se hubiera empleado menos de ml de la valoración, repetir la determinación utilizando una dilución de la muestra más adecuada. 2. Cálculos Ejemplo Prueba blanco: Titulado ml de solución de Na 2 S 2 O 3 Prueba : titulado ml de solución de Na 2 S 2 O 3 Usado 4,81 ml de solución de tiosulfato es equivalente a 11,73 mg de glucosa (ver tabla 02). Consecuentemente en 2500 mg de papa contiene 11,73 mg de glucosa o como porcentaje. 100x11.73mg La papa tiene = 2500mg = 0,47% azúcar 28

13 Nota: determinar el factor de tiosulfato y tenerlo en cuenta al calcular el blanco y la muestra valorada. Tabla 2: Para 25 ml de reactivo Luff Schoorl ml de Na 2S 2O N Glucosa, fructuosa, azúcares invertidos C 6 H 12 O 6 ml Mg Diferencia 1 2,4 2,4 2 4,8 2,4 3 7,2 2,5 4 9,7 2,5 5 12,2 2,5 6 14,7 2,5 7 17,2 2,6 8 19,8 2,6 9 22,4 2, ,0 2, ,6 2, ,3 2, ,0 2, ,7 2, ,5 2, ,3 2, ,2 2, ,1 2, ,0 3, ,0 3, ,0 3, ,1 3, ,2 3, ,3 3, ,5 Fuente: Federación Internacional de Jugos y Frutas

14 3.5 Técnicas para la evaluac ión de los datos Selección de los cromotipo s La selección de los cromotipos se hizo en muestras de maca seca y fresca como se indica en los resultados (figuras) para cada uno de los análisis según procedimientos Anális is Fís ico químico y fitoquimico Se determino él % de proteínas; % humedad en muestras de maca fresca y seca, el % de materia grasa y análisis f quimico se hizo en muestras de macas secas. Siguiendo procedimientos descritos Gráficos de resultados Los resultados se muestran en tablas y figuras, comparados con la literatura existente. 30