REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE LOS CARBOHIDRATOS

Transcripción

1 REACCINES DE IDENTIFICACIÓN Y PRPIEDADES DE LS CARBHIDRATS bjetivos Al finalizar este trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: - Detectar la presencia de carbohidratos en una muestra problema. - Identificar carbohidratos según su poder reductor. - Aplicar reacciones específicas que permitan la identificación de carbohidratos en una muestra problema. - Caracterizar carbohidratos según los resultados de la marcha analítica practicada. Introducción Los carbohidratos representan un conjunto numeroso de moléculas distribuidas ampliamente en la naturaleza. Químicamente se definen como aldehídos o cetonas polihidroxiladas, diferenciándose entre ellos básicamente en el número de carbonos y en la ubicación espacial de los grupos hidroxilo de cada monómero, así como en el número de monosacárido que los conforman. Basándose en las diferencias estructurales que éstos presentan, es posible la identificación de los mismos utilizando reacciones químicas que demuestren alguna propiedad química específica del carbohidrato cuya presencia se quiere determinar. Las pruebas para la determinación de los carbohidratos pueden ser generales como la reacción de Molisch, la cual no discrimina el tipo de carbohidrato analizado, o específicas si el resultado final logra la identificación de un carbohidrato en particular. Independientemente de la prueba a que se haga referencia, existen dos propiedades que sirven de fundamento a la mayoría de éstas. La primera es la 1

2 formación en medio ácido de compuestos conocidos como derivados furfúricos. Estos se producen al deshidratar los azúcares mediante la aplicación de calor y la exposición a un medio fuertemente ácido. A continuación se muestran tres ejemplos de la reacción de formación de furfurales. Pentosas (C 5 H 10 5 ) CH furfural Hexosas (C 6 H 12 6 ) H 2 CH CH 5-hidroximetilfurfural 6-Desoxihexosas (C 6 H 12 5 ) H 3 C CH 5-metilfurfural Estos derivados furfúricos reaccionan con compuestos fenólicos como el á-naftol, el orcinol, el resorcinol o la antrona, para formar cromógenos que evidencian la positividad de las reacciones. El tipo de compuesto fenólico utilizado dependerá del tipo de carbohidrato a determinar y por lo tanto de la reacción que se esté realizando. Existe otra propiedad que permite la diferenciación de algunos carbohidratos: el poder reductor. Existen carbohidratos que al oxidarse permiten la reducción de otros compuestos. Durante dicha oxidación se libera la energía necesaria para la reducción 2

3 de otra molécula, por lo que se conoce este proceso como oxido-reducción y ocurre como una reacción acoplada. La mayoría de los reactivos que permiten evidenciar esta propiedad contienen cobre. Este metal se reduce (gana electrones) y se hace insoluble originando un precipitado rojo, lo que demuestra que el carbohidrato analizado es reductor. A pesar de que estas sean las propiedades más importantes en las que se basan muchas pruebas para la determinación de carbohidratos, existen otras determinaciones como la capacidad de rotar la luz polarizada, la formación de osazonas, entre otras, que nos abren nuevas posibilidades y recursos, útiles en la identificación de estas biomoléculas. MATERIALES Y EQUIPS - Tubos de ensayo. - Gradillas. - Pipetas graduadas. - Baño de María a 100 C. - Goteros. - Pinzas para tubos de ensayo. REACTIVS - α -naftol al 0,5% en etanol. - Ácido sulfúrico concentrado. - Glucosa, fructosa, almidón, sacarosa, maltosa, muestra problema - Reactivo de Benedict: preparar combinando las siguientes soluciones: Solución A: 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio se disuelven en 800 ml de agua destilada Solución B: disolver 17,3 g de CuS 4 : 5 H 2 en 100 ml de agua destilada. Mezclar ambas soluciones y aforar a 1 L con agua. - Reactivo de Barfoed: disolver 66,6 g de acetato de cobre en 800 ml de agua destilada. Agregar 9 ml de CH 3 CH glacial y filtrar en caliente. Aforar a 1L 3

4 - Reactivo de Bial: disolver 0,3 g de orcinol en 100 ml de HCl concentrado. Agregar 0,3 ml de cloruro férrico (FeCl 3 ) al 10%. - Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,05 g de resorcinol en 33 ml de HCl concentrado. Aforar a 100 ml con agua destilada. - Solución diluida de yodo-yoduro de potasio en agua. Experimento Nº 1: Reacción de Molisch Detecta la presencia de carbohidratos en general, se basa en la formación de derivados furfúricos en medio ácido a temperatura ambiente o en caliente, los cuales reaccionan con un compuesto aromático (α-naftol) para dar como productos compuestos coloreados. La reacción de Molisch ocurre al condensarse dos moléculas de á-naftol con la función aldehído del 5-hidroximetilfurfural producido al calentarse el carbohidrato en medio fuertemente ácido, como se muestra a continuación. H alfa-naftol H 2 HC R C R + RCH H intermediario H Cromógeno violeta Prueba de Molisch: 2.- Coloque en el tubo de ensayo N 1 2 ml del carbohidrato, y en el tubo N 2 vierta 2 ml del compuesto desconocido. 3.- Agregar a cada tubo 4 gotas de solución alcohólica de α - naftol al 15%. 4

5 4.- Agregar con cuidado 1 ml de ácido sulfúrico concentrado por las paredes de ambos tubos de ensayo. 5.- La formación de un anillo violáceo indica la presencia de carbohidratos. Experimento Nº 2: Reacción de Bial Esta reacción detecta la presencia del furfural producido en medio ácido por las pentosas. El reactivo de Bial contiene orcinol disuelto en HCl concentrado. El ácido provoca la formación del furfural y el orcinol se condensa con este último para producir cromógenos de color verde-azul. CH furfural + CH 3 2 HCl H H H FeCl 3 orcinol H H 3 C H C CH 3 H Cromógeno verde-azul H Prueba de Bial: 2.- Agregar 2 ml del carbohidrato al tubo 1 y 2 ml del compuesto desconocido al tubo Colocar 2 ml de reactivo de Bial a los dos tubos. 4.- Calentar los tubos en baño de agua hirviente por 5 minutos. 4.- La reacción es positiva cuando aparece una coloración azul-verdosa que indica la presencia de pentosas. Experimento Nº 3: Reacción de Seliwanoff Con el mismo principio de la reacción anterior, esta se basa en la formación de derivados furfúricos. En este caso el 5-hidroximetilfurfural, producto de la deshidratación de las cetohexosas, es detectado por un derivado fenólico conocido 5

6 como resorcinol. El resultado es positivo tanto para las cetohexosas en forma monomérica, como para oligosacáridos que contengan cetohexosas en su estructura. HH 2 C CH + 5-hidroximetilfurfural 2 H H resorcinol H CH 2 H Cromógeno rojo Prueba de Seliwanoff: 2.- Agregar con la ayuda de una pipeta 4 gotas del carbohidrato al tubo 1 y 4 gotas del desconocido al tubo Colocar 5 ml de reactivo de Seliwanoff en ambos tubos de ensayo. 4.- Calentar en agua hirviente. 5.- La reacción es positiva al aparecer un color rojo intenso en forma de precipitado, indicando la presencia de cetohexosas. Pruebas para la detección de carbohidratos o azúcares reductores: Como se mencionó en la introducción de esta práctica, existen varias pruebas que permiten determinar si los carbohidratos presentan poder reductor y así, junto a los resultados de todas las pruebas en conjunto, lograr su identificación. El principal grupo de pruebas de azúcares reductores incluyen: Benedict, Barfoed, Fehling, Trommens, entre otras. En el presente trabajo práctico se hará referencia a las dos primeras. 6

7 Experimento Nº 4: Reacción de Benedict Esta reacción nos indica si un azúcar es o no reductor. Para tal fin el carbohidrato se hace reaccionar con el ión cúprico (Cu ++ ) en medio alcalino y a una temperatura de 100 C. El carbohidrato, a través de su hemiacetal libre en el carbono 1, se oxida favoreciendo la reducción del cobre a oxido cuproso (Cu 2 ) el cual se presenta como un precipitado rojo. RC 2Cu H - RC Cu 2 + 2H 2 precipitado rojo Prueba de Benedict: 2.- Añadir 8 gotas del carbohidrato al tubo 1 y 8 gotas del compuesto desconocido al tubo Colocar 5 ml de reactivo de Benedict en ambos tubos. 4.- Calentar en agua hirviente durante 5 minutos. La reacción es positiva al aparecer un precipitado rojo ladrillo, indicando ésto la presencia de sustancias reductoras. Experimento Nº 5: Reacción de Barfoed Aunque el fundamento de la reacción de Barfoed es similar al de la reacción de Benedict, la primera nos permite diferenciar si estamos en presencia de un monosacárido o un disacárido reductor. Para lograr esta diferenciación el cobre se encuentra disuelto en un medio ligeramente ácido, retardando la aparición del Cu 2 unos cinco minutos en el caso de los monosacáridos. La tardanza será mayor para los disacáridos, que puede llegar a ser de 15 minutos o más. RC 2Cu H 2 RC Cu precipitado rojo 7

8 Prueba de Barfoed: 1.- Rotule tres tubos de ensayo (1, 2 y 3) 2.- Colocar 2 ml de una solución de monosacárido reductor en el tubo 1, 2 ml de una solución de disacárido reductor en el tubo 2 y 2 ml del desconocido en el tubo Agregar 2 ml de Reactivo de Barfoed a todos los tubos. 4.- Calentar en baño de agua hirviente. Tome nota del tiempo y observe los tubos cada 5 minutos. 5.- La reacción es positiva, al observarse un precipitado rojizo en el fondo del tubo. Los monosacáridos dan la reacción con mayor rapidez que los disacáridos. Experimento Nº 6: Reacción de Lugol Se emplea para comprobar la presencia de polisacáridos y nos permite tener una idea de cual de ellos se trata. Se basa en poner en contacto el carbohidrato con yodo; si se obtiene un color azul intenso, se trata de almidón, dicha coloración desaparece calentando a ebullición y reaparece al enfriar debido a que la estructura helicoide del polisacárido se desordena por efecto del calor y se reordena al enfriarse. De esto se deduce que la relación entre el yodo y el almidón es de adhesión y no hay formación de enlaces químicos permanentes. Si la coloración obtenida es rojiza el polisacárido presente es el glucógeno. Prueba de Lugol: 2.- Colocar 5 ml del carbohidrato en el tubo 1 y 5 ml del desconocido en el tubo Añadir 2 gotas de una solución diluida de yodo-yoduro de potasio a ambos tubos. Mezclar. 4.- bserve la coloración. Si ésta es azul, caliente el tubo en agua hirviente por 2 min. y observe. Deje enfriar y observe nuevamente. 8

9 AUTEVALUACIÓN 1. Qué utilidad tiene la reacción de Molisch en la identificación inicial de una muestra desconocida? 2. Existen reacciones que permiten identificar polisacáridos. Mencione una de ellas e indique su fundamento bioquímico. 3. Realice un esquema donde indique la conducta a seguir en la identificación de un carbohidrato desconocido. 4. Al calentar el tubo donde se realizó la prueba del yodo y se obtuvo un resultado positivo desaparece el color azul que se forma durante la misma. Por qué ocurre dicho fenómeno? 5. La formación de furfurales es determinante en algunas reacciones de identificación de carbohidratos, qué condiciones son necesarias para que se formen dichos compuestos? Pueden formarse furfurales a partir de otro tipo de biomoléculas distintas a los carbohidratos? Razone su respuesta. BIBLIGRAFÍA Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España, J.M. Clark. Bioquímica experimental Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques. Saunders editores Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press