PESTE PORCINA CLÁSICA (CÓLERA DEL CERDO)

Transcripción

1 CAPÍTULO PESTE PORCINA CLÁSICA (CÓLERA DEL CERDO) RESUMEN La peste porcina clásica (PPC), también denominada cólera del cerdo, es una enfermedad vírica contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del género Pestivirus de la familia Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV). La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crónico, de aparición tardía o inaparente, dependiendo de varios factores víricos y del hospedador, siendo los más importantes la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infección (pre- o post-natal). Los cerdos adultos suelen mostrar menos síntomas graves de la enfermedad que los jóvenes y tienen mayor probabilidad de supervivencia. En cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera placentaria e infectar los fetos. La infección intrauterina con cepas del virus de baja o moderada virulencia origina lo que se conoce como el síndrome de la "cerda portadora", que se caracteriza por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada aparentemente "sana" pero infectada. Un brote de PPC tiene graves consecuencias económicas para el mercado de los cerdos y de productos derivados. La elevada variabilidad clínica de la PPC dificulta a menudo el diagnóstico realizado sobre bases clínicas y patológicas. Los métodos de laboratorio son por tanto esenciales para un diagnóstico inequívoco. La detección del virus en la sangre y de anticuerpos en el suero son los mejores métodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la detección del virus o de antígeno en muestras de órganos resulta más adecuada en cerdos muertos. Identificación del agente: Para la detección del antígeno de la PPC se utiliza la inmunofluorescencia directa (FAT) en cortes de órganos de cerdos afectados. Para determinar si la fluorescencia se debe a antígenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean varios anticuerpos monoclonales. El aislamiento del CSFV se debe intentar en la línea celular de riñón de cerdo (PK-15) o en otra línea celular adecuada. Los cultivos se examinan en cuanto a crecimiento vírico por inmunofluorescencia o tinción con inmunoperoxidasa; los aislamientos positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciación génica parcial. En varios laboratorios, para la identificación del ácido nucleico del CSFV se utilizan protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa. El aislamiento y la caracterización de cepas patógenas sospechosas deben realizarse en un laboratorio con medidas de seguridad adecuadas para trabajar con virus. Pruebas serológicas: La detección de anticuerpos específicos contra el virus es particularmente útil en piaras donde se sospecha una infección por CSFV iniciada al menos 30 días antes. Los métodos serológicos son también adecuados para el control y para estudios de prevalencia, y resultan esenciales en el caso de que un país desee el reconocimiento internacional de estar exento de la enfermedad en ausencia de vacunación. Como en los cerdos de cría se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran reacción cruzada con Pestivirus de rumiantes, las pruebas de análisis deben acompañarse de pruebas confirmativas que sean específicas para CSFV Algunas pruebas ELISA son relativamente específicas para CSFV pero la prueba de neutralización comparativa es el método definitivo de diferenciación, y compara el nivel de anticuerpo frente a diferentes especies de Pestivirus. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas contra la PPC contienen un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a través de hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La producción de estas vacunas 266 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

2 con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inóculos que se ha validado respecto a identidad vírica, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad. Si se utiliza CSFV para la producción de vacunas o en estudios de infección experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de la OIE para patógenos del Grupo 4 de Contención. No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completo inactivado. Recientemente, se han desarrollado "vacunas marcadoras" que, en contraste con las vacunas con MLV, inducen anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una prueba diagnóstica de acompañamiento. Las "vacunas marcadoras" registradas en la actualidad se basan en la principal glicoproteína de la envoltura vírica del CSFV (subunidad E2), y se producen en insectos mediante la tecnología de ADN recombinante. A. INTRODUCCIÓN Los virus que causan la peste porcina clásica (PPC), la diarrea vírica bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera (EF) son miembros de la familia Flaviviridae, del género Pestivirus, y están estrechamente relacionados entre sí tanto antigénica como estructuralmente. Los síntomas clínicos y las lesiones observadas post-mortem en los cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores del virus y de los hospedadores. Además, las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad clínica que es indistinguible de la PPC (22, 24, 25). Los síntomas más destacados de la enfermedad son su aparición en todos los grupos de edad, acompañada por pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreñimiento seguido de diarrea y una forma de andar vacilante. Varios días después de la aparición de los síntomas clínicos, las orejas, el abdomen y la parte interna de los muslos pueden mostrar una decoloración morada. Los animales con enfermedad aguda mueren en 1-2 semanas. La muerte súbita en ausencia de enfermedad clínica no es sintomática de la PPC. En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condición, así como con la cepa de virus implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crónica y durar 2-4 semanas o incluso meses. La enfermedad crónica acarrea una disminución del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las infecciones congénitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos lechones de la piara. Los síntomas clínicos son inespecíficos: debilidad en ausencia de pirexia. Las infecciones crónicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas de mortalidad en la piara pueden superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una característica es una leucopenia generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparición de la fiebre. La inmunosupresión puede acarrear infecciones concurrentes. En casos agudos, las lesiones patológicas grandes son a menudo poco llamativas o están ausentes. En los casos típicos, los nódulos linfáticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en el epicardio, en los riñones, la vejiga urinaria, la piel y la subepidermis. En los casos subagudos y crónicos, además de las lesiones anteriores, pueden observarse úlceras necróticas o en "botón" en la mucosa del tracto gastrointestinal, la epiglotis y la laringe. Los hallazgos histopatológicos no son patognomónicos. Las lesiones pueden incluir una degeneración parenquimatosa del tejido linfático, proliferación celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no supurativa, con o sin desgarro vascular. B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO La variabilidad de los síntomas clínicos y de las lesiones post-mortem no suministran una evidencia firme para establecer un diagnóstico inequívoco. Otras enfermedades víricas, como la peste porcina africana, el síndrome de debilidad multisistémica post-destete, la dermatitis porcina y el síndrome de nefropatía, así como situaciones septicémicas de tipo salmonelosis, pasteurelosis, actinobacilosis e infecciones con Haemophilus suis, pueden confundirse con la PPC. De hecho, estas bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento de estos patógenos puede enmascarar al virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad, Por tanto, un diagnóstico presuntivo basado en síntomas clínicos y en lesiones post-mortem debe confirmarse con investigaciones en el laboratorio. Así las pruebas laboratoriales de diagnóstico van a ser fundamentales considerando las graves consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado porcino y de productos derivados. Manual de la OIE sobre animales terrestres

3 Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el ácido nucleico vírico o los antígenos víricos, o bien a la detección de anticuerpos específicos. Para una interpretación correcta de los resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atención particular a la presentación simultánea y agrupada de dos o más de los síntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente. Para el diagnóstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Sino que como uno de los primeros síntomas de la PPC es la pirexia y se acompaña por viremia (6), el método pertinente para detectar piaras infectadas en una fase temprana es la toma de muestras en animales febriles para la detección de virus en sangre con etilén-diamino tetra-acético (EDTA), o en tejidos. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de sangre de un grupo mayor de cerdos para detección de los virus. La PPC está bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersión desde el laboratorio: en consecuencia, debe realizarse un análisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el diagnóstico y la caracterización del virus. La instalación debe cumplir los requisitos del Grupo de Contención apropiado según determina la estimación de riesgos resumida en el Apéndice I del Capítulo I.1.6. de este Manual. Los países sin acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberían enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE. Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal superviviente. Las muestras para detección de anticuerpo se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados) cuando hayan transcurrido > 30 días desde que ocurrió el contacto sospechado con un brote confirmado, utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto. 1. Identificación del agente a) Métodos inmunológicos Prueba de inmunofluorescencia La prueba de inmunofluorescencia (FAT) es una prueba rápida que puede utilizarse para detectar el CSFV en cortes finos de amígdalas, bazo, riñón, nódulos linfáticos o porciones distales del íleon. Los tejidos deben recogerse de varios animales (3) y transportarse sin conservantes en frío, pero no congelados. Los cortes se tiñen directamente con inmunoglobulina anti-ppc conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de fluorescencia. El tejido de las amígdalas es el más adecuado durante la primera fase de la infección, ya que es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infección (18). En casos subagudos y crónicos, el íleon es con frecuencia positivo y a veces puede ser el único tejido que muestre fluorescencia. Un resultado negativo por FAT no elimina por completo la presencia de infección de PPC. Cuando se mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener más muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo celular (por ejemplo, en riñón porcino [PK-15] u otra línea celular de origen porcino que sea sensible y que se conozca que está libre de contaminación con Pestivirus). Procedimiento de la prueba En cada serie de muestras de órganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo. i) Se corta un trozo de las amígdalas, bazo, riñón o íleon, de aproximadamente 1 x 1 x 0,5 cm, y se monta con un compuesto criostático o con agua destilada en un criostato. ii) Se congela el trozo de órgano en el criostato. iii) Se cortan secciones de un grosor menor de 4 µm y se montan en cubres libres de grasa de 10 x 32 mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posición (por ejemplo, arriba a la derecha). iv) Después de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analítico) durante 10 minutos a temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37 C. v) Los cortes se sumergen brevemente en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el exceso de líquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en una cámara de incubación húmeda con un pequeño volumen de agua colocada en el fondo de la cámara. vi) vii) Se deposita la solución de trabajo de inmunoglobulina anti-ppc en los cortes y se incuban en la cámara cerrada durante 30 minutos a 37 C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se añade la dilución de trabajo del conjugado con FITC, incubándose como se ha descrito antes. Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente. 268 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

4 viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampón de montaje en un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta). ix) Se elimina el exceso del líquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra células con fluorescencia verde brillante. En las amígadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la línea epitelial de las criptas. En cortes de riñón, la fluorescencia es más abundante en los túbulos proximales y distales del córtex renal y en los conductos colectores de la médula. En el íleon, la fluorescencia es más destacable en las células epiteliales de las glándulas de Lieberkünhn, mientras que en el bazo la reactividad es más difusa, con concentraciones de células linfoides en la lámina linfoide periarterial (PALS). La FAT requiere utilizar una inmunoglobulina anti-ppc preparada de un anticuerpo policlonal contra el CSFV que no distingue entre los antígenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para FAT en cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-csfv de cerdos libres del patógeno específico. La dilución de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un máximo de brillo con un mínimo de fondo. Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los nódulos linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amígdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV pueden dar la prueba FAT positiva 2 semanas después de la vacunación (15, 19). La inoculación en conejo se utiliza para diferenciar entre cepas de CSFV adaptadas a conejo y cepas de campo. A diferencia de las cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reacción febril e inducen una respuesta inmune en conejos cuando se suministran intravenosamente.csfv adaptadas a conejo. En la prueba FAT, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas. Las infecciones congénitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar síntomas clínicos y lesiones patológicas indistinguibles de las presentes en la PPC crónica (22, 24, 25). Las infecciones por CSFV o pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros animales en contacto con un lechón FAT-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Otro método de distinguir estos virus es por inoculación de lechones seronegativos con una suspensión de material sospechoso y realizar 5 semanas después pruebas de neutralización vírica (NV) en sus sueros para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios días y los métodos de inoculación en animales duran varias semanas. Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa La utilización de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de rábano (HRPO) o con FITC, o usados en conjunción con un conjugado anti-ratón, que sean capaces de detectar de modo específico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitirían, por una parte, una diferenciación inequívoca entre las cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (10, 26, 28). Un prerequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti- PPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única confirmación de que un aislamiento corresponde a PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el país. No hay ningún MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En áreas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-ppc conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como única confirmación de que un aislamiento corresponde a PPC. Procedimiento de la prueba i) Cortar ocho o más secciones (4 µm) de las amígdalas que son positivas por FAT, o de otro órgano positivo si no se dispone de amígdalas. ii) Fijar los cortes con acetona (grado análitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire. iii) Preparar diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01% de Tween 80 + suero de caballo al 5%, ph 7,6. (también puede utilizarse MAb conjugado con FITC, así como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario). iv) Después de lavar con PBS, se depositan en la dilución de trabajo del conjugado monoclonal respectivo dos cortes, y otros dos en la dilución de trabajo del conjugado policlonal (controles). Manual de la OIE sobre animales terrestres

5 v) Incubar durante 1 hora a 37 C en una cámara húmeda. vi) Lavar seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez. vii) Teñir los cortes con solución recién preparada de cromógeno del substrato * durante 5-15 minutos a temperatura ambiente. viii) Lavar los cortes con acetato sódico 0,05 M, ph 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para microscopía. ix) Examinar las secciones en un microscopio de fondo claro. La tinción del citoplasma de las células del epitelio de las criptas de las amígdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo. x) Interpretación de la prueba: Anticuerpo policlonal Anticuerpo monoclonal específico para Cepa PPC Cepa PPC vacunal Cepa DVB/EF Interpretación + + PPC cepa de campo PPC cepa vacunal + + Cepa DVB/EF + Otros Pestivirus*, no PPC * Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de PPC y cualquier aislamiento de casos en que se sospeche PPC debería enviarse al laboratorio de referencia de la OIE. Prueba de captura de antígeno Para un diagnóstico rápido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura de antígeno (ELISAs) para analizar piaras que se sospechan infectadas recientemente. Las pruebas ELISA son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra varias proteínas víricas en el suero, en la fracción leucocitaria de la sangre o en sangre completa anticoagulada (puede añadirse aquí un homogenado tisular clarificado ya que es un material adecuado para ELISA) (7). La técnica es de realización relativamente simple, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se puede automatizar y puede dar resultados en medio día. La desventaja de que es menos sensible que el aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclínicos, puede compensarse probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse también en cuenta la baja especificidad de estas pruebas. b) Aislamiento de virus El aislamiento de virus en cultivos celulares es un método de diagnóstico de PPC más sensible, pero más lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento de realiza mejor en células PK-15, que se dividen rápidamente, y que se siembran sobre cubres simultáneamente con una suspensión de las amígadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras líneas celulares, pero deberían ser por lo menos tan sensibles como las células PK-15. Los cultivos se examinan para focos fluorescentes por FAT después de horas. Para fines diagnósticos, el órgano más adecuado para aislar el virus de cerdos muertos o sacrificados son las amígdalas. Alternativamente, se puede utilizar el bazo, el riñón o nódulos linfáticos. * Solución de cromógeno del substrato A. Solución base de cromógeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto TÓXICO. B. Acetato sódico 0,05 M, ph 5,0; 19 ml (esterilizados por filtración con membrana). C. Solución base de substrato (peróxido de hidrógeno al 30%). Mantener las soluciones base A y C a 4 C en oscuridad y la solución B a temperatura ambiente. La solución base A puede mantenerse a 4 C durante al menos 6 meses y la solución C por 1 año. Inmediatamente antes de uso, diluir 1 ml de la solución A en 19 ml de la solución B. Añadir después 10 µl de la solución base C. Mezclar bien y teñir los cortes. 270 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

6 Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente: i) Preparar una solución base concentrada 100 veces de glutamina-antibiótico: disolver glutamina (2,92 g) en 50 ml de agua destilada (solución A) y esterilizar por filtración. Disolver cada uno de los siguientes antibióticos en 5-10 ml de agua destilada estéril: penicilina (10 6 Unidades Internacionales [UI]; estreptomicina (1 g); mycostatín (5 x 10 5 U); polimixina B (15 x 10 4 U); y kanamicina (1 g). Juntar estas soluciones (solución B). Mezclar asépticamente las soluciones A y B, completar hasta 100 ml con agua destilada estéril y guardar a -20 C en alícuotas de 5 ml. ii) iii) iv) Cortar en trozos pequeños 1-2 g de tejido y moler en un mortero con arena estéril y un pequeño volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homogénea. Alternativamente, se puede utilizar una trituradora a 4 C. Hacer una suspensión al 20% (p/v) añadiendo solución salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio mínimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensión, se añade 1 ml del base de glutamina-antibiótico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 1 hora. Centrifugar a g durante 15 minutos v) Se tripsiniza una monocapa de células PK-15, se centrifuga la suspensión celular a 160 g durante 10 minutos y se resuspende para que contenga 2 x 10 6 células/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra pestivirus; y 0,2 ml de la solución stock de glutamina-antibiótico por cada 10 ml de la suspensión celular). vi) Mezclar nueve partes de la suspensión celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso (iv)) e inocular 1,0-1,5 ml en 6-8 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con sólo 1,0-1,5 ml de suspensión celular. Después de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminación con esta suspensión vírica positiva. También deben prepararse cultivos negativos. vii) En los días 1, 2 y 3 post-inoculación, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan con acetona fría (de grado analítico) durante 10 minutos, y se tiñen con un conjugado directo anti- CSFV a la dilución de trabajo apropiada, o bien se tiñen indirectamente, como se describe en la Sacción B.1.a. Si la suspensión de amígdalas al 2% resulta tóxica para las células, la prueba debe repetirse utilizando una dilución mayor u otro órgano. viii) Después de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, ph>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia. En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden usarse también para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulación de fondo plano o placas M24. En tal caso, las placas se fijan y se tiñen como se describe más adelante para la prueba de neutralización ligada con peroxidasa (NPLA). La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clínicamente enfermos es una muestra adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fracción de leucocitos u otros componentes, pero por razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (9). El procedimiento es el siguiente: i) Congelar una muestra de sangre completa a -20 C y descongelar en un baño a 37 C. ii) iii) iv) Inocular 300 µl de sangre hemolizada en una monocapa de células PK-15 crecidas hasta un 75% de confluencia * en una placa M24, y permitir la adsorción durante 1 hora a 37 C. Eliminar el inóculo, lavar la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y añadir medio de cultivo. Después de una incubación de 3-4 días, las placas se lavan, se fijan y se tiñen, como se describe más adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 µl para compensar la mayor superficie celular. Nota: este método es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la detección de PPC aguda. * La inoculación simultánea, aunque ligeramente más sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir con la adhesión de las células a la superficie. Manual de la OIE sobre animales terrestres

7 Reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa Se han descrito muchos métodos de transcripción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y otros se están aún desarrollando. Una alternativa internacionalmente aceptada al ELISA de captura de antígeno y al método de aislamiento del virus es una reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa anidada en un solo tubo (RT-nPCR) (14). Este método es rápido y más sensible que los ELISA de captura de antígeno, el aislamiento vírico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado al diagnóstico preclínico. Tiene la ventaja adicional de reducir el riesgo de contaminación porque los tubos no se abren entre las transcripciones inversas sucesivas, la primera PCR y la PCR anidada (17). Están en desarrollo métodos de PCR en tiempo real. Aún no hay un método disponible de RT-PCR estandarizado internacionalmente. Se pueden obtener ejemplos de un protocolo adecuado en la literatura o de los laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Debido a su velocidad y sensibilidad, la RT-PCR es un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de enfermedad y está aceptada por la Unión Europea (1), aunque se recomienda que, debido a la facilidad con la que pueden ocurrir positivos falsos, los resultados positivos de brotes deberían confirmarse siempre con otras pruebas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva así como a órganos sólidos y se ha utilizado con éxito para controlar brotes. La epidemiología molecular de la PPC se basa en la comparación de diferencias genéticas entre los virus aislados. La amplificación del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciación nucleotídica es el método más simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiológicos moleculares (16). Se han estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la región 5 no codificante (5 NCR) del genoma (150 nucleótidos) y la otra en el gen de la glicoproteína mayor E2 (190 nucleótidos). En resumen, el método usado consiste en extraer el ARN vírico de cultivos de células PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar una o ambas zonas dentro de 5 NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotídica de los productos y comparar con la información acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para investigación epidemiológica molecular. Se debe obtener un permiso de importación antes de su envío. 2. Pruebas serológicas La detección de anticuerpos específicos contra el virus es útil cuando se sospechan infecciones con cepas de PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21 días post-infección. Las investigaciones serológicas dirigidas a detectar focos residuales de infección, especialmente en piaras de producción, pueden ser también útiles para la erradicación de PPC en una fase terminal. Como la incidencia de la infección con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cría, solo resultan útiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberían confirmarse por pruebas NV comparativas. Las pruebas de neutralización se realizan en cultivos celulares utilizando un método virus constante/suero variable. Como el CSFV no es citopático, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras multiplicación, por un sistema indicador. La prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (13) y la NPLA (20) son las técnicas más ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema con peroxidasa tiene la ventaja de que puede estimarse a simple vista. a) Prueba de neutralización vírica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (prueba prescrita para el comercio internacional) i) Sembrar una suspensión de células PK-15 a una concentración de 2 x 10 5 células/ml en placas Petri de 5 cm con cubres extendidos en el fondo, o en tubos Leighton con un cubre, o en microplacas de fondo plano. ii) iii) iv) Incubar los cultivos 1-2 días a 37 C en una cabina de CO 2 hasta que alcancen el 70-80% de confluencia. Se puede utilizar un incubador ordinario para tubos Leighton cerrados. Inactivar los sueros durante 30 minutos a 56 C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar con una dilución inicial del suero de 1/5 (dilución final 1/10). Incubar durante 1-2 horas a 37 C volúmenes iguales de suero diluido y de suspensión vírica que contenga 200 DICT 50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml. Por tanto se utiliza una cantidad constante de CSFV de 100 DICT 50 por cada pocillo de reacción. 272 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

8 v) Extraer los cubres de las placas Petri o de los tubos Leighton, lavar brevemente en medio sin suero, cubrir la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37 C en atmósfera húmeda. vi) Colocar los cubres en un tubo Leighton limpio e incubar los cultivos en medio de mantenimiento durante dos días más. vii) Sacar los cubres de los tubos Leighton, lavar las monocapas dos veces con PBS, ph 7,2, durante 5 minutos cada vez, fijar con acetona pura durante 10 minutos y teñir con la solución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37 C antes de lavar. viii) Montar para microscopía los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, ph > 8,0, y examinar por flluorescencia. Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulación, se puede seguir el procedimiento para la NPLA (ver más adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tiñen a continuación con la dilución de trabajo del conjugado durante 30 minutos a 37 C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecta fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de gran longitud focal. b) Prueba de neutralización ligada a peroxidasa (NPLA) (prueba obligada para el comercio internacional). La NPLA se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56 C durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilución inicial de suero de 1/5 (dilución final 1/10). Para programas de seguimiento en un país, puede ser suficiente una dilución de 1/10. En cada prueba deben incorporarse controles apropiados para asegurar la especificidad y la sensibilidad de las reacciones. Procedimiento de la prueba i) En dos pocillos de una placa de microtitulación se depositan 50 µl de diluciones de suero en medio de crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibióticos). El suero fetal bovino debe estar libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tinción inespecífica). ii) iii) iv) Añadir a los pocillos 50 µl de suspensión vírica, diluida en medio de crecimiento hasta contener aproximademente 100 DICT 50 /50 µl, y mezclar el contenido en un agitador de microplacas durante 20 segundos. Incubar las placas en un incubador de CO 2 durante 1 hora a 37 C. Añadir a todos los pocillos 50 µl de medio de crecimiento con 2 x 10 5 células/ml. v) Dejar crecer las células en 5% de CO 2 hasta confluencia, normalmente en 3-4 días. vi) Eliminar el medio de crecimiento y lavar las placas una vez con NaCl 0,15 M. vii) Las placas se secan por absorción en papel absorbente. viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes métodos: Las placas se incuban 45 minutos a 37 C, y luego a -20 C durante al menos 45 minutos. Se sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 µl de paraformaldehido al 4% en PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Se elimina el paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0.15M; o Las placas se incuban a C durante 1-2 horas; o Las placas se fijan en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total a C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo - se obtiene un secado completo después de 3-5 minutos-, según se observa por el color blanquecino de la monocapa celular). ix) Añadir a cada pocillo 50 µl de un suero porcino hiperinmune contra la PPC, diluido en NaCl 0,5 M que contiene 1% de Tween ,1 ml de azida sódica, ph 7,6. Incubar a 37 C durante 15 minutos. La Manual de la OIE sobre animales terrestres

9 dilución de trabajo del antisuero debe determinarse por titulación previa: es decir, un suero con un título por NPLA de 1/ puede utilizarse a 1/100. x) Lavar cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6. xi) Añadir a cada pocillo 50 µl de un conjugado de Ig-HRPO antiporcina, diluida a su dilución de trabajo con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6, y luego incubar durante 10 minutos a 37 C. xii) Lavar las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, ph 7,6. xiii) Añadir 50 µl de solución de cromógeno del substrato a cada pocillo y teñir durante minutos a temperatura ambiente. Esta solución se describe en la Sección B.1.a. "Diferenciación de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa". xiv) La prueba se lee visualmente. Las capas celulares infectadas se tiñen total o parcialmente de color marrón rojizo. En casos dudosos, la monocapa debe examinarse por microscopía a baja resolución. El citoplasma de las células infectadas se tiñe de rojo oscuro. xv) En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de células, de suero positivo y de titulación del virus problema. La titulación del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una concentración entre 30 y 300 DICT 50 / 50 µl. En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con BVDV reaccionan a baja dilución en las pruebas FAVN o NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La amplitud de la reacción cruzada depende de la cepa de BVDV implicada y del intervalo entre la infección y el tiempo de muestreo (27). Los altos niveles de anticuerpo que se alcanzan normalmente después de exposición a la infección por PPC, incluso con cepas de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos contra PPC, lo que evita muchas, aunque no todas, las reacciones cruzadas (20, 21). En caso de duda continuada, son útiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una cepa de BDV que sean representativas del país o de la región. Las pruebas comparativas de neutralización son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT 50 de cada cepa vírica seleccionada. Las pruebas comparativas se realizan según los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las líneas celulares deben ser adecuadas para el BVDV y el DVB. Los títulos de neutralización se expresan como el inverso de la dilución más alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de cuatro veces o más entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una infección por la especie de virus que da el título más alto. c) Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional) Las técnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado. Las pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el sistema de prueba debe asegurar la identificación de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de la respuesta inmune a la infección. Antígeno: El antígeno debe derivar de, o corresponder a, proteínas víricas de una de las cepas recomendadas de CSFV. Las células utilizadas para preparar antígeno deben estar libres de cualquier otra infección con Pestivirus. Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una proteína vírica inmunodominante del CSFV. Los ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM. La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralización al menos 21 días post-inoculación. La prueba ELISA sólo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es específico para la PPC, las muestras positivas deben analizarse además por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por otros pestivirus. El ELISA bloqueante de captación de complejos (4) es un método de un solo paso muy adecuado para utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rápida y fácil de 274 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

10 realizar, y detecta anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la infección. Como los MAbs son específicos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captación de complejos detectará anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser más problemáticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmación. Se puede obtener más información sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC. C1. Vacunas con virus vivos modificados Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenúan por pases en cultivo celular o en una especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La producción de lleva a cabo basándose en un sistema de lotes de siembra. Éste debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad, ausencia de transmisión, estabilidad e inmunogenicidad. Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. son de naturaleza general y puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales. El servicio de producción de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prácticas de bioseguridad. Si se utiliza el CSFV para producción de vacunas o para estudios de desafío de las vacunas, la parte del servicio donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contención del Grupo 4 de patógenos como se señala en el Apéndice I del Capítulo I.1.6. de este Manual. Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones óptimas para la obtención del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composición del medio, de la regulación del ph y del contenido atmosférico del CO 2, la concentración inicial de células sembradas, la relación entre la superficie de la capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las células al tiempo de la infección vírica, condición estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicación vírica, etc. Para las vacunas producidas en animales, los factores que deben ser investigados para determinar el máximo de crecimiento vírico y los tejidos a recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamaño del inóculo (número de ID 50 animal [dosis infecciosa del 50%]), patogénesis de la infección, y síntomas clínicos. Cualquiera que sea el método de producción, el substrato debe recogerse en condiciones asépticas y someterse a un ciclo de congelación y descongelación para liberar los virus asociados a las células. Los elementos celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtración o centrifugación a baja velocidad. Se añade un estabilizador, como lactosa, a una concentración final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilización para asegurar un lote uniforme. En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en más de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogéneo. 1. Control del inóculo a) Características del inóculo Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inóculo de siembra deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmación de identidad, esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuación, los experimentos piloto también deben realizarse con muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de siembra probado antes. A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos de 6-8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual paridad. Manual de la OIE sobre animales terrestres

11 El virus de siembra debe ser estéril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean específicos contra una cepa virulenta de CSFV en cerdos. b) Método de cultivo La producción se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no pertenezca a la familia Suidae. c) Validación como vacuna i) Pureza La vacuna debe ser virológicamente pura. Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto se repite 3 semanas después utilizando la misma dosis y ruta de administración. Se toman muestras de suero 2 semanas después de la última inoculación y se analizan por el método más sensible para ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB, fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, síndrome porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos, enterovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus. ii) iii) iv) Seguridad En las pruebas de seguridad, cada uno de diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan los pesos al tiempo de la inoculación y 2 semanas más tarde. Ningún animal debe morir o mostrar síntomas de enfermedad causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe alcanzar o superar los 40,5 C durante el período de la prueba. El aumento diario de peso medio no debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la leucopenia (número de leucocitos < 7 x 10 6 células/ml) si sólo ocurre en un cerdo durante 1 día. Cada uno de diez cerdos se inmunosuprime por inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de peso corporal durante 5 días consecutivos. Al día 3 cada animal se inocula con el equivalente de una dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningún animal debe morir o enfermar debido al virus vacunal. Cada una de diez cerdas gestantes de días, se inoculan intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacunas. Otros diez animales de la misma paridad y gestación sirven de control. La vacunación no debe de interferir con la gestación a término, y el número de lechones vivos nacidos del grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p<0,05) que el del grupo control. Para ensayos de campo se utiliza un mínimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas, y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los 7-14 días de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculación y 2 semanas más tarde, y se observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas ajenas a la vacunación invalida la prueba. Ningún animal debe morir o mostrar signos de la enfermedad debido al virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser un 20% menor que el de los controles durante las 2 semanas post-inoculación. Ausencia de transmisión Para confirmar la ausencia de transmisión, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas después como desafío con al menos 10 5 PID 50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serológicamente negativos al tiempo del desafío, y morir después durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben permanecer sanos y sobrevivir. Estabilidad de la atenuación Para confirmar la estabilidad de la atenuación vírica, cada uno de dos cerdos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y 276 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

12 se sacrifican 6-7 días después. Se juntan las amígdalas de ambos cerdos y se prepara una suspensión al 10% en PBS, ph 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos con 2 ml y luego se sacrifican 6-7 después. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el tejido de amígdalas se puede guardar a 4 C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a -70 C por períodos más largos. Al mismo tiempo, la presencia del antígeno de PPC se confirma en cada pase por una prueba directa de FAT en cortes finos de las amígdalas o por aislamiento del virus en un substrato adecuado. Si después de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antígeno, se realiza una segunda serie de pases para mostrar infección, comenzando con los últimos dos cerdos de la serie previa. Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase más alto de las dos series en que se detectó virus o antígeno vírico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se pesan al tiempo de la inoculación y de nuevo 2 semanas más tarde. Se recoge sangre diariamente con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo observación durante 3 semanas. Ningún animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El peso medio adquirido en los dos grupos durante las primeras dos semanas no debe diferir significativamente (p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (número de leucocitos < 7 x 10 6 células/ml) en un cerdo de cada grupo durante 1 día. v) Inmunogenicidad Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculación de desafío 7 días después con 10 5 PID 50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles. En una prueba para establecer la duración de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses después, los sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan después en desafío con al menos 10 5 PID 50 de una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles. Para determinar la protección al desarrollo del síndrome de la cerda portadora, se dividen al azar 20 cerdas grávidas en la misma fase de gestación en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos veces con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas después de la última inoculación se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas después y los fetos se examinan para presencia de CSFV o antígeno vírico. La vacunación debería reducir de modo significativo la transmisión transplacentaria del virus. En las condiciones de conservación prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el final de la caducidad que se indique. 2. Método de producción Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inóculo utilizado para las pruebas piloto. Además, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de producción y bajo las condiciones expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser uniformes. 3. Control del proceso El protocolo de producción dependerá de la cepa vacunal, del sistema de producción (animales o cultivos celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar en función del sistema de producción, es decir, si proceden de cultivos primarios, líneas celulares, monocapas o cultivos en suspensión. 4. Control de lotes Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 6-8 semanas y estar libres de anticuerpos contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar distribuidos en grupos aleatorios. Manual de la OIE sobre animales terrestres