INTRODUCCION A LA PROTEOMICA

Transcripción

1 INTRODUCCION A LA PROTEOMICA JUAN JOSE CAZZULO IIB-INTECH, UNSAM-CONICET San Martin, Buenos Aires, Argentina 1

2 GENOMA Y PROTEOMA GENOME: GENes and ChromosOMEs (Winkler, 1920): Conjunto completo de los cromosomas y sus genes. PROTEOME: Conjunto completo de las proteínas de un organismo (el conjunto de proteínas codificadas por un genoma, Wilkins y Williams, 1994; Wasinger et al., 1995). DETERMINACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES Determinación de las características químicas, bioquímicas y biológicas de las proteínas. 1) Estructura molecular. 2) Modificaciones post-traduccionales. 3) Capacidad de unir ligandos. 4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion intracelular. 5) Especificidad de tejido, célula y organela. 6) Especificidad de sexo. 7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post natal y de envejecimiento. 2

3 Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás. 3

4 HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES? NO. Hay frecuentemente mas de una proteína proveniente de un único gen. Causas principales: 1) Splicing alternativo: A nivel de la maduración del mrna. Diferentes proteínas armadas usando diferentes combinaciones de exones. 2) Modificación post-traduccional: La proteína es modificada después de la traducción, ya sea procesándola proteolíticamente, o modificando quimicamente residuos de aminoácidos, o de ambas maneras. 4

5 MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. Muchas proteínas no están terminadas cuando se completa la traducción, y requieren madurar, a través de modificaciones posttraduccionales. Estas modificaciones pueden consistir en: Modificación covalente de residuos de aminoácidos: Se estima que hay más de 200 modificaciones posibles en las proteínas, y que hay complejos sistemas regulatorios que controlan esas modificaciones. Se piensa que entre el 5 y el 10 % de los genes de un mamífero codifican proteínas que modifican otras proteínas. Proteólisis parcial. Las modificaciones pueden ser: Reversibles o irreversibles. Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas. Enzimáticas o no enzimáticas. Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales tardías. 5

6 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MAS COMUNES EN LAS PROTEINAS. - Formación de puentes disulfuro. - N- y O- glicosilación (Asn, Ser/Thr). - Fosforilación (Ser/Thr; Tyr; His; Arg; Lys; Asp o Glu) - Acetilación (N-terminal) - Amidación (C-terminal) - Remoción reversible del C-terminal en tubulinas. - Metilación (Leu, Isoprenil-Cys, Lys, Arg, His) - Hidroxilación (Pro, Lys) - Sulfatación (Tyr) - ADP-ribosilación - Modificaciones para inserción en membranas: - Palmitoilación y miristoilación. - Prenilación (farnesilación, geranilgeranilación). - Unión de ancla de glicosil fosfatidil inositol. - Procesado proteolítico: - Remoción del péptido señal. - Remoción de dominios pro- - Procesamiento de precursores hormonales, poliproteínas virales. - Splicing de proteínas. 6

7 ALGUNAS SECUENCIAS CONSENSO PARA MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. 1) N-Glicosilación: N*XT/S (X no puede ser Pro). 2) O-glicosilación: PXS*/T*XXP 3) Fosforilación: Ser/Thr: RRXS* ; KRXXS* ; K/RK/RXS*/T* ; K/RS*/T*XK/R; K/RS*/T*P Tyr: K/RXXXD/EXXXY* 4) Sulfatación: XE/DY*X 5) Prenilación: C*AAX ; C*C ; C*XC* (en el C-terminal). 6) Miristoilación: M-G*XXXS/T 7

8 LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS. Para la funcionalidad adecuada de una proteína se requiere mucho mas que la integridad del gen estructural que la codifica. Si este está mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la proteína no será funcional. Pero puede suceder algo parecido si el gen estructural está intacto, pero hay mutaciones en otros genes que participan en lo que realmente le interesa a la célula, que es la proteína perfectamente plegada, con las modificaciones posttraduccionales requeridas y localizada en el compartimento subcelular correcto. genes: Se requerirá la integridad y funcionalidad correcta de otros 8

9 a) Los que codifican a enzimas que introducen modificaciones post-traduccionales. b) Los que codifican proteinasas de procesamiento. c) Los que codifican proteínas requeridas para el transporte e integración de la proteína en el compartimento correcto. d) Los que codifican enzimas que catalizan la degradación de la proteína. e) Los genes regulatorios que codifican factores de transcripción necesarios para la expresión de la proteína. f) Secuencias regulatorias, como enhancers, etc. g) Genes involucrados en metilación del DNA, estructura de la cromatina, etc. 9

10 DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA. 1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma humano, y que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más proteínas, el número total de proteínas en un organismo superior puede variar entre 50,000 y 500,000. 2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que los ácidos nucleicos. La composición y secuencia de aminoácidos de una proteína determina: a) su masa molecular; b) su carga total a diferentes valores de ph; c) su hidrofobicidad; d) su forma, es decir el plegamiento de la proteína nativa. Esto a su vez determina la solubilidad de las proteínas en diferentes solventes, su comportamiento en los métodos de separación y purificación, y su vida media in vitro. La diversidad de propiedades fisicoquímicas es muchísimo mayor que la de los ácidos nucleicos. 3) Los valores de pi de las proteínas varían entre menos de 3 y más de 12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5 y el otro alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango estrecho de pi, en la zona ácida. 10

11 4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas, en tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello insolubles en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas totales nunca entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema hidrofobicidad. 5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos miles y varios millones de Daltons, y su tamaño no puede predecirse con certeza a partir de la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de DNA, por las modificaciones post-traduccionales. 6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango muy amplio, probablemente mayor que el rango de los mrnas. La diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras en los flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud. 11

12 MACROMOLECULAS DE UNA CELULA TIPICA HUMANA: 1) DNA: unos 22,000 genes. 2) mrnas: Alrededor de 40,000 moléculas en todo momento, pertenecientes a alrededor de 5,000 especies moleculares diferentes. Un 80 % están en bajos niveles. 3) Proteínas: Unos de moléculas, de las cuales las 100 proteínas más abundantes constituyen alrededor del 90 % de la masa proteica total celular. La diferencia entre las proteínas de mayor abundancia, como la actina, y las de menor abundancia, como proteínas regulatorias, es de alrededor de de veces. 12

13 LAS HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DEL PROTEOMA La técnica principal utilizada es la separación de las proteínas por electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, seguida de identificación de dichas proteínas por secuenciación o por espectrometría de masa, en general después de hidrólisis enzimatica parcial. Actualmente se utilizan otras combinaciones de técnicas, por ejemplo cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien combinada con espectrometría de masa. Se está trabajando activamente en la identificación por métodos similares de proteínas en mezclas complejas, previa hidrólisis enzimática parcial. 13

14 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Electrophoresis 2000, 21,

15 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA. Ventajas: Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000 proteínas en un solo gel. Ninguna otra técnica es capaz de analizar simultáneamente miles de proteínas. Desventajas: 1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes condiciones de rango de ph y de concentración de acrilamida, para resolver las mezclas muy complejas. 2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy ácidas o muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas). 3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden variar en concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver proteínas minoritarias, es necesario en general purificar la organela en que se encuentran y trabajar con ese material. Tambien se puede trabajar previa marcación radioactiva, para aumentar la sensibilidad de detección. 15

16 NUMERO DE MANCHAS PROTEICAS REVELADAS EN GELES GRANDES DE 2-DE A PARTIR DE TRES ORGANOS DE RATON. Fracción tisular Número de manchas Hígado Cerebro Corazón (A) Sobrenadante (buffer) 9,204 8,458 4,790 (B) Extracto del pellet (urea, CHAPS) 1,975 1,692 1,470 (C) Pellet suspendido, DNA digerido Manchas totales por órgano 11,252 10,200 6,300 NOTA: Las manchas contadas en (A) no están en (B) ni en (C), y así sucesivamente. (A) son probablemente proteínas citosólicas; (B) de organelas, y (C) proteínas cromosomales, como las histonas. LOS EXTRACTOS CONCENTRADOS DE ORGANELAS REVELAN MUCHAS PROTEINAS MINORITARIAS. 16

17 Relationship between protein copy number and cell level μ g ng pg fg Coomassie silver 1x10 4 1x10 5 1x10 6 1x10 7 1x10 8 1x10 9 1x10 10 (1 μg) (10 μg) (100 μg) (1mg) (10mg) (100mg) (1g) # of cells loaded on gel (Protein quantity) 10 copies/cell 1000 copies/cell copies/cell nmole pmole fmole amole R. Simpson, LICR, Melbourne, Australia 17

18 Prefix # molecules Amount BSA 1 mole 6x kg 1 mmole 6x g 1 µmole 6x mg 1 nmole 6x µg 1 pmole 6x ng 1 fmole 6x pg 1 amole 6x fg 1 zmole 6x ag 1 ymole 6x zg 18

19 ID OF PROTEINS BY EDMAN vs MALDI-ToF-MS EDMAN DEGR. MALDI-ToF-MS Sensitivity Low pmole Low fmole Clean-up? Yes No Running cost US$ 150/peptide < 1 /analysis Analysis time Overnight A few min # Cell culture flasks needed PTM analysis? Only using std s Possible (?) 19

20 Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) Utilized to identify SUMO-targets in yeast by Wohlschlegel and co-workers. 1) Yeast expressing an 8His-tagged yeast SUMO (Smt3). Control, an untagged yeast strain. 2) IMAC affinity chromatography under denaturing conditions. 3) Digestion by sequential addition of LysC and Trypsin. 4) Chromatography on a triphasic microcapillary column loaded with a strong cation exchange (SCX) resin flanked by two segments of reverse phase (RP) material. 5) Elution directly into the mass spectrometer, peptide fragmentation by CID and recording of MS/MS spectra. 6) Analysis of the data using appropriate algorithms, and substraction of the proteins identified in the control sample. 20

21 Analysis of membrane proteins from mouse brain by multidimensional chromatography. Frozen mouse brain extracted in 5 steps (the last buffer containing SDS). Samples submitted to 1D-PAGE; 4 mm slices separately digested with trypsin. Peptide separation by cation-exchange chromatography; eluate fed on line to ESI mass spectrometer, and MS/MS analysis performed. Data analysed and 126 membrane proteins identified (twice as many as when 2D PAGE was used). Lohaus, C. et al. (2007) J. Proteome Res. 6,

22 Strategy of protein identification by peptide mass fingerprinting. (A) The unknown protein is excised from a gel and converted to peptides by the action of a specific protease. The mass of the peptides produced is then measured in a mass spectrometer. (B) The mass spectrum of the unknown protein is searched against theoretical mass spectra produced by computer-generated cleavage of proteins in the database. 22

23 Protein identification by MS/MS. (A) Protein from P. falciparum was resolved on a one-dimensional polyacrylamide gel, excised, and ingel digested with trypsin. The resulting peptides were ionized by electrospray and analyzed by a Quadrupole-TOF mass spectrometer. (B) The MS spectrum produced was scanned, and a parent ion of was selected for fragmentation. (C) Enlargement of the parent ion peak at 678 shown in panel B. The multiplet of peaks is due to the contribution in mass from the naturally occurring isotope 13C. A mass difference between the peaks of 0.5 Da indicates that the peptide is doubly charged. (D) MS/MS scan of the 678 parent ion and analysis of the daughter ions produced. All y-ions (except for y-11) produced from fragmentation of the peptide are shown. (E) Identification of rhoptryassociated protein-2 using BioAnalyst software (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). 23

24 Comparative 2-D analysis of silver stained soluble proteins from L. infantum promastigote and axenic amastigote cells that were recovered from in vitro cultures at mid-log phase. The soluble protein fractions (150 microg of proteins) were separated by IEF (pi 6 11) and gradient SDS-PAGE (20 to 90 kda). The first dimension IEF and the second-dimension separation were conducted as indicated in Section 2.3. The protein images were analyzed using PDQuest image analysis software. Encircled protein spots numbered from correspond to differentially expressed proteins in L. infantum axenic amastigotes. The apparent molecular masses of marker proteins and the ph range of the IPG strips are indicated. A J correspond to ten landmarks chosen for testing 2-D gel reproducibility. 24

25 Sixty-two Leishmania infantum protein spots differentially expressed in axenic amastigotes were detected by analyzing several narrow ph 2-D gels using PDQuest image analysis software. Immobiline DryStrips ph 3 10, ph 4 7, ph 5 6 and ph Some of these differentially expressed proteins are indicated in Fig. 1. Spots indicated with asterisk were used for MS/MS studies. 25

26 Protein expression profiling by 2-DE. Whole-cell lysates from nontransformed and Abelson murine leukemia virus (AMuLV)-transformed mouse fibroblasts were resolved by 2-DE, and proteins were visualized by silver staining. Differentially expressed proteins were excised from the gel and identified by MS. 26

27 DIFFERENCE GEL ELECTROPHORESIS (DIGE). Fluorescent tagging of the two protein samples to be compared with two different dyes, amino reactive, and designed to keep the same relative mobility. The tagged protein samples are mixed and run in the same 2D gel. After the run fluorescence imaging of the gel is used to create two images, which are superimposed to identify pattern differences. This technique makes unnecessary to compare different gels. It is commercially available. 27

28 Isotope-coded affinity tags (ICAT) The ICAT method for measuring differential protein expression. (A) Structure of the ICAT reagent. ICAT consists of a biotin affinity group, a linker region that can incorporate heavy (deuterium) or light (hydrogen) atoms, and a thiol-reactive end group for linkage to cysteines. (B) ICAT strategy. Proteins are harvested from two different cell states and labeled on cysteine residues with either the light or heavy form of the ICAT reagent. Following labeling, the two protein samples are mixed and digested with a protease such as trypsin. Peptides labeled with the ICAT reagent can be purified by virtue of the biotin tag by using avidin chromatography. Following puri fication, ICAT-labeled peptides can be analyzed by MS to quantitate the peak ratios and proteins can be identified by sequencing the peptides with MS/MS. 28

29 Application of serum proteomics to the Women s Health Initiative conjugated equine estrogens trial reveals a multitude of effects relevant to clinical findings. Katayama H et al. (2009) Geneome Medicine 1, 47. Además, ver S.J. Pitteri et al. (2009) Genome Medicine 1, 121. Sera from 50 women at baseline and 50 women after an year of estrogen therapy (ET) with conjugated equine estrogens. 5 pools of sera from each group were immunodepleted of the 6 most abundant proteins (albumin, IgG, IgA, transferrin, haptoglobin and antitrypsin) with an affinity column. The samples were treated with 8 M urea, reduced with DTT, and isotopically labelled in Cys residues with C12 (baseline) or C13(estrogen treated) acrylamide. Each sample was divided into 12 subsamples by Mono Q chromatography, and each was further divided into 60 fractions by reversed-phase chromatography (Poros R2 column). Fractions were lyophilized, dissolved, and digested in solution with trypsin. Fractions 4-60 from each RP run were pooled in 12 pools, giving 132 total fractions from each experiment. Tryptic peptides were analyzed with an LTQ-FT mass spectrometer, and submitted to MS/MS analysis. Quantitative changes after ET in 116 serum proteins related to coagulation, metabolism, osteogenesis, inflammation and blood pressure maintenance could be detected; 10 were confirmed by ELISA. The technique used (Intact protein analysis system, IPAS) allows identification of proteins over 7 orders of magnitude. 29