Introducción n a la. Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina

Transcripción

1 Introducción n a la Espectrometría a de Masa Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina

2 Espectrometría de Masa La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia

3 Bioespectrometría Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones. Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.

4 Espectrometría a de masa y Biología Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas Ionización por Electrospray (ESI) para muestras líquidas

5 Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI-TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

6 ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF plate Extraction grids Laser Timed ion selector Reflector detector Reflector Linear detector Pumping Camera Beam guide Pumping

7 4000 Series MALDI TOF/TOF Analyzer Training Analizador de masa TOF Aceleración post-irradiación láser Región de deriva (Tubo de vuelo) Detector +20 kv 7 Iones de masas diferentes L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del tiempo de vuelo (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa Applera Corporation and MDS Inc.

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9 Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina in gel de una proteína de membrana de 91 kda. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

10 Elemento Masa % 1 H H C C N N O O O P S S S S Br Br

11 Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = , 3222] % Intensity Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Mass (m/z) Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = , 16255] E+4 % Intensity Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Mass (m/z)

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14 Voyager Spec #1=>MC[BP = , 12005] C 13 2xC % Intensity C Mass (m/z) 0 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox pmoles, 0.8 ng, en 1 µl de muestra; matriz: CHCA; R= FWHM)

15 Algunas aplicaciones...

16 CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

17 Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = , 60367] E % Intensity Mass (m/z)

18 Mapeo peptídico por EM (Peptide Mass Fingerprinting/MS) proteína intacta enzima proteolítica péptidos MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT

19 B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido α-ciano hidroxicinámico Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = , 19883] E % Intensity Mass (m/z) Masa Teorica Masa Medida Error (Da) Residuos Secuencia (Da) (Da) TGPNLHGLFGR TGPNLHGLFGRK TEREDLIAYLK HKTGPMLHGGLFGR TGQAPGFTYTDANK TEREDLIAYLKK KTEREDLIAYLK IFVQKCAQCHTVEK

20 RESUMEN: Niveles de información en la caracterización de proteínas por MS. medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales mejora en cantidad y calidad de la información

21 El Proteoma es dinámico Estado metabólico Drogas Condiciones ambientales Estadío de Desarrollo Proteoma Interacciones Proteína-Proteína Estrés Control traduccional y post-traduccional ADN Genoma marn Control transcripcional

22 Análisis por electroforesis 2D

23 Identificación de proteínas Separación en gel 2D m/z Mass (m/z) Extracción de péptidos y análisis de masas Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Búsqueda en banco de datos

24 Protein Prospector Homepage MS-Fit Search

25 ProFound Search for Protein Identification Set Kingdom Enzyme used for digestion Cys Modificatition (reduced, alkylated) Set Charge state

26 Search Result after Peptide Mass Fingerprinting The result showed that in fact the spot contained 2 proteins. Both were identified, Vimentin and Tubulin. Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified. Note that the genome of CHO-cells (hamster) is not sequenced. Therefore the most homologues proteins of related species are scored.

27 Detailed Search Results View

28 Identificación n de una proteína regulada por hierro en membrana externa de Sinorhizobium meliloti Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

29 FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µm FeCl 3 (lanes 1 and 2), 500 µm EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µm EDDHA and 4 µm hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µm EDDHA and 16 µm hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

30 FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

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32 Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):

33 Identificación de proteínas por MALDI-TOF Proteína aislada Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: Enzimático o químico Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos La identificación es probabilística: según criterios estadísticos

34 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

35 Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF A 20 B 14 B A

36 Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Da muestra A A B Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D). Electroforesis 2D de la materia prima

37 Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Digestión tríptica: muestra A Voyager Spec #1=>BC[BP = , 20135] % Intensity Mass (m/z) 2.0E+4 MOW SE Score e e e +06 #/13( %) Mass es Matc hed 13 (100) 13 (100) 13 (100) % Co v % TIC Mea n Err Da Data Tol Da MS- Digest Index # Protein MW (Da)/pI Accessi on # Species Protein Name / UNREADABL gi pdb 1BTL Beta-Lactamase Tem1 M E (E.C ) / gi pdb 1CK3 A Chain A, N276d UNREADABL Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta- 6 E Lactamase / EXPRESSION VECTOR beta-lactamase 9 M PPK113 Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN

38 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

39 Identificación de Modificaciones Postraduccionales Fosforilación? NO 2?

40 Common Protein Post-Translational Modifications (monoisotopic) modification -17 pyrrolidone carboxylic acid -2 disulfide formation (thiol oxidation) amidation 0.98 deamidation 2 disulfide reduction (thiol formation) 14 methylation 16 oxidation (e.g. sulfoxide formation) 28 formylation 42 acetylation 43 carbamylation 44 γ-carboxyglutamic acid 71 Cys-propionamide sulfation phosphorylation Some modifications are natural. Many are the result of handling. disulfide vs. two thiols phosphate group vs. sulfate group good mass spectrometer needed especially with large molecules M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: (1999). Delta Mass at

41 Identificación n de sitios de fosforilación PknB de Mycobaterium tuberculosis 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

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43 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

44 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

45 2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES A) ph 3 10 B) ph 3 10 Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente

46 ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Proteína Enzima Mezcla de péptidos Espectrómetro de masa Masa de los péptidos Alternativamente, secuenciación de cada péptido Búsqueda en bancos de datos; Identificación de la proteína Verificación de secuencia y detección de modificaciones postraduccionales. MS/MS

47 MS/MS Mezcla de péptidos 1 péptido seleccionado para MS/MS MS/MS Espectro MS Espectro MS/MS: masa de los fragmentos

48 b ions y ions

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50 Del Genoma al Proteoma Secuencia ADN marn Proteínas Proteínas Funcionales Control Transcripcional Control Traduccional Control post-traduccional Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN

51 Proyectos de Proteoma Humano ~40,000 Proteinas ~>1,000,000 Proteinas Variantes ~>5,000,000 Complejos?

52 APLICACIONES DE LA PROTEOMICA Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula Investigaciones en Fisiopatologia Descubrimiento de nuevas actividades Biologicas y drogas Predecir respuestas individuales a drogas Marcadores para diagnostico de enfermedades Estudio de modo de accion de drogas y toxicidad Descubrimiento de nuevas moleculas blanco de drogas

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58 4800 MALDI TOF/TOF Analyzer Schematic Mirror Deflectors Collision Cell CID Lens (Lens 2) Lens 3 Linear Detector 2-Stage Mirror Metastable Suppressor Source 2 Decel Stack TIS Decel Deflectors Lens 1 Laser Lamp Camera X 2,Y 2 Deflectors Reflector Detector X 1,Y 1 Deflectors Sample Loading Chamber Source 1 Lens Attenuator Mirrors Source 1 Sample Plate and Stage

59 4-25 kv Tubo de vuelo Detector Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del tiempo de vuelo (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

60 Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

61 Time-of-Flight Mass Analyzer Source Acceleration Drift Region (Flight Tube) Detector +20 kv Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions. The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.

62 Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). Datos técnicos: - Laser de nitrógeno (λ 337 nm) - Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kv - Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr) - Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kda - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm) - Sensibilidad (péptidos): subpicomolar Posibilidades de operación: - Modo lineal - Modo reflector - "Delay extraction" (DE) - "Post Source Decay (PSD) - "Collision-Induced Dissociation (CID)