ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM (MS/MS): SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS. Ionización por electrospray (ESI) Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)

Transcripción

1 ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM (MS/MS): SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS Ionización por electrospray (ESI) Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)

2 Identificación de proteínas Separación detección Adquisición de la imagen Análisis de imagen digestión Corte Mezcla de péptidos Caracterización automática MALDI-MS Huella péptica ESI(MALDI)-MS/MS Secuencia de novo Etiqueta de secuencia Búsqueda en bases de datos protein ID

3 Componentes de un espectrómetro de masas Sistema de alto vacío Sistema de entrada Placa HPLC Fuente de iones MALDI Electrospray API FAB/LSIMS EI, CI Analizador TOF Cuadrupolo Trampa de iones Sector Magnético FTMS Detector Proceso de datos Placa microcanal Multiplicador de electrones Sistemas híbridos

4 Ionización por electrospray

5 Electrospray: introducción Proceso de generación de iones en forma gaseosa a partir de una muestra líquida, al aplicar un alto voltaje. Acoplado a Cromatografía líquida. Produce iones multicargados. La ionización desde líquido: el analito recibe poca E interna. No hay fragmentación en la fuente.

6 Electrospray: mecanismo

7 Ionización por electrospray No se observa fragmentación: La ionización desde líquido: el analito recibe poca E interna Solvente típico: Agua/modificador orgánica/bajo % ácido volatil (agua/acetonitrilo/ácido trifluoroacético) Acoplable a cromatografía líquida o electroforesis capilar Iones con distinta carga: Representación m/z

8 ESI: Preparación de la muestra Tipo y concentración de los excipientes - La calidad de los datos de depende de ella - Menor cantidad posible de tampones, sales, detergentes (evitar los iónicos) - Para la digestión enzimática: tampones volátiles (bicarbonato o acetato amónico) Purificación de la muestra - Columna de fase reversa: elección, puede ser on line o off line - Ultrafiltración, precipitación con TCA, microdiálisis, cromatrografía de exclusión, electroforesis y digestión

9 ESI: por que se prefracciona... Purificación de la muestra -Columna de fase reversa: elección, puede ser on line o off line. -La muestra también puede purificarse previo a la digestión mediante sefarosa. Reduce complejidad de muestras Se eliminan contaminantes Concentración de analito Se puede acoplar directamente a MS Automatización

10 ESI: micro versus nanospray LC nanolc MS MS

11 ESI: micro versus nanospray Microspray Flujo 3µl/min 1ml/min Nanospray 100nl/min - 3µl/min Flujo óptimo: 200 µl/min 200 nl/min Necesita gases auxiliares Sin gas auxiliar Columnas ID 1mm 4.6mm 0.075mm 0.3mm

12 Que es MSMS? MS/MS usa 2 analizadores de masa (combinados en un instrumento) para seleccionar un analito (ion) de una mezcla, entonces genera fragmentos del ion aislado para obtener información estructural. Mezcla de iones Ion source 1 único ión MS-1 Fragmentos MS-2

13 Que es MSMS? Mezcla de péptidos Se selecciona 1 péptido para MS/MS MS/MS + + Masas de los iones precursores Las masas de todos los fragmentos dan un epectro MS/MS

14 Interpretación de un espectro MSMS Con las masas de los iones de los fragmentos, se deriva la información estructutural,como reolver el puzzle.

15 MS/MS para secuenciación de péptidos Identificación de proteínas de genomas no secuenciados CID: Disociación inducida por colisión Fragmentación de un ión seleccionado y aislado mediante choque con un gas inerte como el Nitrógeno o el Argón Son colisiones de baja energía Los iones se fragmentan frecuentemente por los enlaces peptídicos dando lugar a una escalera de iones peptídicos característica de la secuencia del péptido.

16 CID:Disociación inducida por colisión + F L G b +3 F L b2 + + F L G K + + F L G K CID + F b1 Relative Intensity + + F L G K + K y + 1 G K y + F L G K 2 + L G K y 3 y b1 + + F L G K y 1 y K G F L 2 b3 b2 L G 3 F K m/z

17 MS/MS para secuenciación de péptidos Tabla de tamaños de aminoácidos Tabla de tamaños de dipéptidos

18 MS/MS para secuenciación de péptidos

19 Secuenciación de péptidos

20 Análisis mediante Sotfware: Resultados

21 Análisis del espectro y obtención de la secuencia Manual Muy complejo. Necesita personal con experiencia. Incluye seleccionar picos correspondientes a las series y y b Tener en cuenta perdidas de agua, amonio, etc etc Mediante Sotfware Actualmente: espectrómetros provistos de Sotfware Cuando no es muy claro el resultado se da en probabilidades

22 IDENTIFICACIÓN DE Cis3p/Pir4p MEDIANTE nanoesms/ms Center 4 (Cen,2, 80.00, Ht) 22-Jul-99 14:44 * % * MALDITOF MS NanoES-MS/MS [MH2] Product (415): from JC8/C4/Dau415.4b e5 3.4e M/z e5 cps e5 3.0e e5 2.6e5 Intensity, cps 2.4e5 2.2e e5 1.8e5 1.6e e5 1.2e e V S I/L G 8.0e e e e m/z, amu

23 MS/MS para secuenciación de péptidos Secuenciación total: -Permite identificación de proteínas: -en bases de datos -por homología con proteínas de otras especies (genomas no secuenciados) -Primer paso para la construcción de sondas y clonación de genes no secuenciados Etiqueta de secuencia: datos -Permite identificación de proteínas en bases de

24 ESPECTROMETRÍA DE MASAS ANALIZADORES - TIEMPO DE VUELO - CUADRUPOLO - TRAMPA DE IONES

25 Espectrometría de masas en tandem (MS/MS) A) Espectrómetros de masas en tandem en el espacio: 1 analizador para cada paso (Ej: triple cuadrupolo, TOF-TOF, combinaciones de cuadrupolo y TOF) B) Espectrómetros de masas en tandem en el tiempo: - 1 único analizador (Ej: trampa iónica)

26 Espectrometría de masas en tandem

27 Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)

28 Espectrometría de masas en tandem (MS/MS) A) Espectrómetros de masas en tandem en el espacio: Varios analizadores, triple cuadrupolo, TOFTOF, combinaciones de cuadrupolo y TOF B) Espectrómetros de masas en tandem en el tiempo: - 1 único analizador (Ej: trampa iónica)

29 MALDI-TOF-TOF: MALDI en espectrometría de masas en tandem: - Analizadores TOF en tandem

30 Tandem MS/MS Spectrometer Precursor Ion Selector Re-Accelerates Fragments TOF 2 Separates Fragments Detector Mass Analyzer #2 Induces Fragmentation of Precursor Ion Source #2 TOF 1 Separates Ions Collision Cell Mass Analyzer #1 Ion Source #1 Generates and Accelerates Ions

31 AB 4700 TOF/TOF Ion Optics Select mass MS/MS mode TIS TOF 1 Ion Source TOF 2 Collision Cell Reflector Ionize Sample Break into fragments Analyze fragments

32 Mass (m/z) tb tb kab p M,alf,p p % Intensity 4700 Reflector Spec #1[BP = , 38875] 3.9E

33 4700 MS/MS Precursor Spec #1[BP = 701.4, 24936] E % Intensity Mass (m/z)

34 CUADRUPOLO, analizador de masa 4 electrodos de metal en forma de rodillos, paralelos y de longitud 5-11 cm. Cambia alternativamente la polaridad de los electrodos Permiten avanzar los iones a lo largo de un solo eje: z Usa una combinacion de radiofrecuencia RF y corriente continua DC opuestas para funcionar como un filtro de masa creando un campo cuadrupolar. Potencial aplicado U+V cos ϖ t U voltaje de DC V cos ϖ t voltaje RF dependiente t V amplitud RF ϖ frecuencia de RF

35 Cuadrupolos tienen varios modos de transmision de iones. m2 m4 m1 m4 m3 m2 m1 m3 mass scanning mode RF Puede escanear todas las masas o a una masa fija m2 m4 m1 m3 m2 m2 m2 single mass transmission mode Selecciona una masa en un tiempo. m2 RF+DC

36 Espectrometría de masas en tandem (MS/MS):TRIPLE CUADRUOPOLO

37 ESI: acoplado a trampa iónica

38 Ion Trap Mass Analyzer Top View Electrodo en forma de anillo con 2 tapas en los extremos. La trampa de iones genera un campo cuadrupolar para atrapar los iones en una cámara 3D Cambiando las características del campo, los iones pueden ser retenidos o expulsados de la trampa. Cut away side view

39 Espectrometría de masas en tandem (MSn):Trampa ionica 1) 2) 3) 4) Atrapamiento (Trapping) Aislamiento (Isolation) Excitación (Excitation) Expulsión (Ejection)

40 Trampa iónica: características y utilidades Rango de masas: low mass ( amu). Puede ser configurada para rangos mayores (hasta ). Nuevas actualizaciones de software permiten también trabajar por debajo de 200. Resolución y precisión son menores que en otros equipos. Presenta unas velocidades de barrido altas que lo hacen ideal para el análisis de muestras complejas Puede realizar MSn experiments. Esto es útil para obtener información estructural de los analitos. (fosfoproteómica...)

41 Trampa iónica: fragmentaciones RT: Base peak chromatogram Relative Abundance alphabeta10fmole1_2msms #3148 T: + c ESI Full ms [ ] RT: MS Time (min) alphabeta10fmole1_2msms #3149 RT: T:c ESI Full ms @22.00 [ ] MS/MS m/z m/z MS/MS/MS Relative Abundance alphabeta10fmole1_2msms #3150 RT: T:c ESI Full ms @ @22.00 [ Relative Abundance Relative Abundance m/z 1500

42 Espectrometría de masas en tandem 1. Product ion-scans : Estudio de iones-producto Utilizado para secuenciación de péptidos 2. Precursor ion-scans : Búsqueda de ionesprecursores Utilizado para detectar y seleccionar péptidos que comparten alguna característica estructural: ej: modificaciones post-traduccionales. Ej, el ion imonio de la tirosina y la tirosina fosforilada.

43 Espectrometría de masas en tandem 3. Neutral loss Scan : Búsqueda de pérdidas neutras. Utilizado para modificaciones post-traduccionales. Ej, el grupo fosfórico de 98 Da. ejemplo

44 Proteómica sin gel: 2D nano LC MALDI -TOF/TOF 1. Digestión en solución 7. Búsqueda en DB 2. 1D SCX 5. MS 6. MS/MS 3. 2D nano LCRP 4. Recolección de fracciones y adición simultánea de la matriz

45 Proteómica de expresión diferencial sin gel Lucía Monteoliva Díaz

46 Proteómica de expresión (Patterson & Aebersold, Nature genetics, 2003) 1. Flujo de trabajo clásico: Aproximaciones en gel 2-DE y tinción de plata u otros métodos de detección 2. 2D-DIGE: Cy3/Cy5 or Cy3/Cy5/Cy2 Proteómica de Expresión Marcaje con isótopos estables y MS: Aproximaciones basadas en MS 1. Marcaje metabólico (SILAC), 2. Marcaje químico (ICAT, itraq) 3. Marcaje enzimático SELDI-TOF

47 Proteómica de expresión diferencial Marcaje con isótopos estables 2DE Cuantificación basada en intensidad DIGE Marcaje in vivo Marcaje in vitro SILAC Péptido N-terminal itraq Péptido C-terminal 16 O/18O Vía proteolisis Marcaje de aminoácidos ICAT

48 Procedimiento experimental para muestras complejas: 2D nano LC MALDI -TOF/TOF 1. Muestra marcada con reactivos itraq 7. Búsqueda en DB y cuantificación relativa: Proteínas de expresión diferencial 2. 1D SCX 5. MS 6. MS/MS 3. 2D nano LCRP 4. Recolección de fracciones y adición simultánea de la matriz

49 Proteómica de expresión: aproximaciones basadas en MS Basadas en marcaje diferencial con isótopos estables Aebersold and Mann, Nature, 2003

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51 Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, for the in vivo incorporation of specific amino acids into all mammalian proteins. Leucine D3, Arginine 13C6

52 STABLE ISOTOPE TAGGING: Applications SILAC Sample A Sample B H/12C/14Nlabelled aa 1 H/13C/15Nlabelled aa 2 Sample combination Cell lysis Protein-Protein interactions: EFG pathway studies Early stages of cell spreading studies Protein-Peptide interactions: EFG pathway studies Denaturation and reduction Identification of lipid raft proteins Digestion Clinical Studies: prostate cancer μlc-ms Abundance ratio Phosphoproteomics Peptide identification

53 Isotope-coded affinity tag (ICAT)

54 Isotope-coded affinity tag (ICAT) Cleavable ICAT Reagents Incorporates 13C rather than deuterium into the heavy reagent, which results in the co-elution of ICAT reagent labeled pairs from the reversedphase column, which improves peptide quantification measurements. Incorporates an acid-cleavable site in the reagent, which lets you remove the biotin portion of the ICAT reagent tag prior to MS and MS/MS analysis.

55 STABLE ISOTOPE TAGGING: Applications ICAT Sample A Sample B Subcellular location of membrane proteins Denaturation and reduction Macromolecular complexes Identification of chromatin-associated proteins Labelling light ICAT Study of Ste12 protein complex from yeast Combination and digestion Changes in transcription factor complexes Cation-exchange cartridge Bacterial μlc-ms m/z Murine cells Cystic fibrosis Prostate cancer E. coli infection Intensity Clinical applications: XIC MS/MS Intensity Yeast Avidin affinity cartridge Intensity Changes in global proteome Labelling heavy ICAT Intens. x10 4 L H Retention time Abundance ratio (light/heavy) Peptide identification m/z

56 Nuevos marcajes: itraq Diseño del reactivo Etiqueta isobárica (Masa total = 145) Ion reporter Balance Con carga PRG Neutro Proporciona señal específica en Compensa cambios de Específico MS/MS de amina masa en la etiqueta Proporciona buenas series y- y bisobárica para mantener Mantiene la carga de los péptidos una masa total de 145 Mantiene la eficiencia de la Pérdida neutra en ionización de los péptidos MS/MS La señal de los iones reporter se encuentra en una zona tranquila del espectro Marcaje isobárico (Masa total = 145) Reporter (Masa = ) Grupo peptídico reactivo PRG Balance (Masa = (145 reporter))

57 Marcaje isobárico Método general (4-Plex) PRG + TPHPALTEAK-* PRG + TPHPALTEAK-* TPHPALTEAK-* 31 -N H 114 -N T P H P A L T E A K-* H 115 TPHPALTEAK-* 30 -N H 115 -N T P H P A L T E A K-* H 29 -PRG + TPHPALTEAK-* 116 TPHPALTEAK-* 29 -N H 116 -N T P H P A L T E A K-* H 28 -PRG + TPHPALTEAK-* 117 TPHPALTEAK-* 28 -N H 117 -N T P H P A L T E A K-* H Mix 114 CID Fragmentation mismos fragmentos peptídicos pero iones reporter DIFERENTES ion parental mismo MS (grupo reporter-balance intacto) y Mass (m/z) y11 b9 y9 b Mass (m/z) b7 y6 b6 y5 y4 y3 y y b4 b2 b q,h b10 P A T L % Intensity Mass (m/z)

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59 Proteómica de expresión diferencial: itraq Isobaric tag for relative and absolute quantitation Permite analizar de forma simultánea hasta 8 muestras distintas en un único experimento de LC-MS/MS Permite analizar duplicados o triplicados en el mismo experimento Marca múltiples péptidos por proteína, mejorando la fiabilidad de la identificación y la cuantificación Conserva las PTMs