ESPECTROMETRIA DE MASA. Biofísica 2014

Transcripción

1 ESPECTROMETRIA DE MASA Biofísica 2014

2 Espectrometria de Masa What is Mass Spectrometry? John B. Fenn (electrospray ionization for biomolecules and the 2002 Nobel Laureate in Chemistry): Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine their molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient, frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species. To practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte, then measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to various combinations of electric and magnetic fields.

3 Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry) Espectroscopia o Espectrometria?? Técnica analítica determina la relación masa(m):carga(z); m/z de una muestra. Masa molecular Información estructural Analogía entre un espectrómetro de masa y un prisma

4 Espectrometria de Masa Métodos analíticos que permite la detección y caracterización de moléculas (biomoléculas de bajo y alto peso molecular). proteomics, glicomics, lipidomics, metabolomics, foodomics, glicoproteomics

5 Espectrometria de Masa Revisión histórica 1897 J.J. Thomson, primer medida m/q de partículas elementales corpúsculos A. Dempster & F. Aston, primer espectrógrafo de masa 1951 W. Pauli & H. Steinwedel, espectrómetro de masa de cuadrupolo 1959 K. Biemann, MS electroionización aplicada a péptidos M. Dole, polimeros naturales y sintéticos en fase gaseosa a presión atmosférica 1974 D. Torgerson, plasma desorption MS (fisión de 252 Cf) 1974 B. Mamyrin, contribución al desarrollo de TOF MS 1978 N. Commisarow & A. Marshall, adaptación de métodos de transformadas de Fourier a ICRS, ion cyclotron resonance spectrometry 1981 M. Barber, FAB; fast atom bombardment, masa de Met-Lys-bradykinin M= R. Willoughby & M. Aleksandrov (trabajos independientes) proponen acoplar LC a MS 1988 J. Fenn & M. Yamashita (trabajos independientes) macromoléculas biológicas en fase gaseosa a presión atmosférica, ESI, electrospray ionization. M. Karas & F. Hillencamp y K. Tanaka (trabajos independientes) desrrollan MALDI, matrix assisted laser desorption-ionization. 2002, K. Tanaka recibe premio Nobel Especificidad y Sensibilidad MALDI-MS 2000-presente Desarrollo de MS como técnica analítica en ciencias biológicas

6 Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa Información? Determinación del Peso Molecular (MW) Determinación de la formula molecular (peso molecular con alta resolución) Determinación de la estructura de un compuesto (patrón de fragmentación) Cuantificación de un compuesto en una mezcla (diseño de método, MS no es técnica cuantitativa), cuantificación relativa.

7 Espectrometria de Masa Aplicaciones Biológicas MS técnica analítica importante para Biología Estructural Producción de iones de alto peso molecular en fase gaseosa (macromoléculas biológicas) Desarrollo de técnicas de ionización suaves como FAB, MALDI, ESI Desarrollo de métodos ultrasensibles para caracterización de proteínas basados en Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTIR-MS), límite de detección de 30 zmol (30x10-21 mol) para proteínas de masa molecular 8 20 kda. Utilización de MS: Determinación precisa de masa molecular de proteínas y ac. nucleícos, amplio rango de masas Secuenciación de péptidos y oligonucleótidos Identificación de modificaciones post-traduccionales Cambios estructurales en proteínas, plegamiento y dinámica Identificación de proteínas (cantidades subpicomolares) de 2D-electroforesis Identificación por marcado isotópico

8 Espectrometria de Masa Espectrometria de Masa (MS: Mass spectrometry) C + A + B + Ión gaseoso Análisis A + B + Detección C + Ionización / volatilización RI C A B analito m/z Espectro de masa

9 Espectrometria de Masa - Espectro Espectro de MASA de una molécula, (% de abundancia relativa o intesidad relativa) vs. relación MASA/CARGA Espectro de Masa de metanol

10 Espectrometria de Masa Iones en campos eléctricos y magnéticos ión acelerado por una fuente externa, adquiere E. cinética (E kin ) E kin = z * V acc = mv 2 2 Z: carga del ion Vacc: diferencia de potencial en región de aceleración m: masa del ion v: velocidad del ion partícula cargada, en campo magnético homogéneo (B), perpendicular a trayectoria, fuerza de Lorentz F, trayectoria, círculo de radio r. F = zvb = mv2 r Relación m/z m Z = B2 r 2 = 2Vacc Partícula cargada en campo Eléctrico y Magnético

11 Espectrometria de Masa Resolución de masa y exactitud de masa Exactitud (accuracy) de la medida de masa molecular es la diferencia entre la masa medida y la calculada (teórica) para cierto ión Expresada como: % de la masa medida: masa molecular = 10000±0.01% ppm de la masa medida: masa molecular = 10000±100ppm

12 Espectrometria de Masa Resolución de masa y exactitud de masa, masa promedio

13 Espectrometria de Masa Resolución de masa y exactitud de masa, masa promedio

14 Espectrometria de Masa Espectrómetro de Masa Primer espectrómetro de masa: 1913, J.J. Thomson Campos eléctricos y magnéticos fijos para separar isótopos de Ne, por diferencia de comportamiento de partículas cargadas (diferentes momentos y energías) en un campo electromagnético. SAMPLE ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS

15 Espectrometria de Masa Espectrómetro de Masa Tratamiento de la muestra INYECCIÓN de la muestra, directa o con tratamiento previo (sample injector) IONIZACIÓN de la muestra (ion source) SEPARACIÓN de los iones con diferentes m/z (mass analyzer) DETECCIÓN del número de iones producidos (detector) COLECCIÓN de datos, generación del espectro de masa

16 Espectrometria de Masa - Espectrómetro Espectrómetro de Masa SAMPLE ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS 3 partes básicas, alto vacio (no siempre) Muestra ionización- analizador de masa, separación de acuerdo a su relación m/z detección señal enviada a sistema de análisis de datos (señal en función de m/z) Generación del Espectro de masa, (No. de cuentas, % abundancia relativa) vs. m/z

17 Espectrometria de Masa - Espectrómetro Figure 1.2. Components of a mass spectrometer. Note that the ion source does not have to be within the vacuum of the mass spectrometer. For instance, ESI and APCI are at atmospheric pressure and are known as atmospheric pressure ionization (API) sources.

18 Espectrometria de Masa - Muestra SAMPLE La elección depende de la fuente de ionización utilizada y de la complejidad de la muestra, ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS Inyección directa Separación previa x cromatografía (HPLC, GC, CE) Espectrometría de Masa / Cromatografía: productos separados x cromatografía introducidos en espect. masa de manera secuencial (GC/MS, LC/MS, CE/MS). Compuestos eluídos, colectados y luego analizados en el espectrómetro, off-line Acoplamiento directo del cromatógrafo al espectrómetro de masa, on-line

19 Espectrometria de Masa - Muestra Separación de la muestra previo al análisis por MS Liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry. Liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) Gas chromatography mass spectrometry (GC/MS) produces results in much the same way as LC/MS, however, GC/MS uses an electron ionization source, which is limited by thermal vaporization.

20 Espectrometria de Masa Método de Ionización Iones desde la solución a la fase gaseosa Transferencia de iones de fase gaseosa a solución: Solvatación Transferencia de iones de solución a fase gaseosa: Proceso de desolvatación Endergónico No espontáneo Ejemplo: Na + en fase acuosa a fase gaseosa, Ea = 98kcal/mol En métodos de MS, E requerida es elevada, producida por cascada de colisiones o por calentamiento altamente localizado Producción de iones 1- por remoción de e -, CATION (+) 2- por adición de un e -, ANION (-) 3- por remoción o adición de protones. La MASA del ión resultante difiere en ± 1, de la masa original

21 Espectrometria de Masa Método de Ionización Producción de iones: depende del método de ionización todas las fuentes de ionización pueden actuar en modo + o modo - 1- Intercambio de e - Modo + M.+ remoción de e -, CATION (+) Modo - M - adición de un e -, ANION (-) 2- por remoción o adición de protones (cationes monovalentes) Modo - (más simple) pierde H +, [M-H] -, ANION (-) Modo + gana ión + (W+), H+, Na+, K+ [MW] +, CATION (+) Tener en cuenta el modo para el cálculo de la masa molecular

22 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Elección de la fuente de ionización - propiedades fisicoquímicas de la muestra y en la energía interna transferida durante el proceso de ionización. Compuestos volátiles y termoestables: sistema de ionización en fase gaseosa, EI (electron ionization), CI (chemical ionization) y FI (field ionization) Compuestos lábiles y/o no volátiles: sistema de ionización donde los iones son extraídos desde fase condensada a fase gaseosa. fuente de ionización de fase líquida (analitos en solución), ESI, APCI, APP. fuente de ionización de fase sólida (analitos en fase no volatil), matriz sólida o de fluido viscoso, MALDI, plasma desorption (PD). FAB utiliza matriz liquida no volatil. Metodos de ionización mas utilizados en bioquímica: Electrospray Ionisation (ESI) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) La mayoría permite la generación de iones cargados + y (dependiendo de la muestra)

23 Espectrometria de Masa Método de Ionización Ionization Method Advantages Disadvantages Protonation (positive ions) many compounds will accept a proton to become ionized Ionization sources such as ESI, APCI, FAB, CI and MALDI will generate these species some compounds are not stable to protonation (i.e. carbohydrates) or cannot accept a proton easily (i.e. hydrocarbons) Cationization (positive ions) many compounds will accept a cation, such as Na + or K + to become ionized ionization sources such as ESI, APCI, FAB and MALDI will generate these species tandem mass spectrometry experiments on cationized molecules will often generate limited or no fragmentation information Deprotonation (negative ions) most useful for compounds that are somewhat acidic ionization sources such as ESI, APCI, FAB and MALDI will generate these species compound specific

24 Espectrometria de Masa Método de Ionización Ionization Method Advantages Disadvantages Transfer of charged molecule to gas phase (positive or negative ions) useful when the compound is already charged ionization sources such as ESI, APCI, FAB and MALDI will generate these species only for precharged ions Electron ejection (positive ions) observed with electron ionization and can provide molecular mass as well as fragmentation information often generates too much fragmentation it can be unclear whether the highest mass ion is the molecular ion or a fragment Electron capture (negative ions) observed with electron ionization and can provide molecular mass as well as fragmentation information often generates too much fragmentation it can be unclear whether the highest mass ion is the molecular ion or a fragment

25 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Figure 1.5. A glance at the typical sensitivity and mass ranges allowed by different ionization techniques provides a clear answer to the question of which are most useful; electron ionization (EI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and desorption/ionization on silicon (DIOS) are somewhat limiting in terms of upper mass range, while electrospray ionization (ESI), nanoelectrospray ionization (nanoesi), and matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) have a high practical mass range.

26 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Fast Atom Bombardment (FAB) FAB-MS: ionización por bombardeo de la sup. de muestra por rayo de Ar o Xe acelerados a Energía de kev, E kin 8 10 kev partícula primaria induce colisión en cascada en pequeño volumen de muestra muestra en matriz líquida (glicerol), espectro de masa estable las moléculas de muestra inicialmente cargadas son desorbidas, mientras que la formación de iones moleculares (M+H) + y (M-H) - provienen de la trasnsición entre fase gaseosa y de la solución Desvetajas: alta concentración de matriz órgánica líquida (FAB flujo contínuo) Ventajas: Simple Espectro fácil de interpretar FAB-MS hasta 5kDa.

27 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) (F. Hillenkamp, M. Karas, R. C. Beavis, B. T. Chait, Anal. Chem., 1991, 63, 1193) Apropiado para compuestos orgánicos termolábiles, no volátiles, de alta masa molecular. Utilizada para el análisis de proteínas, péptidos, glicoproteínas, oligosacáridos y oligonucléotidos. La exactitud en el valor determinado de masa depende del tipo y performance del ANALIZADOR de MASA, en equipos modernos aprox. 0.01% en muestras de hasta Da.

28 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) La muestra es pre-mezcladada en una matriz absorbente específica (resultados mas reproducibles y consistentes) Similar a FAB (usa matriz líquida), MALDI técnica de ionización más suave que FAB baja concentración de muestra mejores resultados. Sample plate UV Laser hn 1. Sample (A) is mixed with excess matrix (M) and dried on a MALDI plate. AH + 2. Laser flash ionizes matrix molecules. 3. Sample molecules are ionized by proton transfer from matrix: MH + + A M + AH kv Variable Ground Grid Grid

29 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) the three most commonly used matrices

30 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Analyte: fmol kda

31 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) La matriz es componente clave de la técnica (compuestos aromáticos con grupos funcionales ácidos carboxílicos) Laser para muestras biológicas: IR y UV Método de ionización suave Generación de iones molecular con carga simple (espectro fácil de interpretar) Generalmente NO ocurre fragmentación Modo de ionización positiva, la especie dominante son iones moleculares protonados (M+H) + (aductos de sales, trazas de iones doblemente cargados (a ½ de m/z), trazas especies diméricas (a 2 m/z)) Usos: análisis de péptidos y proteínas Modo de ionización negativa, la especie dominante son iones moleculares deprotonados (M-H) - (aductos de sales, trazas de iones doblemente cargados o de especies diméricas) Usos: análisis de oligonucleótidos y oligosacáridos

32 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) MALDI-MS: Calibración de la escala m/z del espectrómetro: externa, muestra conocida analizada independiantemente interna, muestra conocida premezclada con la muestra y la matriz Fuentes de laser son fuentes pulsadas, MALDI asociado a espectrómetros de masa con analizadores de muestra: TOF (time of flight) FTR-ICR (Fourier transform ion cyclotron resonance) Precisión de masa: ± 0.01% (± 1Da en masas moleculares de 10kDa)

33 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)

34 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Electrospray ionisation Electrospray Ionisation (ESI), dentro de las técnicas de Atmospheric Pressure Ionisation (API) para el análisis de moléculas polares de amplio rango de masa molecular. Very gentle and efficient way of getting gas phase ions from solutions. A fine spray of charged droplets is generated in an electric field. Droplets evaporate -analyte molecules are left carrying charges. Multiply Charged Ions are the rule. Concentration dependent High sensitivity at very low flow rates (<< 1 ul/min).

35 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Electrospray ionisation Electrospray is a concentration-dependent technique. Lower flow rates are favored significantly. Smith et al, Acc. Chem. Res.2004

36 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Electrospray ionisation

37 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Electrospray ionisation Advantages Disadvantages practical mass range of up to 70,000 Da good sensitivity with femtomole to low picomole sensitivity typical softest ionization method, capable of generating noncovalent complexes in the gas phase easily adaptable to liquid chromatography easily adaptable to tandem mass analyzers such as ion traps and triple quadrupole instruments multiple charging allows for analysis of high mass ions with a relatively low m/z range instrument no matrix interference the presence of salts and ion-pairing agents like TFA can reduce sensitivity complex mixtures can reduce sensitivity simultaneous mixture analysis can be poor multiple charging can be confusing especially in mixture analysis sample purity is important (SDS, etc) carryover from sample to sample

38 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Nanospray ionisation Versión de electrospray ionisation, pero de baja velocidad de flujo (M. Wilm, M. Mann, Anal. Chem., 1996, 68, 1) Volúmenes pequeños (1-4 ml), concentraciones de 1 10 pmol/ml alto voltaje ( V) Baja velocidad de flujo del soluto y solvente nl/min (<<<<ESI) Aplicación común: análisis de mezclas digestiones proteicas, las masas moleculares de los componentes de la muestra. Cada componente puede ser analizado por técnicas de secuenciación de aminoácidos por Espectrometria de Masa en Tandem (tamdem mass spectrometry MS-MS)

39 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización ESI and nanospray ionisation Técnicas muy sensible, precauciones con aditivos y bufferes no volátiles Genera especies con multiples cargas, dependiendo de la muestra Se pueden detectar iones de alta masa en bajo rango de m/z Exactitud en la determinación de masa de ESI combinado con FT-MS es % Modo de ionización POSITIVA, agregado de trazas ácido fórmico (evita deprotonación) Modo de ionización NEGATIVA, agregado de trazas de sulfato de amonio o aminas volátiles (evita protonación) Proteínas and péptidos analizados bajo condiciones de ionización positiva Sacáridos and oligonucleotidos bajo condiciones de ionización negativa Calibración de la escala m/z, estándares apropiados ESI es uno de los métodos de ionización más suaves, no produce fragmentación molecular

40 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización ESI Figure 1.8. A theoretical protein with a molecular weight of 10,000 generates three different peaks with the ions containing 5, 4, and 3 charges, respectively. The mass spectrometer detects each of the protein ions at 2001, 2501, and 3334, respectively.

41 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización ESI MS Myoglobin m1 = (M+n)/n m2= (M+n+1)/(n+1) Quasimolecular ions, [M+nH], from myoglobin, Mr= 16,951.5 Da. Using adjacent pairs of ions, the molecular mass of the myoglobin can be calculated very accurately.

42 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización ESI and nanospray ionisation los valores de m/z pueden expresarse como: m/z = (MM + nh + )/n m/z; MM = Masa Molecular de la muestra n = número de carga (entero) H = masa del protón = Da. Si n es CONOCIDO, lectura de m/z dará Masa Molecular de la muestra. Si n No es Conocido, calcular asuminedo que 2 miembros adyacentes de la serie defieren en una unidad de carga.

43 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Ionization Source Electrospra y Ionization (ESI) Comments Typical Mass Range (Da) Matrix Interference Degradation Complex Mixtures 70,000 none none somewhat limited LC/MS Amenable excellent Sensitivity high femtomole to low picomole Excellent LC/MS tool; low salt tolerance (low millimolar); multiple charging useful, but significant suppression with mixture occurs; low tolerance of mixtures; soft ionization (little fragmentation observed). NanoESI 70,000 none none somewhat limited but better than ESI Comments OK but low flow rates can present a problem high zeptomole to low femtomole Very sensitive and very low flow rates; applicable to LC/MS; but low flow rates require specialized systems; has reasonable salt tolerance (low millimolar); multiple charging useful but significant suppression can occur with mixtures; reasonable tolerance of mixtures; soft ionization (little fragmentation observed). APCI 1,200 none thermal degradation Comments somewhat amenable excellent Excellent LC/MS tool; low salt tolerance (low millimolar); useful for hydrophobic materials. high femtomole APPI 1,200 none photo dissociation amenable excellent high femtomole Comments Excellent LC/MS tool; low salt tolerance (low millimolar); useful for hydrophobic materials. MALDI 300,000 yes photo degradation and matrix reactions Comments good for complex mixtures possible low to high femtomole Somewhat tolerant of salts; excellent sensitivity; matrix background can be a problem for low mass ions; soft ionization (little fragmentation observed); photo degradation possible; suitable for complex mixtures. Limited multiple charging occurs so MS/MS data is not extensive.

44 Espectrometria de Masa Fuente de Ionización Ionization Source Typical Mass Range (Da) Matrix Interference Degradation DIOS 3,000 none photo degradation Comments Complex Mixtures good for complex mixtures LC/MS Amenable possible Sensitivity low femtomole to high yoctomole Somewhat tolerant of salts; excellent sensitivity; soft ionization (little fragmentation observed); photo degradation possible; suitable for complex mixtures and small molecules. FAB 7,000 yes matrix reactions and some thermal degradation Comments Electron Ionization (EI) Comments Chemical Ionization (CI) Comments somewhat amenable very limited nanomole Relatively insensitive; little fragmentation; soft ionization; high salt tolerance to 0.01M solubility with matrix required. 500 none thermal degradation limited unless used with GC/MS very limited picomole Good sensitivity; unique fragmentation data generated; National Institute of Science and Technology (NIST) database (>100,000 compounds) available to compare fragmentation data; thermal decomposition a major problem for biomolecules; limited mass range due to thermal desorption requirement. 500 none thermal degradation limited unless used with GC/MS very limited picomole Offers a softer ionization approach over EI yet still requires thermal desorption; negative CI particularly sensitive for perflourinated derivatives; a limited but powerful approach for certain derivatized molecules such as steroids.

45 Espectrometria de Masa - Muestra

46 Espectrometria de Masa Analizador de masa SAMPLE ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS Analizador de Masa, función principal es SEPARAR o RESOLVER los iones formados en la fuente de ionización de acuerdo a su relación m/z. Quadrupole Quadrupole ion trap Time-of-Flight (TOF) Sector field mass analyzers (magnetic o electric) Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) Orbitrap

47 Espectrometria de Masa Analizador de masa Características del analizador de masa, para muestras biológicas rango de masa que resuelve eficiencia de transmisión (que influye en la sensibilidad) compatibilidad con la fuente de ionización, equipos de introducción de muestra resolución Figure 2.1. The effect of resolution upon mass accuracy. The overlaid spectra were calculated for the same molecular formula (C101H145N34O44) at resolutions of 200, 2500, and infinity ( ).

48 Espectrometria de Masa Analizador de masa Sector field mass analyzers (magnetic o electric) Usa un campo electrico/magnético para afectar el paso y/o la velocidad de las partículas cargadas. Altera la dirección de los iones que están volando a través del analizador de masa, dependiendo de su relación m/z Quadrupole (QMS) Usa campos electricos oscilantes que selectivamente estabilizan o desestabillizan iones a través de un campo cuadrupolar de un campo de radio frecuencias (RF). Actúa como filtro selectivo de masa. Relacionado con Quadrupole ion trap. Quadrupole ion trap El mismo principio físico que QMS, pero los iones son atrapados y luego eyectados secuencialmente. Time-of-Flight (TOF) Utiliza un campo magnético para acelerar los iones a través del mismo potencial, mide el tiempo en que llegan al detector. Partículas con la misma carga, energías cinéticas idéticas, velocidades dependeran de la masa. iones más livianos llegarán al detector primero Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) Orbitrap

49 Espectrometria de Masa Analizador de masa Espectrómetros de masa de Simple - y Doble-enfocado Sector field mass analyzers (magnetic o electric)

50 Espectrometria de Masa Analizador de masa Espectrómetro de masas por Quadrupole (QMS) Figure 2.3. Schematic diagram showing arrangement of quadrupole rods and electrical connection to RF generator; a DC potential (not shown) is also superimposed on the rods. A cross-section of a quadrupole mass analyzer taken as it analyzes for m/z 100, 10, and 1000, respectively. It is important to note that both the DC and RF fields are the same in all three cases and only ions with m/z = 100 (top example) traverse the total length of the quadrupole and reach the detector; the other ions are filtered out.

51 Espectrometria de Masa Analizador de masa Espectrómetro de masas por Quadrupole (QMS) A potential of ~ V is applied alternately to the opposing pairs of rods at a frequency of a few MHz. At a specific combination of DC & RF, an m/z has a stable trajectory through the rods, and all other m/z are lost. The mass range is scanned as the voltages are swept from min to max, but at constant DC/RF ratio. Faster Scanning than sector instruments (but not as fast as ion traps or TOF). Mass Range generally m/z or Facile MS/MS using Triple Quadrupole (Q-q-Q) analyzer. Exquisitely sensitive in selected ion monitoring (both analyzers parked at one m/z). Largely replaced by the ion trap and hybrid Q-q-TOF for biopolymer analysis.

52 Espectrometria de Masa Analizador de masa Espectrómetro de masas por Quadrupole (QMS) MS/MS in a Triple Quadrupole (Q-q-Q) Mass Spectrometer A triple quadrupole ESI mass spectrometer possesses ion selection and fragmentation capabilities allowing for tandem mass spectra.

53 Espectrometria de Masa Analizador de masa Ion cyclotron resonance mass spectrometry (ICR-MS)

54 Espectrometria de Masa Analizador de masa Time of Flight mass spectrometry (TOF-MS) Constant Kinetic Energy zev = ½ mv 2 v = (2zeV/m)½ Linear TOF Reflectron TOF

55 Espectrometria de Masa Analizador de masa Time of Flight mass spectrometry (TOF-MS) Figure 2.8. Time-of-flight and time-of-flight reflectron mass analyzers. The TOF analyzer has virtually unlimited mass range, while the TOF reflectron has mass range up to m/z ~10,000. It should be noted that most detectors have a limited mass range. v = t = ( 2z V acc ) m ( m ) 2z V acc 1/2 1/2 L v: velocidad de ion de masa m y carga z t: tiempo L: longitud de trayectoria Iones acelerados por campo eléctrico de fuerza conocida. Iones con la misma carga tendrá la misma E cinética. La velocidad adquirida dependerá de la relación m/z Se determina el tiempo en que la partícula alcance al detector, colocado a distancia conocida El tiempo dependerá de la relación m/z. Partículas más pesadas necesitan más tiempo (más lentas) A partir de las determinaciones de tiempo se calcula la relación m/z

56 Espectrometria de Masa Analizador de masa Time of Flight mass spectrometry (TOF-MS) Utilizado junto con técnicas de ionización pulsadas ( 252 Cf fission, pulso de laser), el pulso de laser genera la señal para adquisición de datos. Ventajas: ilimitado rango de masa alta velocidad (escala de microseg) Mayor desventaja: bajo poder de resolución, m/z es proporcional a t 2 R = m/dm = ½ (t / Dt) Instrumentos de TOF lineal standard R aprox TOF-MS, othogonal TOF-MS, utilizando reflectómetro (espejo electrostático) R aprox. 6000

57 Espectrometria de Masa Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) MALDI-TOF MS

58 Espectrometria de Masa Detección & Análisis de datos SAMPLE ION SOURCE MASS ANALYZER DETECTOR DATA ANALYSIS Detector: registra carga inducida o corriente porducida, cuando iones pasan o golpean contra una superficie. Sistema informático: control del espectrómetro de masa adquisición y procesamiento de datos (detección al espectro de masa) interpretación de datos (busquedas en bibliotecas de datos) 1- detección secuencial de iones que llegan a un punto dado del detector (a cada m/z) (point ion collectors). 2- detección simultanea de iones masas diferentes (m/z) (array collectors), ej, placas fotográficas, detectores de imagen de corriente o arreglos de detectores. Placas fotográficas, Copa de Faraday, Multiplicadores de electrones (EM), Detectores de iones electro-ópticos

59 Espectrometria de Masa Sistema de detección Fourier transform mass spectrometry (FT-MS) Sistema de detección, medidas de la coriente electrica generada cuando los iones impactan la superficie de un electromultiplicador (método destructivo) Ampliamente usado, muy sensible, pero es destructivo FT-MS: iones atrapados en un campo magnético fuerte dentro de la celda de análisis, señal electrica producida por movimiento ciclotrón, detectada por electrodos conectados a amplificador de alta impedancia. detección del número de iones sin expulsarlos del analizador y sin destruirlos (método no destructivo) la señal de un mismo ion puede medirse repetidas veces (similar en RMN) Exactitud de la determinación de masa 1parte en 10 9 Resolución depende de la masa (FTICR-MS), a menor masa mayor resolución la sensibilidad de FTICR permite analizar macroiones con multiples cargas

60 Espectrometria de Masa

61 LC-QTOF HPLC Agilent 1200 Bomba binaria detector UV Espectrometro de Masas microtof-q II Fuentes de ionizacion ESI y APCI

62 Espectrometria de Masa en Tandem - Tandem MS Tandem MS (MS-MS) Información estructural Fragmentación de la muestra e identificación de los iones resultantes. Datos obtenidos se compilan para generar información estructural sobre la molécula intacta permite detectar compuestos específicos en una muestra compleja, a partir de sus patrones de fragmentación característico Multiples pasos de seleción o análisis de masas, separadas por alguna forma de fragmentación Espectrómetro para tandem MS múltiples rondas de MS con más de un analizador, usualmente 2 analizadores separados por una celda de colisión especial. Métodos de ionización suaves (FAB, MALDI, ESI) generan único ion molecular con insuficiente energía para fragmentar. Uso de celda de colisión especial, que permite fragmentación por conversión de E cinética en vibracional.

63 Espectrometria de Masa en Tandem - Tandem MS Tandem MS (MS-MS) Mass Spectrometer Tandem MS permits selection and isolation of specific ions for subsequent analysis. Tandem Mass Spectrometer Tandem instruments have multiple mass analyzers.

64 Espectrometria de Masa en Tandem - Tandem MS Tandem MS (MS-MS) Tipos de instrumentos para MS-MS: (1)- Dos espectrómetros de masa dispuestos en Tandem (2)- Analizadores capaces de almacenar iones, ICR y QIT, selección del ion de interés por eyección del analizador de los demás iones. Ion seleccionado, sometido a fragmentación. Proceso que puede repetirse Combinaciones (1) quadrupole - quadrupole magnetic sector - quadrupole magnetic sector - magnetic sector quadrupole - time-of-flight.

65 Espectrometria de Masa en Tandem - Tandem MS Product Ion Scan 1. Parent Ions are selected and isolated 2. Collision-Induced-Dissociation Results in fragmentation 3. Daughter Ions are characterized with the second mass analyzer

66 Espectrometria de Masa Estudios estructura-función Análisis de proteínas por MS Técnicas de ionización utilizadas: ESI y MALDI Información obtenida: Masa molecular Plegamiento de proteínas Caracterización de complejos proteicos no covalentes Determinación de mapa de función proteica

67 Determinación de Masa Molecular

68 Complejos No Covalentes

69 Plegamiento de Proteínas y dinámica Estados plegados y desplegados

70 Plegamiento de Proteínas y dinámica Intermediarios de plegamiento proteico

71 Resolución de secuencias de Proteínas Resolución de secuencia de péptidos por MS-MS MS-MS: apropiado para resolver secuencias proteicas permite identificar los aminoácidos sin modificar y modificados por su masa técnica muy sensible, permite resolver mezclas de péptidos directamente Estrategias para secuencias proteínas y péptidos largos 1- MS-MS combinado con degradación enzimática o química para formar oligopéptidos (< 3 kda) y luego MS de los productos obtenidos 2- ESI-FTMS como primer paso de degradación 3- combinar degradación de Edman con MS-MS

72 Resolución de secuencias de Proteínas Resolución de secuencia de péptidos por MS-MS Peptide sequencing: H2N-CH(R')-CO-NH-CH(R")-CO2H 3 tipos de enlaces diferentes puenden ser fragmentados en la cadena aminoacídica NH-CH, CH-CO, y CO-NH cada ruptura genera 2 especies, una neutra y la otra cargada, SOLO la cargada será monitoreada por MS 6 posibles fragmentos para cada residuo de aminoácido (iones a,b,c si la carga es retenida en el N-terminal; x,y y z si la carga es retenida en el fragmento C-terminal)

73 Identificación de Proteínas a partir de electroforesis 2D

74 Aplicaciones a estudios de Proteomica

75 Espectrometria de Masa Determinaciones precisas de la masa molecular, confirmación de muestra, determinación de pureza, verificación de sustitución de aminoácidos, de modificaciones post-traduccionales (proteínas), calculo de puentes disulfuro. Monitoreo de reacciones, seguimiento de reacciones enzimáticas, de modificaciones químicas Resolución de secuencias de aminoácidos, confrimación de secuencia, caracterización de peptidos, identificación de proteínas por busqueda en bases de datos a partir de fragmentos proteolíticos Resolución de secuencias de oligonucleótidos Estructura de proteínas, monitoreo de plegamiento de proteínas siguiendo el intercambio H/D, formación de complejos proteína-ligando en condiciones fisiológicas, determinación de estructura molecular Estudios de proteomica

76 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Espectrometría MS/MS: Resolver secuencias de péptidos y proteínas Determinar Modificaciones post traduccionales (PTMs) Identificación de proteínas en muestras complejas. Identificar DIFERENCIAS CUANTITATIVAS en proteomas de muestras biológicas complejas Fluctuación del proteoma de una célula u organismos - cuantitativamente, síntesis y degradación de prots. y cualitativamente, PMTs- respuesta adaptativa o a estímulo.

77 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Determinaciones cuantitativas de proteomas MS - método seriado (tiempo de instrumento por muestra) - Para medidas robustas de muestras complejas de miles de proteínas: Analizar varios péptidos por proteínas Analizar varios iones moleculares por péptido. Medidas de RNA tienen una baja correlación con los niveles de proteínas (cuantitativo) ni (cualitativo, PTMs)

78 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Determinaciones proteómicas cuantitativas: Péptidos estandard marcados con isótopos estables (no radioactivos), 13 C y 15 N Relación entre Intensidades relativas de los péptidos endógenos respecto pétidos estandard marcados (cuantificación). Detección y cuantificación: Targeted (blancos conocidos o identificados) Non-targeted (monitoreo global de miles de proteínas diferentes en el proteoma de un organismo)

79 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Targeted MS Triple cuadrupolo (QqQ MS)+ SRM (Selective Reaction Monitoring) (QqQ MS)

80 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Targeted MS Triple cuadrupolo (QqQ MS)+ SRM (Selective Reaction Monitoring)

81 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Nontargeted MS Cuándo no tenemos identificadas las proteínas de interés? Cuándo se quiere analizar las fluctuaciones globales de un proteoma? Shotgun MS

82 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Nontargeted MS Incorporación de isótopos estables para medidas cuantitativas Técnicas de derivatización in vitro: 1. Digestión de péptidos con tripsina en presencia de H 2 O marcada con 18 O. Intercambio de 18 O en el hidroxilo C-terminal, corrimiento de masa de 2Da (y en el carbonilo, hasta 4Da). Menos usado. 2. ICAT (isotope-coded affinity tag method) 3. itraq (isobaric tags for relative and absolute quantification method)

83 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Nontargeted MS Incorporación de isótopos estables para medidas cuantitativas

84 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Nontargeted MS Incorporación de isótopos estables para medidas cuantitativas Marcación in vivo o metabolic labeling: Incorporación de isótopos estables en proteínas de un organismo mediante crecimiento en un medio marcado o alimentado con nutrientes marcados 1. SILAC (stable isotope labeling by aminoacid in cell culture) una población se crece en medio liviano (sin marcar) otra en medio pesado (marcado) enriquecido con aminácidos marcaos con isótopos pesados ( 13 C o 15 N), Arg o Leu. 2. Full metabolic labeling, para organismos que que pueden ser alimentados o crecidos en medios que sólo contienen nutrientes marcados con isótopos pesados estables.

85 Protein Quantitation Using Isotope-Assisted Mass Spectrometry Nontargeted MS Incorporación de isótopos estables para medidas cuantitativas

86 FIN