POLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MICROBIOLOGÍA GENERAL (CAG00030) UNIDAD 2. BACTERIAS

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1 POLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MICROBIOLOGÍA GENERAL (CAG00030) UNIDAD 2. BACTERIAS CULTIVO DE LAS BACTERIAS Necesidades Nutricionales Desde los hombres hasta los microorganismos, todas las formas de vida, tienen en común determinadas necesidades nutricionales en términos de necesidades químicas para llevar a cabo su crecimiento y sus funcionales normales. 1. Todo organismo vivo necesita una fuente de energía. Algunas formas de vida, como plantas verdes, pueden consumir la energía radiante y se les denomina fototrofas. Las formas de vida incapaces de asimilar la energía radiante, por ejemplo, la vida animal, se valen de la oxidación de compuestos químicos para obtener su energía. A éstas se les denomina quimiotrofas. Entre las bacterias se encuentran los dos tipos de nutrición- 2. Todo organismo vivo necesita obtener carbono de alguna manera; todos requieren al menos pequeñas cantidades de Dióxido de Carbono, pero la mayoría de ellos necesitan de algún compuesto que tenga Carbono orgánico, como azúcar u otros carbohidratos. Mediante la fotosíntesis, las plantas absorben en Dióxido Carbónico atmosférico y lo transforman en carbohidratos. Numerosas bacterias también necesitan el CO 2 como su fuente de Carbono; desde el punto de vista de la nutrición, todos estos organismos son autótrofos. Si obtienen su energía de la luz, son fotoautótrofos; pero si la obtienen oxidando compuestos químicos, son quimioautótrofos. Otras bacterias son muy similares a los animales en cuanto a sus necesidades nutricionales ya que son incapaces de absorber el CO 2 como su única fuente de Carbono y tienen que valerse de los autotrofos y su producción de carbohidratos y otros compuestos orgánicos para tomarlos como alimento. Los organismos que necesitan de compuestos orgánicos de carbono se denominan heterótrofos. 3. Todo organismo vivo necesita obtener Nitrógeno de alguna manera. Las plantas lo asimilan en forma de sales inorgánicas como el Nitrato de Potasio, KNO 3, mientras que los animales necesitan compuestos de Nitrógeno orgánico, las proteínas y productos de su degradación, como péptidos y aminoácidos. Las bacterias son muy versátiles a este respecto; algunos tipos de ellas absorben Nitrógeno atmosférico, otras lo obtienen en compuestos de Nitrógeno inorgánico, y otras más lo toman de las proteínas o de prácticamente cualquier compuesto orgánico que lo contenga. 4. Todo organismo vivo necesita de Azufre y Fósforo, las necesidades que los animales tienen de Azufre se satisfacen mediante los compuestos orgánicos de azufre; las necesidades típicas de las plantas por el azufre se satisfacen mediante los compuestos orgánicos de azufre. Algunas bacterias necesitan compuestos orgánicos de azufre, otras son capaces de utilizar compuestos inorgánicos de azufre, y otras más inclusive, son capaces de asimilar el azufre elemental. El fósforo lo obtienen generalmente de los fosfatos. 5. Todos los organismos vivos necesitan de varios metales como Sodio, Potasio, Calcio, Magnesio, Manganeso, Hierro, Zinc, Cobre, Fósforo y Cobalto, para que puedan crecer

2 normalmente. Las bacterias no son una excepción, las cantidades de metales que requieren en algunas ocasiones son trazas. 6. Todo organismo vivo requiere de vitaminas y compuestos vitamínicos, en los animales, y también en el hombre, estos compuestos les deben ser suministrados con la dieta. También, las bacterias presentan aspectos muy variables en esta parte de la nutrición, aunque todas las bacterias necesitan de vitaminas en su proceso metabólico normal, algunas son capaces de sintetizar todas las vitaminas que necesitan a partir de otros compuestos presentes en el medio. Otras no proliferan salvo que en el medio en que se les cultiva se encuentren ya una o más vitaminas. En la tabla 6.1 se hace referencia a las vitaminas de uso más común para el crecimiento o estímulo del crecimiento bacteriano. Tabla 6.1. Necesidades vitamínicas de algunas bacterias VITAMINA CRECIMIENTO DE BACTERIAS Tiamina B 1 Bacillus anthracis Riboflavina Clostridium tetani Niacina Brucella abortus Piridoxina B 6 Lactobacillus spp. Biotina Leuconostoc mesenteroides Ácido pantoténico Proteus morganii Ácido fólico Leuconostae dextranicum Cobalamina Lactobacillus spp. Vitamina K Bacteroides melaninogenicus Tipos de nutrición De acuerdo con las características generales ya mencionadas, es posible dividir las bacterias en grupos, tomando como base sus requerimientos nutricionales. Los dos grupos mencionados previamente y llamados fototrofos y quimiotrofos, son los que tienen una separación mayor. Cada uno de esos grupos se subdivide a su vez con base a la fuente principal de energía que consumen para su crecimiento, por ejemplo, la luz o la oxidación de compuestos químicos (Tabla 6.2). Tabla 6.2. Principales tipos de nutrición de las bacterias TIPO FUENTE DE ENERGÍA FUENTE DE CARBONO Fototróficas Fotolitotróficas (autotróficas) Fotoorganotróficas (heterotróficas) Quimiotróficas Quimiolitotróficas (Autotróficas) Quimioorganotróficas (Heterotróficas) EJEMPLO DE GENERO Luz CO 2 Chromatium Luz Oxidación compuestos inorgánicos Oxidación compuestos orgánicos Compuestos orgánicos CO 2 Compuestos orgánicos Rhodopseudomona s Thiobacillus Escherichia Fototrofos: En relación a las bacterias fototróficas existen especies que consumen CO 2 como fuente principal de carbono. Éstas son denominadas fotolitotróficas. Otras necesitan un

3 compuesto orgánico, y se denominan por lo tanto fotoorganotróficas, pueden asimilar alcoholes, ácidos grasos y aminoácidos así como otros compuestos orgánicos, del carbono. Quimiotrofos: Algunas bacterias son capaces de oxidar nitritos a nitratos y finar CO 2 para satisfacer sus necesidades de carbono y energía. Otras obtienen energía de la oxidación de azufre elemental y compuestos inorgánicos de azufre, llamadas quimiolitotróficas. Muchos otros, necesitan compuestos orgánicos de carbono a partir de los cuales obtienen energía mediante oxidación, a estas especies se les llama quimioorganotróficas. A las bacterias fotolitotróficas y quimiolitotróficas se les denomina frecuentemente autótrofas. Autótrofas y heterótrofas: Los autótrofos tienen las necesidades más simples, por ejemplo, el medio de cultivo que se ilustra en la tabla 6, permite el crecimiento de bacterias autotróficas que oxidan azufre. Tabla 6.3. Medio de cultivo de tipo autotrófico Azufre en polvo 10 g (NH 4 ) 2 SO 4 0.4g KH 2 PO g CaCl g MgSO 4.7H 2 O 0.5g FeSO g Agua 1000 ml CO 2 Los medios de cultivo para otras bacterias autotróficas se parecen a la fórmula, pero se diferencian en que ciertos compuestos químicos específicos deben ser sustituidos o agregados para reconocer las necesidades específicas de las especies. Las bacterias heterótrofas están más relacionadas con el hombre, animales y plantas; constituyen uno de los grupos más importantes, varían considerablemente en cuanto a sus necesidades de nutrientes específicos para el desarrollo (Tabla 6.4). Todas necesitan de Carbono orgánico ; sin embargo, hay una gran diversidad manifiesta en lo que respecta a las necesidades de Nitrógeno, algunas se satisfacen con el Nitrógeno atmosférico, otras lo hacen con compuestos nitrogenados inorgánicos y otras más necesitan de uno o más compuestos orgánicos nitrogenados. Tabla 6.4. Necesidades nutricionales mínimas de algunas bacterias heterotróficas. BACTERIA SALES C ORG. N 2 INORG. AA DOS O UNA INORG. MAS AAS VIT. DOS O MÁS VITA. Escherichia coli X X X Salmonella typhi X X X X Proteus vulgaricus X X X X X Staphylococcus aureus X X X X X Lactobacillus acidophilus X X X X X

4 MEDIOS BACTERIOLOGICOS Los medios de cultivo pueden ser de composición química conocida (medios sintéticos o definidos químicamente), los cuales se han diseñado para el cultivo de tipos específicos de bacterias conocidas. Se necesita un gran número de sustancias químicamente puras para cultivar bacterias que tengan necesidades nutricionales como los Lactobacillus. Aunque para el cultivo de bacterias heterótrofas en laboratorios de rutina, generalmente se basan en medios de cultivo sintéticos. En lugar de esto, se utilizan ciertos materiales crudos como peptonas, extracto de carne y extracto de levadura (Tabla 6.6) y así el medio de cultivo que se obtiene hace posible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos. Tabla 6.6. Composición del caldo y el agar nutritivo. Caldo nutritivo Extracto de carne 3 g Peptona 5 g Agua 1000 ml Agar nutritivo Extracto de carne 3 g Peptona 5 g Agar 15 g Agua 1000 ml Cuando se desea un medio de cultivo sólido se toma el agar como agente solificante. A continuación se hace una descripción de estos materiales crudos, a partir de estos ingredientes es posible preparar un medio capaz de permitir el crecimiento de muchas bacterias heterótrofas: Extracto de carne: Extracto acuoso de carne magra de res concentrado en pasta, contiene las sustancias solubles en agua de tejidos animales, entre ellas carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales. Peptona: Es el producto que resulta de la digestión de materiales proteínicos, por ejemplo, carne, caseína y gelatina, la digestión del material proteínico se efectúa con ácidos o enzimas; sirven para hacer medios de cultivo bacteriológicos, diferentes tipos de peptonas. Es la fuente principal de Nitrógeno orgánico, puede contener también algunas vitaminas y algunas veces carbohidratos, esto en relación a la clase de material proteínico digerido. Agar: Son carbohidratos complejos obtenidos de ciertas algas marinas, procesadas para eliminar sustancias extrañas. Se usa como agente solidificante de los medios de cultivo, se disuelve en solución acuosa, gelifica cuando la temperatura baja de 45ºC, no se considera agar como nutriente para las bacterias. Extracto de levadura: Es un extracto en solución acuosa de levaduras, se obtiene comercialmente en polvo, es una fuente muy rica en vitaminas B, también contiene Nitrógeno orgánico y compuestos de carbono. Tipos de medios de cultivo Aunque muchos heterótrofos se desarrollan bien en agar nutritivo o caldo nutritivo, otros no crecen bien, y otros más, simplemente no se desarrollan.

5 Medios enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los heterótrofos exigentes. Medios selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias químicas específicas, no permitirá el desarrollo de un grupo de bacterias, sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones especificas previene el crecimiento de bacterias gram positivas sin afectar el desarrollo de bacterias gram negativas. De manera similar, un medio en el cual la única fuente de carbono sea la maltosa, permite seleccionar las bacterias que pueden asimilarla. En principio, se puede seleccionar las bacterias que solo se desarrollen en presencia de compuestos orgánicos poco comunes agregando dichos compuestos al medio de cultivo y omitiendo todos los demás compuestos de carbono. Medios diferenciales: La adición de ciertos compuestos reactivos o sustancias químicas a los medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios, después de la siembra e incubación del medio, lo cual permite al observador diferenciar distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, si se siembra una mezcla de bacterias en un medio agar-sangre, algunas de las bacterias pueden destruir los glóbulos rojos, mientras que otras no lo hacen. Cuando aparece una zona clara alrededor de la colonia bacteriana es indicativo de que ocurre la hemolisis. Así es posible distinguir entre bacterias hemolíticas y no hemolíticas que proliferan en el mismo medio. De hecho, el medio agar-sangre sirve simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial. Medios de prueba: Para el ensayo de vitaminas, aminoácidos y antibióticos, se utilizan medios de cultivo de composición conocida. Así mismo, se recurre a medios de composición especial para probar desinfectantes. Medios para cuenta bacterias: Para determinar el contenido bacteriano de sustancias tales como leche y agua, se emplean ciertos tipos específicos de medios de cultivo. Se debe señalar su fórmula, así como las especificaciones prescritas. Medios de mantenimiento: Para preservar satisfactoriamente las características fisiológicas la viabilidad de un cultivo, quizás se requiera de un medio diferente de aquellos que son óptimos para el crecimiento. El crecimiento rápido y prolítico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Por ejemplo, la adición de glucosa a un medio de cultivo, con frecuencia exacerba el crecimiento, y probablemente se produce ácido. En un medio de mantenimiento, es preferible suprimir la glucosa. En relación con su estado físico se pueden establecer diferencias más amplias entre los medios. Se emplean ocasionalmente, Medios sólidos: Como las rebanadas de papas, para cultivos especiales de bacterias. Medios sólidos reversibles a líquidos: se ejemplifican con el agar nutritivo. Medios semisólidos: Contienen pequeñas cantidades de agar, el cual le imparte una consistencia de natilla, por ejemplo, caldo nutritivo y leche desnatada. Preparación de los medios de cultivo Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias comunes. En relación con esto, se usa la leche desnatada y no entera. Los materiales, en su forma natural, no presentan

6 ningún problema para tomarlos como medio de cultivo ya que simplemente se depositan dentro de los envases adecuados, los cuales deben ser previamente esterilizados. Los medios de cultivo que se preparan del tipo agar o caldo nutritivos, se hacen mezclando los ingredientes individuales necesarios, o de manera más práctica agregando agua a productos deshidratados que contienen todos los ingredientes. En la preparación de medios de cultivo se deben seguir los siguientes pasos: 1. Cada ingrediente, o el medio deshidratado completo, se debe disolver en un volumen de agua destilada adecuado. 2. Se determinará el ph del medio y si es necesario se ajustará. El ph se determina por medio de indicadores o potenciómetros. 3. El medio se pondrá en recipientes adecuados, cuyas bocas se cierran con tapones de algodón, plástico o cubiertas de metal. 4. Los medios se esterilizan generalmente en autoclaves. Condiciones físicas necesarias para el desarrollo Además de conocer los nutrientes apropiados necesarios para el cultivo de bacterias, también conviene conocer las condiciones físicas del medio en donde el microorganismo puede desarrollarse mejor. Así como las bacterias varían ampliamente en relación a sus necesidades nutricionales, también muestran respuestas diversas a las condiciones físicas del medio. Dicho de otra manera, para un buen cultivo de las bacterias se necesita combinar apropiadamente los nutrientes necesarios y las condiciones físicas adecuadas. 1. Temperatura El proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la velocidad con que se efectúan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrón de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condición. La temperatura, puede en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo total de los microorganismos. Las variaciones de temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. De acuerdo con esto las bacterias se pueden dividir en: Psicrófilas: Capaces de desarrollarse a 0 C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas superiores, cercanas a 15 o 20 C. Muchas de las especies aisladas en la Antártida se encontraron en proliferación a -7 C, pero se desarrollan en forma óptima entre 20 y 30 C. Mesófilas: Crecen mejoren límites de temperatura que están entre 25 y 40 C. Termófilas: Crecen mejor entre 45 y 60 C, los límites de desarrollo de algunas bacterias termófilas se extienden a la región mesofílica. A esas especies se les conoce como termófilas facultativas. Otras que pertenecen a las termófilas crecen mejor a temperaturas superiores a 60 C, se les conoce como termófilas verdaderas. La temperatura óptima de crecimiento es la temperatura de incubación que permite el desarrollo bacteriano en un periodo corto.

7 2. Condiciones de Oxigeno y CO 2 Son los principales gases que afectan el desarrollo bacterias, éstas presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre, y sobre esta base se dividen en 4 grupos: Aerobias: Bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. Anaerobias: Bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. Anaerobias facultativas: Bacterias que se desarrollan tanto en presencia o ausencia de oxígeno libre. Microaerófilas: Bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre. 3. Acidez o Alcalinidad (ph) En la mayor parte de las bacterias el ph óptimo de crecimiento está entre 6.5 y 7.5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse a ph extremos, en la mayor parte de las especies los límites mínimos y máximos corresponden a cualquier punto entre ph 4 y ph 9.