11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A23C 9/ Agente: Ponti Sales, Adelaida

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A23C 9/123 A23C 19/ TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Utilización de cepas de Streptococcus thermophilus incapaces de hidrolizar urea en productos lácteos. 30 Prioridad: FR Titular/es: SOCIÉTÉ TEXEL Zone d Activites de Buxieres F Dange Saint Romain, FR INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) 45 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Sepulchre, Anne-Marie; Monnet, Christophe y Corrieu, Georges 45 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Ponti Sales, Adelaida ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Utilización de cepas de Stretococcus thermophilus incapaces de hidrolizar urea en productos lácteos La presente invención se refiere al control de la cinética de acidificación de la leche, en el momento de la fabricación de quesos o de leches fermentadas, tales como los yogures, por la acción de bacterias Streptococcus thermophilus, al menos parcialmente, de forma preferible totalmente, incapaces de hidrolizar la urea. Streptococcus thermophilus es una bacteria láctica termófila utilizada como fermento lácteo en la industria lechera. Empleado en primer lugar para la fabricación de leches fermentadas tales como el yogur, actualmente y poco a poco se utiliza en la producción de quesos. Esta bacteria transforma la lactosa en ácido láctico, y presenta por eso una actividad acidificante. Esta acidificación, principalmente en el caso de los quesos, no solamente favorece la acción de la presión y de la sinéresis del cuajo, sino que inhibe el crecimiento de numerosas bacterias indeseables, algunas de las cuales son bacterias patógenas, y permite también, más o menos rápidamente, su eliminación. La actividad acidificante de estas bacterias está duplicada sin embargo por una actividad de hidrólisis de la urea, actividad que afecta la cinética de acidificación. Tison et al.. (1982a) mostraron que la reacción de hidrólisis de la urea, que origina dióxido de carbono y amoníaco, inducía una disminución temporal de la velocidad de acidificación medida con una sonda de ph. Los autores de este artículo concluyen que no se pueden utilizar los cambios de ph para medir la producción de ácido láctico en los cultivos de Streptococcus thermophilus, puesto que los resultados que se obtendrán serán erróneos a consecuencia de la producción de amoníaco. Por otra parte, Spinnler y Corrieu en 1989 observaron que la adición de urea conducía a una disminución de la velocidad de acidificación. A escala industrial, la hidrólisis de la urea por parte de Streptococcus thermophilus causa un cierto número de problemas. En efecto, en la fabricación de quesos, por ejemplo, las operaciones tecnológicas (corte del cuajo, mezcla, etc.) deben tener lugar a valores determinados de ph, pero en la práctica, estas operaciones se realizan generalmente en momentos determinados. A consecuencia de este hecho, las variaciones de actividad acidificante debidas a la hidrólisis de la urea ocasionan defectos y variabilidades importantes en los quesos (textura, tasa de humedad, refinación). Martin et al.. (1997) también observó que las variaciones de los contenidos en urea provocaban modificaciones en las cinéticas de acidificación y en la textura de los quesos del tipo reblochon, confirmando los resultados obtenidos por Spinnler y Corrieu (1989). Por otra parte, la producción de amoníaco aumenta el tiempo necesario par alcanzar un ph determinado. Esto se traduce en una inmovilización menos importante del material, así como en un aumento del riesgo de contaminación por parte de microorganismos indeseables. Por otra parte, es deseable que el lactosuero de queserías no contenga una cantidad excesiva de amoníaco, puesto que este lactosuero se utiliza a menudo en la alimentación animal. Este fenómeno es difícilmente controlable, principalmente porque el contenido en urea de la leche es variable (generalmente de 2 a 8 mm) y depende en concreto de la alimentación del ganado. Para paliar este problema, Martin et al.. (1997) propusieron medir los contenidos en urea de la leche y adaptar a continuación los parámetros de fabricación. No obstante, la puesta en práctica de tal sistema de dosificación de la urea sería muy apremiante, y no resolvería de todos modos los inconvenientes debidos a una ralentización de la velocidad de acidificación en presencia de urea (duración de la inmovilización más importante del material, aumento de los riesgos de contaminación, etc.) y a un contenido elevado en amoníaco del lactosuero. Los autores de la presente invención han puesto en evidencia que la utilización de cepas de Streptococcus thermophilus que no hidrolizan, o no totalmente, como fermentos lácteos en la producción de productos permitiría resolver los problemas citados más arriba. Estas cepas se denominan cepas ur(-) en el resto de esta solicitud. Hasta la fecha, las únicas cepas de Streptococcus thermophilus ur(-) descritas son la cepa CNRZ 407 (Juilliard et al.., 1988) y la cepa mutante aislada por Tinson et al.. (1982b). Sin embargo, las informaciones conocidas relativas a estas dos cepas no permiten hacerse cargo de el interés tecnológico de las cepas ur(-). Por tanto, la presente invención tiene por objeto la utilización de al menos una cepa de Streptococcus thermophilus, al menos parcialmente y de forma preferible totalmente, incapaz de hidrolizar la urea, en la fabricación de quesos o productos lácteos fermentados, tales como los yogures, para obtener una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido en sus componentes de la leche. En el marco de la presente invención, se entiende por la cinética de variación a la variación del ph del medio de fermentación en función del tiempo. Por contenido de la leche en sus componentes se entiende en particular los contenidos en urea de las leches, que 2

3 difieren de una leche a otra, según el origen del animal o su alimentación. Se entiende igualmente por los contenidos en otros componentes de la leche que están implicados en el metabolismo de la urea. Entre estos compuestos se pueden citar, por ejemplo, el níquel o el cobalto. Estos componentes pueden estar presentes de forma natural en la materia prima utilizada (la leche) o haber sido añadidos. La presente invención también tiene por objeto un procedimiento para obtener, en el momento de la fabricación de quesos o de productos lácteos fermentados, tales como los yogures, una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido de la leche en sus componentes, en el cual se incorpora a la leche al menos una cepa de Streptococcus thermophilus, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente, incapaz de hidrolizar la urea. Las cepas de Streptococcus thermophilus ur(-) puestas en práctica conforme a la presente invención pueden obtenerse mediante un tratamiento mutagénico o mediante mutación espontánea, o incluso pueden aislarse en la naturaleza. Las cepas 298-K y , que son respectivamente un mutante espontáneo y un mutante obtenido después de un tratamiento mutagénico, han sido registradas en el CNCM el 14 de septiembre de 1999 respectivamente con los números I-2311 e I Cualquier cepa ur(-) cribada según el protocolo de Tinson et al.. (1982b), o preferiblemente según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, puede utilizarse igualmente. Las cepas de Streptococcus thermophilus ur(-) pueden utilizarse solas o en mezcla con otros microorganismos tales como los lactococos y los lactobacilos, o todo otro microorganismo utilizado en la industria lechera. Los autores de la presente invención han demostrado que el interés de las cepas de Streptococcus thermophilus ur(-) es múltiple. En efecto, ellos han hecho evidente que los mutantes ur(-) permiten no sólo el control de las variaciones de las cinéticas de acidificación, sino que, por otra parte son estables y presentan un buen crecimiento en la leche. Por otra parte, las cepas ur(-) permiten obtener cinéticas regulares de la acidificación de la leche, las cuales no presentan una ralentización temporal en función de la concentración de urea, de forma contraria a las cinéticas observadas con las cepas ur(+). Las cepas ur(-) no producen amoníaco a partir de su crecimiento en el baño, lo que es ventajoso desde el punto de vista de una utilización del lactosuero en la alimentación animal En fin, las cepas seleccionadas para su fenotipo ur(-) presentan de forma sorprendente algunos caracteres acidificantes variables, con respecto a las cinéticas de acidificantes observadas con la cepas progenitoras. Por cinética de acidificación variable se entiende, por ejemplo, una cinética de acidificación más rápida o más lenta por comparación con cinéticas de acidificación observadas con las cepas progenitoras. También se puede hablar de heterogeneidad entre las cinéticas de acidificación de los diferentes mutantes ur(-) con respecto a la cepas progenitoras. La invención también tiene por objeto un procedimiento de selección de las cepas Streptococcus thermophilus útiles desde ese momento en la fabricación de quesos o de productos lácteos fermentados, tales como el yogur, en los que las cepas de Streptococcus thermophilus mutantes, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente incapaces de hidrolizar la urea, que permiten la obtención de una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido de la leche en sus componentes, en donde se seleccionan por su capacidad para acidificar una leche según las cinéticas de acidificación variables, en relación a cinéticas de acidificación de las cepas parenterales. De forma general, la elección de las propiedades acidificantes de las cepas ur(-) puede efectuarse en función de la tecnología de fabricación quesera o de leches fermentadas, por la cual se ponen en práctica estas cepas. Así, ciertas cepas ur(-) se caracterizan más concretamente por una ausencia del fenómeno de post-acidificación Para otras cepas, el tiempo necesario para alcanzar un ph determinado se ha revelado más corto que para las cepas ur(+) progenitoras. De este modo, esta propiedad permite sembrar la leche con una cepa mutante ur(-) a una tasa inferior a la tasa generalmente utilizada para la cepa ur(+) progenitora. Esta tasa puede ser inferior en aproximadamente un 25%, en aproximadamente un 50%, con respecto a la tasa que se utilizaría con la cepa progenitora. Las Figuras y ejemplos a continuación ilustran la invención sin limitar el alcance. Leyendas de las figuras 65 La Figura 1 representa las curvas de acidificación de la leche descremada reconstituida obtenidas con la cepa RD298 ur(-), así como con los mutantes ur(-) espontáneos (Figura 1A) u obtenidos después de un tratamiento con NTG (Figura 1B). 3

4 La Figura 2 representa las curvas de acidificación de la leche descremada reconstituida obtenidas con la cepa SDT888, así como con los mutantes ur(-) espontáneos (Figura 2A) u obtenidos después de un tratamiento con NTG (Figura 2B) La Figura 3 representa las curvas de acidificación de la leche descremada UHT obtenidas con la cepa RD298, así como con los mutantes ur(-) espontáneos (Figura 3A) u obtenidos después de un tratamiento con NTG (Figura 3B). La Figura 4 representa las curvas de acidificación de la leche descremada UHT obtenidas con la cepa SDT888, así como con los mutantes ur(-) espontáneos (Figura 4A) u obtenidos después de un tratamiento con NTG (Figura 4B). La Figura 5 representa las curvas de acidificación obtenidas con la cepa RD298 (Figura 5A) y los mutantes ur(-) RD298-K (Figura 5B) y RD (Figura 5C), sobre la leche descremada UHT suplementada con diferentes cantidades de urea. La Figura 6 representa las curvas de acidificación obtenidas con la cepa RD298 (Figura 6A) y los mutantes ur(-) RD298-K (Figura 6B) y RD (Figura 6C), sobre la leche descremada UHT suplementada o no con níquel (10 µg/l de NiSO_4.7 H_2O). La Figura 7 representa las curvas de acidificación obtenidas con la fuente RD672 y de los mutantes ur(-) originados de esta cepa, sobre la leche descremada reconstituida. Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento de cribado de las bacterias ur(-) en una placa de Petri TABLA 1 Composición del medio de cribado Triptona a Peptona pépsica de carne a Peptona papaínica de soja a Extracto autolítico de levadura b Extracto de carne a Azúcar (glucosa, lactosa o sacarosa) Glicerofosfato de sodio.6 H 2 O Sulfato de magnesio Ácido ascórbico Agar Agua destilada a : Sociedad Biokar b : Sociedad Fischer Scientific 2,5 g 2,5 g 5 g 2,5 g 5 g 5 g 19 g 0,25 g 0,5 g 15 g 1 l Llegado el caso, se puede añadir a este medio un cofactor de la ureasa. Ajustar el ph a 7,0 y autoclavar durante 15 minutos a 115ºC. Las células de Streptococcus thermophilus a analizar se siembran sobre este medio de manera que se obtengan aproximadamente 100 colonias por placa de Petri. Los cultivos se mantienen en condiciones anaerobias a una temperatura de 35-45ºC, preferiblemente 37-42ºC. Después de dos días de cultivo, se vierten sobre cada placa de Petri aproximadamente 20 ml de una solución gelatinosa preparada de la forma siguiente: disolver mediante calor 15 de agar en 1 litro de una solución de tampón fosfato potásico 50 mm (ph 6), suplementada con 100 mg/l de azul de bromotimol, enfriar la solución a 50ºC, añadir 10 g de urea y acidificar el medio con ácido clorhídrico hasta la obtención de un color amarillo-naranja. Después de la solidificación de la gelatina, se incuban las placas de Petri durante 1 hora a 37ºC. Los clones ur(+) forman halos de color azul a consecuencia de la producción de amoníaco, mientras que los clones ur(-) forman colonias amarillas. Puesto que los mutantes ur(-) son los deseados, los clones que no forman un halo azul se recuperan, y ensayan de nuevo sobre el mismo medio de cribado, con objeto de confirmar el carácter ur(-). De igual modo, es conveniente verificar que estos mutantes no consumen urea (o que tan sólo la consumen al inicio) puesto que se cultivan en la leche. 4

5 Ejemplo 2 Selección de mutantes del metabolismo de la urea 5 10 Los mutantes que no consumen urea, o que la consumen débilmente, se buscan a partir de las cepas de Streptococcus thermophilus RD298, RD672 y ST888. Se han utilizado dos estrategias. En la primera estrategia, los mutantes se han examinado después de un tratamiento con un agente mutágeno, mientras que en la segunda estrategia se han buscado mutantes espontáneos. a) Selección con la ayuda de un agente mutágeno El tratamiento mutágeno se ha realizado tal como se describe a continuación Las cepas se cultivaron a 42ºC en 5 ml de medio M17 (Tezaghi y Sandine, 1975). El cultivo se detuvo al final de la fase exponencial, y se recuperaron las células mediante centrifugación, después se lavaron con tampón fosfato 100 mm (ph 7). A continuación se recuperaron las células en 1 ml de tampón que contenía un contenido variable de N-metil- N -nitro-n-nitrosoguanidina (NTG), y se incubaron durante 1 hora a 42ºC. Las células se lavaron inmediatamente dos veces con 5 ml de tampón y se sembraron sobre medio de cribado de forma que se obtuvieran aproximadamente 100 colonias por placa de Petri. El cribado se realizó como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 1). La Tabla 2 describe los resultados obtenidos a partir de 3 mutagénesis. TABLA 2 Selección de mutantes ur(-) después de su tratamiento con un agente mutágeno (NTG) Cepa de Concentración Viabilidad (% de las Número de Número de Proporción Streptococcus de NTG células que colonias clones ur(-) de clones thermophilus utilizada han sobrevivido cribadas obtenidos ur(-) (%) (µ/ml) al NTG) ST ,1 35 ST ,5 RD ,4 RD , b) Selección de mutantes espontáneos En una población de microorganismos, a menudo existen mutantes espontáneos para un gen o un carácter determinado. Este tipo de mutante es muy interesante, puesto que el hecho de que no se haya utilizado agente mutágeno alguno suprime el riesgo de inducción de mutaciones no buscadas (distintas que para el carácter utilizado). No obstante, la frecuencias de los mutantes espontáneos en el seno de un población para un carácter determinado es generalmente muy baja, del orden de 1 cada millón (variable en función de las cepas y de los caracteres). De este hecho, la selección de mutantes espontáneos necesita generalmente, bien la puesta a punto de un procedimiento que permita cribar un número muy elevado de clones, bien la definición de un procedimiento de enriquecimiento de los mutantes. Ningún procedimiento de enriquecimiento de mutantes ur(-) ha sido previamente descrito. Además, puesto que el procedimiento de cribado sobre placa de Petri no permite analizar más de 100 colonia de Streptococcus thermophilus por placa, se puede llegar a la conclusión que la selección de mutantes espontáneos es irrealizable, puesto que haría falta cribar varios miles, a veces decenas de miles, de placas de Petri, para tener la posibilidad de aislar un mutante espontáneo. Ahora bien, los autores de la presente invención se han percatado de que en los cultivos de Streptococcus thermophilus la proporción mutantes ur(-) espontáneos era elevada (aproximadamente 1 cada 2500 para la ST888, 1 cada 4000 para RD672, y 1 cada 1200 para RD298), y que es posible aislar fácilmente este tipo de mutante (Tabla 3)

6 5 10 TABLA 3 Selección de mutantes ur(-) espontáneos. El protocolo utilizado es el mismo que el descrito en el parágrafo a) Selección con la ayuda de un agente mutágeno, excepto que se omite el agente mutágeno Cepa de Streptococcus Número de colonia Número de colonias ur(-) Proporción de clones thermophilus cribadas obtenidas ur(-) (%) ST ,04 RD ,08 15 RD ,03 47 de los mutantes obtenidos han sido estudiados. Los resultados concernientes a la estabilidad, la caracterización enzimática, así como el comportamiento acidificante de estos mutantes, se describen a continuación. 20 Ejemplo 3 Propiedades de los mutantes ur(-) a) Estabilidad de los mutantes Para poder ser utilizables en un contexto industrial, los mutantes ur(-) deben ser estables. Ahora bien, no existía dato alguno en relación a la estabilidad de los mutantes ur(-) de Streptococcus thermophilus. Los autores de la presente invención han estudiado la estabilidad de 47 mutantes originados a partir de las cepas ST888, RD672 y RD298. Las cepas se han replicado cada día en 10 ml de medio M17, y así durante 20 días. Los cultivos estaban inoculados al 1%, y se incubaron a 42ºC. El conjunto de estas 20 replicaciones representa aproximadamente 130 generaciones. Después de la vigésima replicación, las cepas se han sembrado en leche y se ha determinado si consumían o no la urea (cultivos de 15 horas a 42ºC). Los resultados se presentan en la Tabla 4. Se constata que los mutantes ur(-), que han sido obtenidos mediante un tratamiento mutágeno o que se trata de mutantes espontáneos, son muy estables. En efecto, sólo se han detectado dos reversiones en los 47 mutantes ensayados. TABLA 4 Estudio de la estabilidad de los mutantes ur(-). El consumo de urea ha sido ensayado a partir de los cultivos en leche, después de 20 replicaciones sucesivas en medio M17 Cepa de Streptococcus Mutación Número de mutantes ur(-) Número de mutantes que thermophilus ensayados consumen la urea después de 20 replicaciones ST888 NTG 6 1 ST888 espontánea RD298 NTG 5 0 RD298 espontánea RD672 NTG 19 0 RD672 espontánea 5 1 Total / b) Caracterización enzimática de los mutantes Las cepas estudiadas se han cultivado durante 24 horas, en condiciones anaerobias, a 37ºC, en un medio líquido, la composición del cual se indica en la Tabla 5. Las células se han recuperado mediante centrifugación, se han lavado en un tampón (HEPES 50 mm - EDTA 1 mm, ph 7,5), después se han recuperado en un volumen de tampón que representaba el 2% del volumen del cultivo. La actividad ureásica se ha medido inmediatamente en los extractos celulares (tratamiento de las células en un molino de bolas, y recuperación del sobrenadante resultante de la centrifugación durante 5 minutos a g). 6

7 TABLA 5 Composición del medio utilizado para la preparación de extractos Triptona a Extracto autolítico de levadura b Glicerofosfato de sodio.6 H 2 O Ácido ascórbico Sulfato de magnesio Sulfato de níquel.7 H 2 O Glucosa Agua destilada a : Sociedad Biokar b : Sociedad Fischer Scientific 10 g 5 g 19 g 500 mg 250 mg 10 mg 10 g 1 l Ajustar el ph a 7,0 y autoclavar durante 15 minutos a 115ºC. Las mediciones de actividad ureásica se han realizado a 37ºC, en un tampón HEPES 50 mm - EDTA 1 mm (ph 7,5). La reacción se desencadenó mediante la adición de urea 25 mm, y se ha medido el amoníaco producido durante 20 minutos utilizando el reactivo de Nessler. Los resultados se expresan en unidades (U) de actividad ureasa (una unidad corresponde a un micromol de amoníaco producido por minuto) por miligramo de proteína. La Tabla 6 presenta los valores de actividad obtenidos. Los mutantes ur(-) no presentaban actividad ureásica alguna detectable, con excepción de los mutantes y Estos últimos corresponden a unos mutantes que tienen el fenotipo ur(+) en presencia de níquel y el fenotipo ur(-) en ausencia de este compuesto. Ahora bien, el medio de cultivo utilizado para la preparación de los extractos celulares contenía sulfato de níquel. En estas dos cepas, la mutación está probablemente en el sistema de transporte del níquel o en el sistema que permite su incorporación en el sitio activo de la ureasa. Estas cepas de Streptococcus thermophilus podrían presentar igualmente un fenotipo ur(-) a consecuencia del hecho de ser incapaces de transportar la urea. Por tanto, tales cepas poseerán siempre una actividad ureásica medible en los extractos celulares. TABLA 6 Medición de la actividad ureásica de extractos celulares obtenidos a partir de las cepas progenitoras así como de los mutantes ur(-) 45 Cepa progenitora Actividad Cepa progenitora Actividad Cepa progenitora Actividad - Mutante ureásica (U/mg) - Mutante ureásica (U/mg) - Mutante ureásica (U/mg) RD298 0,94 RD672 1,08 ST888 0, n.d (0) n.d. 888-A n.d K n.d (0) n.d. 888-B n.d. 298-I n.d (0) n.d. 888-C n.d J n.d (0) n.d. 888-D n.d. 298-L n.d (0) n.d n.d. 298-M n.d (50) n.d n.d N n.d (50) n.d ,6 n.d ,9 n.d (50) n.d ,11 n.d ,3 n.d (50) n.d ,9 n.d ,16 n.d (50) n.d ,13 n.d. 7

8 TABLA 6 (continuación) 5 Cepa progenitora Actividad Cepa progenitora Actividad Cepa progenitora Actividad - Mutante ureásica (U/mg) - Mutante ureásica (U/mg) - Mutante ureásica (U/mg) 298-3,17 0, (50) n.d ,8 n.d (50) n.d ,5 0, (50) n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d (509 n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d (50) n.d. 35 n.d. no detectada c) Comportamiento acidificante de los mutantes 40 Con el fin de demostrar el interés tecnológico de las cepas ur(-), los autores de la invención han comparado las características acidificantes con las de las cepas progenitoras correspondientes. Se han observado los resultados siguientes: contrariamente a las cepas progenitoras, los mutantes ur(-) no presentan una ralentización temporal de la velocidad de acidificación debida a la hidrólisis de la urea, sus curvas de acidificación son por tanto más regulares; - las cinéticas de acidificación de la leche por parte de los mutantes ur(-) se ven poco o nada afectadas por los contenidos en urea, en níquel y en cobalto; - por otra parte, se observa una gran variabilidad de las actividades acidificantes entre los mutantes ur(-) en comparación con las actividades acidificantes de las cepas progenitoras. El detalle de los resultados obtenidos se presenta a continuación. Los cultivos se sembraron al 1% con un cultivo previo realizado sobre leche descremada reconstituida esterilizada, y se cultivaron a continuación a 37ºC. - Cultivos en leche descremada reconstituida La leche se ha reconstituido a 100 g/l y se ha pasteurizado durante 10 minutos a 90ºC. Después de aproximadamente 2 horas de cultivo, se observa un aumento del ph en el cultivo de la cepa RD298 (Figura 1). Los 6 mutantes espontáneos presentan una curva de acidificación más regular, sin incremento del ph ni ralentización temporal de la velocidad de acidificación. En cierto momentos del cultivo, el retraso de la acidificación en comparación con la cepa progenitora alcanza es cercano a las 4 horas. Esto permite conseguir más rápidamente un valor de ph determinado. El interés de esta observación es importante: si se quiere conseguir un ph determinado sin disminuir la duración de la incubación, se puede utilizar una cepa ur(-) y disminuir la cantidad de siembra en relación a la cantidad utilizada con una cepa ur(+). Algunos de los mutantes obtenidos después de un tratamiento con NTG 8

9 tienen un comportamiento similar al de los mutantes espontáneos, otros acidifican el medio más lentamente ( ) o más rápidamente (298-10). 5 Con excepción del mutante 888-1, los mutantes espontáneos ur(-) de la ST888 presentan la misma curva de acidificación. Al igual que para la RD298, se observa una acidificación más regular y más rápida con los mutantes (Figura 2). - Cultivos en leche descremada esterilizada UHT (Lactel ) Al igual que para los cultivos realizados con la leche reconstituida, se observa una detención temporal de la disminución del ph con la cepa RD298, estando ausente este fenómeno en los cultivos de los mutantes ur(-) espontáneos (Figura 3). Los mutantes ur(-) aislados a partir de ST888, tanto si son espontáneos como obtenidos mediante tratamiento con NTG, tienen una curva de acidificación más regular que la de la cepa progenitora (Figura 4). - Efecto de las variaciones en la composición de la leche sobre las curvas de acidificación La cepa RD298, así como los mutantes ur(-) 298-K y , se ha cultivado sobre leche descremada esterilizada UHT suplementada o no con diferentes cantidades de urea. La concentración inicial de urea en la leche era igual a 3 mm, y los contenidos en urea de los diferentes cultivos estaban comprendidos en las zonas de variación que se observan habitualmente con la leche de vaca. Se constata que, contrariamente a los mutantes ur(-), las curvas de acidificación obtenidas con la cepa progenitora son muy dependientes del contenido en urea de la leche (Figura 5). Los autores de la presente invención han observado igualmente que las curvas de acidificación obtenidas con la cepa progenitora dependen del contenido de níquel y cobalto en la leche, lo que no es el caso para los mutantes ur(-) (Figura 6). - Producción de amoníaco En todos los cultivos descritos previamente, se ha observado que las cepas RD298 y ST888 producían amoníaco e hidrolizaban la totalidad de la urea contenida en la leche. No se ha observado producción alguna de amoníaco con los mutantes. Esto indica que la urea es el sustrato principal utilizado por Streptococcus thermophilus para producir amoníaco. De este modo, la utilización de cepas ur(-) permite evitar toda producción de amoníaco debida a Streptococcus thermophilus en el momento de las fabricación queseras. En consecuencia, los contenidos en amoníaco de los lactosueros de queserías pueden limitarse. - Variabilidad de las actividades acidificantes Los autores de la presente invención han observado de forma interesante que las curvas de acidificación en la leche descremada reconstituida obtenidas con múltiples cepas mutantes ur(-) presentan variaciones importantes en comparación con la curva obtenida con su cepa progenitora. De este modo, la Figura 7 muestra las curvas de acidificación de la leche descremada reconstituida obtenidas con la cepa RD672, así como con los mutantes ur(-) originados de esta cepa. La cepa RD672 es poco acidificante (tecnología del tipo pasta molida solubilizada). El mutante (0) es netamente más acidificante que la cepa progenitora, mientras que el mutante (50) presenta una cinética de acidificación bastante parecida. El mutante (0) es netamente menos acidificante que la cepa progenitora, y el mutante (50) es un poco menos acidificante que la cepa progenitora. Ejemplo 4 55 Fabricación de quesos del tipo pasta molida solubilizada poniendo en práctica, bien la cepa industrial ur(+) de RD298, bien la cepa mutante ur(-) (mutante de RD298) a) Generalidades Bajo el nombre genérico de queso se encuentra un gran número de productos, que tienen una tecnología, una flora y unas propiedades organolépticas muy diversas. En el aspecto tecnológico, el queso es, en un primer momento, el resultado de la coagulación de la leche obtenido mediante prensado, la cual será seguida por el escurrido del coágulo obtenido de este modo (operaciones mecánicas tales como el corte, mezcla y volteo). En el curso de la fabricación, el desarrollo de los fermentos añadidos provocará una disminución del ph del coágulo. La cinética de acidificación (evolución del ph en función del tiempo) y la cinética de escurrido condicionan 9

10 la composición final del cuajo y, por tanto, de las características intrínsecas de los quesos. Este es el motivo por el cual, para una tecnología determinada, es esencial el control de las cinéticas de acidificación y escurrido b) Particularidades de la tecnología pasta molida solubilizada puesta en práctica La fabricación de quesos del tipo pasta molida solubilizada corresponde a la puesta en práctica de una tecnología con predominancia enzimática (papel importante de la presión), con perfiles de temperatura de fabricación específicos, tales como el descrito en ésta en la Tabla 7. La conducción del escurrido se caracteriza por: - Una acidificación importante al inicio del proceso, la cual condiciona el nivel de escurrido. La acidificación está asegurada por Streptococcus thermophilus; los ph a obtener en las diferentes etapas de fabricación se resumen en la Tabla 7. - Una evacuación rápida del suero, acentuada por las operaciones mecánicas (corte, mezcla y volteo del coágulo). - Algunas operaciones facilitan la evacuación del lactosuero (volteo). 20 c) Monitorización de las fabricaciones queseras La Tabla 7 resume las diferentes etapas tecnológicas de las fabricaciones realizadas, e informa de los tiempos tecnológicos que han sido necesarios en cada ensayo para conseguir el ph blanco de cada una de estas etapas Se han puesto en práctica dos leches distintas conteniendo, por una parte menos de 1 mm de urea, y por la otro parte 5 mm de urea. Los fermentos utilizados estaban formados, bien por la cepa industrial RD298, conocida por su capacidad de hidrolizar la urea, ur(+), bien por la cepa , un mutante espontáneo de esta cepa privado de esta capacidad de hidrolizar la urea, ur(-). El seguimiento de la acidificación de la leche que contiene una cantidad muy pequeña de urea (menos de 1 mm) muestra que las dos cepas puestas en práctica permiten conseguir los ph blancos de cada etapa en tiempos aproximadamente idénticos. De igual forma, estos objetivos se consiguen con la ur(-) a partir del momento en que la leche de la fabricación contiene cantidades significativas de urea (5 mm). Por contra, para respetar los ph blancos de la fabricación con la cepa RD298 en la leche que contenía urea 5 mm, los tiempos tecnológicos han tenido que alargarse considerablemente. Estos estudios demuestran por tanto la ventaja tecnológica real del mutante ur(-) en comparación con la cepa progenitora industrial RD298 ur(+) TABLA 7 Características tecnológicas de una fabricación quesera del tipo pasta molida solubilizada, y descripción tecnológica de las fabricaciones realizadas con las cepas RD298 ur(+) ó ur(-), utilizadas como fermento, a partir de leche que contenía, o urea 5 mm, o menos de 1 mm de urea Tiempos tecnológicos efectivos (min) Etapa de la Temperatura de ph blanco Tiempos Leche con menos Leche conteniendo fabricación fabricación (ºC) (±0,5) tecnológicos de 1 mm de urea urea 5 Mm objetivos (±10 min) RD RD Leche 6,48 0± Prensado 38± 0,5 6,40 70± Molienda 6,30 120± Primer volteo 35±0,5 6,20 180± Segundo volteo 26±0,5 5,50 300± Tercer volteo 20±0,5 5,25 540±

11 Bibliografía Julliar V., Desmazeaud, M. J., Spinnler, H. E Mise en évidence d une activité uréasique chez Streptococcus thermophilus. Canadian Journal of Microbiology 34: Martin, B., Coulon, J. B., Chamba, J. F., Bugaud, C Effect of milk urea content on characteristics of matured Reblochon cheeses. Lait 77: Spinnler, H. E., Corrieu, G Automatic method to quantify starter activity based on ph measurement. Journal of Dairy Research 56: Terzaghi, B. E., Sandine, W. E Improved mediu for lactic streptococci and their bacteriophages. Applied Microbiology 29: Tinson, W., Broome, M. C., Hillier, A. J., Jago, G. R. 1982a. Metabolism of Streptococcus thermophilus. 2. Production of CO_2 and NH_3 from urea. Australian Journal of Dairy Technology 37: Tinson, W., Ratcliff, M. F., Hillier, A. J., Jago, G. R. 1982b. Metabolism of Streptococcus thermophilus. 3. Influence on the level of bacterial metabolites in cheddar cheese. Australian Journal of Dairy Technology 37:

12 REIVINDICACIONES Utilización de al menos una cepa de Streptococcus thermophilus incapaz de hidrolizar la urea, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente, en el momento de la fabricación de quesos o de productos lácteos fermentados, tales como los yogures, para obtener una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido en sus componentes de la leche. 2. Utilización según la reivindicación 1, en la cual la cinética de acidificación es sustancialmente independiente del contenido en urea de la leche. 3. Utilización según la reivindicación 1, en la cual la cinética de acidificación es sustancialmente independiente del contenido en níquel o cobalto de la leche. 4. Utilización según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual la cinética de acidificación de la leche no presenta una ralentización temporal. 5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la cual la cepa de Streptococcus thermophilus es la cepa 298-K registrada en el CNCM con el número I Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual la cepa de Streptococcus thermophilus es la cepa registrada en el CNCM con el número I Procedimiento para obtener, en la fabricación de quesos o productos lácteos fermentados, tales como los yogures, una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido de la leche en sus componentes, en el cual se incorpora a la leche al menos un cepa de Streptococcus thermophilus incapaz de hidrolizar la urea, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el cual se incorpora al menos una cepa de Streptococcus thermophilus incapaz de hidrolizar la urea, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente, con una tasa de inoculación inferior a la tasa de inoculación utilizada para la cepa de Streptococcus thermophilus progenitora capaz de hidrolizar la urea. 9. Procedimiento de selección de cepas de Streptococcus thermophilus utilizadas en la fabricación de quesos o de productos lácteos fermentados, que comprende: - la comparación de la cinética de acidificación de la leche en presencia de una cepa a ensayar de Streptococcus thermophilus mutante, incapaz de hidrolizar la urea, al menos parcialmente, preferiblemente totalmente, que permite la obtención de una cinética de acidificación sustancialmente independiente del contenido de la leche en sus componentes, con la cinética de acidificación de la leche en presencia de una cepa progenitora de la cepa mutante; - la selección de las cepas de Streptococcus thermophilus mutantes capaces de acidificar la leche según cinéticas de acidificación variables en comparación con las cinéticas de acidificación de cepas progenitoras NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 12

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