ELECTROFORESIS. Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas (PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).

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1 ELECTROFORESIS. V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en un campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carga neta de la proteína. f = 6πηr es el coeficiente friccional. η es la viscosidad del medio. Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas (PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE). Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pi). Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE): IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda. 1

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3 3

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6 DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS. Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000) Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kda). A) Proteína nativa: 1) Ultracentrifugación. 2) Filtración por gel. 3) Espectrometría de masa. B) Subunidad: 1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). 6

7 ULTRACENTRIFUGACION. Fc = m ω 2 r = m(1 vρ) ω 2 r Fc= fuerza centrífuga. r = radio del rotor. ω = velocidad angular. ω 2 r = campo centrífugo. v = volumen específico parcial (inversa de la densidad de la proteína). m es menor que m porque el flúido desplazado ejerce una fuerza opuesta (1 vρ). f= coeficiente friccional de la partícula = 6πηr, donde η es la viscosidad del medio y r el radio de la partícula. v = Fc / f = m(1 vρ) ω 2 r / f s = coeficiente de sedimentación (unidades seg = 1 Svedberg). s = v / ω 2 r = m (1 vρ) / f Μr = RTS / D (1 vρ) D = coeficiente de difusión Ultracentrifugación analítica: Rotor especial, sedimentación durante la corrida. que permite seguir la Ultracentrifugación zonal (en gradiente): La solución de proteína se corre en un gradiente de densidad (por ejemplo, sacarosa), con proteínas de s conocido como marcadoras. 7

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13 Peso molecular de subunidad: Determinacion por SDS-PAGE 13

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15 COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA 15

16 COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA 16

17 COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA EFECTO DE LA PRESENCIA DE PUENTES DISULFURO. 17

18 SECUENCIACION DE PEPTIDOS Y PROTEINAS 18

19 SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS. Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína purificada. La purificación puede consistir en obtener la proteína pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como una banda discreta en un gel de SDS-PAGE. Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar para obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por distintos procedimientos. Esta fragmentación se hace enzimáticamente (proteasas) o químicamente (p.ej.: BrCN). 19

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24 SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS. 1) Método de Edman: Previa separación de los péptidos por HPLC en fase reversa, secuenciarlos químicamente por reacción con el reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, en un secuenciador automático. 2) Espectrometría de masa (MS): 2a) Sin separar los péptidos, determinar las masas de un cierto número de los mismos por MS e identificar a la proteína en los bancos de datos por comparación con las masas de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Optimo cuando el genoma del organismo del cual proviene la proteína está completamente secuenciado. 2b) Seleccionar un péptido determinado por MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las masas de los fragmentos resultantes (MS/MS, espectrometría de masa en tandem con cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente, Post Source Decay). 24

25 LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MDH-1 MDH-2 25

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28 1er.Ciclo 1er. Ciclo 2 2o. Ciclo 3er. 3er. Ciclo DEGRADACI ON DE EDMAN Secuenciación automática por REACCION DEL RESIDUO N- TERMINAL CON el Método de ISOTIOCIANATO Edman DE FENILO (N-terminal de la cruzipaína) 28

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30 ESPECTROMETRIA DE MASA: SUS APLICACIONES EN DETERMINACION DE PESOS MOLECULARES DE PROTEINAS Y EN SECUENCIACION DE PEPTIDOS. 30

31 Espectrometría de Masa La Espectrometría de Masa es una tecnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). 31

32 Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos: 1) Fuente de iones. 2) Analizador de masas. 3) Sistema de detección y adquisición de datos. Técnicas actuales para trabajo biológico: 1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo) 2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de masas por cuadrupolo) 32

33 Soft ionization methods: Electrospray ionization (ESI) (Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.; Whitehouse, C. M. (1989). "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules". Science 246: 64 71). Matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. (1988). "Protein and Polymer Analyses up to m/z by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry". Rapid Commun Mass Spectrom 2 (20): Nobel Award in Chemistry shared in 2002 Both methods produce pseudomolecular ions (M+nH) n+ or (M-nH) n- 33

34 ES/MS IONIZACION GENERACION POR DE IONES ELECTROSPRAY MOLECULARES (ESI MS) La solución a analizar se pasa a través de una aguja hipodérmica mantenida a un alto potencial. Se forma un cono de gotitas muy finas, altamente cargadas, que irradian de la punta de la aguja. Se evaporan rápidamente, pasando las moléculas a analizar a la fase gaseosa. Si son moléculas grandes se producen iones con cargas múltiples. 34

35 Aqueous solution 1914, John Zeleny dripping, burst, pulsating, cone-jet Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A 280 (1382): 383. This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS The effect of vacuum, temperature and curtain gas causes the formation of increasingly smaller drops until the molecule is fully desolvated in vacuum. 35

36 What is the ionization mechanism in ESI? Lord Rayleigh, 1882 No tolerant to the presence of salts, surfactants, inorganic acids, TFA no so good for sensitivity, (regularly desalting steps are required, acetic and formic acids are used in the mobile phase). 36

37 ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES. MOLECULARES Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras metálicas paralelas que generan un campo eléctrico oscilatorio. Los iones se separan en este campo: sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a una determinada amplitud y frecuencia de oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a las barras, y llegan al detector. 37

38 Quadrupole Mass Analyzer radiofrequency DC: Direct current RF: Radio frequency Limited mass range (4 000 Da). From: Ion transmitted along the quadrupole in an stable trajectory Ions do not have an stable trajectory and is ejected from the quadrupole Were the first mass analyzer to be coupled to ESI. Excellent mass filters. Acquisition every Da. 38

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40 MALDI-ToF MS GENERACION DE IONES MOLECULARES Pseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5- dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa. ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES. Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico. Teniendo energía cinetica idéntica, los iones chicos se mueven más rápido que los grandes y llegan antes al detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo, comparando con standards. 40

41 ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA MALDI-TOF Sample plate Extraction grids Laser Timed ion selector Reflector detector Reflector Linear detector Beam guide Pumping Camera Pumping 41

42 Espectrometro de masa, MALDI-ToF 42

43 Sample mixed with a strong UV absorbing matrix. The matrix absorbs energy from the laser causing the sample and matrix to be volatilized. Ionized matrix molecules transfer a proton to the sample. Sample ions are then accelerated down the flight tube for mass analysis (TOF MS). MALDI is a pulsed ionization source 43

44 MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization. Excess of Matrix Matrix : Analyte 1000: :1 Ionization by laser (pulses 1-5nsec but.high potency: kw MW). Nd:YAG (355nm) N 2 laser (337 nm) Easy Sample prep: Dried droplet Layered method Compatible with TOF analyzers Highly efficient ionization method 44

45 Matrices absorb strongly λ of the laser irradiation cold matrix hot matrix 45

46 MALDI-MS 1. MALDI-MS spectra are very simple, only singly-charged ions are observed: (M+H) + or (M-H) Very efficient ionization method. High sensitivity in the analysis of biomolecules and biopolimers. 3. Ideal for the analysis of mixture of tryptic peptides (ID of proteins by PMF, peptide mass fingerprinting). 4. High throughput analysis. 5. Compatible with Time of Flight mass analyzer. 6. Laser intensity may help to induce fragmentations and obtain structural information. 46

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48 Mass spectrometry of recombinant cruzipain a.i Cr kda C-T Cat-D 13.6 kda 25.5 kda Cr kDa ProCr kda ProCr kda m /z /D = /U lf/jjc _C z_s A /1S Lin/pdata/1 A dm inistrator Tue M ar 5 12:12:

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50 Identification of proteins by PEPTIDE MASS FINGERPRINTING (PMF) The reduced and alkylated sample (in a gel-piece or spot) is digested with a protease (=trypsin?). Resulting peptide mixture is analyzed by MALDI-ToF-MS. List of peptide masses is used to scan an in-silica digest of a sequence database over the Internet. Search result is presented as probability scores and other measures of confidence. Homogeneity of sample and accuracy of measurement are important factors for safe interpretation! 50

51 x PMF of band # m/z Intens. [a.u.]

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56 LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MDH-1 MDH-2 56

57 MDH-1 MDH-2 57

58 EDMAN 58

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60 Objectives and strategy of a typical sequencing experiment: To confirm a suspect protein PMF match To identify a target protein via aa sequencing and BLAST search To generate an amino acid sequence from an unknown protein To identify a PTM... Cont. 60

61 SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA Collision-induced dissociation (CID): Es una técnica de fragmentación usada para obtener información estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener la fragmentación de un ión seleccionado por su masa. Post-source decay (PSD): Es una técnica de fragmentación usada con MALDI- ToF MS para obtener información estructural, típicamente a partir de péptidos menores que 2 kda. El decaimiento de un ion precursor seleccionado por su masa tiene lugar después que el ión deja la fuente de iones, en el tubo de vuelo, y los fragmentos iónicos son separados por el reflectrón. La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un espejo iónico o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa. 61

62 Reflectron (ion mirror): compensates for the kinetic energy spread of ions from the source (100 ev to 1 kev) by reflecting the ions back along the same flight path prior to detection. Detector Ions of equal m/z with different velocities Detector 62

63 La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos, utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones hijos que se separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia. 63

64 FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS Un péptido cargado puede ser fragmentado en dos trozos de tres maneras, que pueden producir un par de iones a y x, un par de iones b e y, o un par de iones c y z. Teóricamente una fragmentación puede tener lugar en cualquier lugar de un péptido, y se espera un espectro que contenga todos los posibles picos de iones. En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras en las diferentes posiciones, los diferentes iones aparecen con distintas frecuencias. Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo forman la serie completa en un espectro. Los siguientes en frecuencia son los iones a y b, de los cuales muchos no se observan. Los iones c, x y z se presentan mucho menos frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar nuevos iones por pérdida de agua o de amonio. La introducción de un grupo sulfónico en el N-terminal de un péptido tríptico favorece la fragmentación que da lugar a los iones y, y suprime a los de la serie b, dando un espectro simplificado, que facilita la determinación de la secuencia. 64

65 The backbone fragmentation are the most intense signals in the ESI-MSMS spectra of peptides fragmented by CID. x n y n z n C-terminal ions O H N C NH 2 C N COOH N C N-terminal ions a n b n c n Roepstorff, P., and Fohlmann J. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984) Jhonson R. S., Martin S. A., Biemann K., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 86, 137 (1988). 65

66 AA sequencing using Post Source Decay MALDI has in principle been possible for many years, but has not been much used due to difficult interpretation. 66

67 Peptide fragmentation (2) 67

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69 A dramatic improvement was the development of derivatizations of the peptide prior to PSD: Acidification by sulfonation directs fragmentation to the b-y bond and as the b-fragments become neutral, a unique series of y-ion results. Two common reagents are CAF or SPITC the former shown below: O O N O O O S O OH + H 2 N H R 2 NHS-ester of 3-Sulfopropionic acid anhydride Pep RT, ph>9 O HO S O O H NH Mass addition, +136 Da R 2 Pep 69

70 A tryptic digest (probably from an SDS-PAGE- or a 2-D-gel) is analyzed by PMF. The Lys blocking and the sulfonation reactions are performed. (One can ignore the Lys blocking and only look for Arg-peptides). The modified peptide mixture is analyzed again by MALDI. Look for masses representing Arg or Lys peptides. (I. e. those that increased by 136 or 204 Da) Switch the MALDI to PSD and select THAT peptide mass. Perform the PSD analysis - this takes approximately 2 in a TOF/TOF MALDI 70

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73 GE Healthcare discontinued the CAF reagent in A variant N-terminal sulfonation reagent, 4-sulfophenyl isothiocyanate (SPITC), is dramatically cheaper and with similar properties. Adds 215 Da at the N-terminal AND free Lys side chain Wang, Kalb and Cotter, RCM 18, (2004) 73

74 How can sulfonation at the N-terminus of tryptic peptides improve PSD performance? 1. It favours bond breakage at the b/y position (the peptide bond) 2. It neutralizes the b-fragments (negatively charged sulfogroup + proton); therefore the b-fragments never leave the target. 3. The resulting series of y-ions is easily interpreted the distance betwen adjancent peaks represents one amino acid. The sulfonation reaction derivatizes the N-termini of the tryptic peptides (and the side chain of Lys in approximately half of the peptides) To avoid the Lys sulfonation, Lys is first blocked by an imidazole reaction, adding 68 Da/Lys. This is specific for the Lys side arm and does not affect the N-terminus. 74

75 Peptide mass fingerprinting of T c aconitase (- / + sulfonation) 75

76 Post Source Decay (PSD) sequencing of aconitase tryptic peptides 76

77 ISOFORMAS DE CRUZIPAINA EN 2D-PAGE 77

78 CRUZIPAINA - - WTTQWGEDGYIR 78

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81 Phylogenetic relationship of TcMCPs with other members of the M32 family Pyrococcus horikoshii Pyrococcus furiosus Sulfolobus solfataricus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacilus subtilis Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Halobacterium sp. Thermus aquaticus Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Yersinia pestis Rhizobium loti Rickettsia rickettsii Leishmania major Trypanosoma cruzi-2 Trypanosoma cruzi-1 Trypanosoma brucei 81

82 SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas, p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos específicos. La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155 residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los sitios en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos para continuar la etapa siguiente. Se efectúa con el residuo C-terminal ligado a una resina, lo que permite eliminar facilmente subproductos. 82

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85 INTRODUCCION A LA PROTEOMICA JUAN JOSE CAZZULO IIB-INTECH, UNSAM-CONICET San Martin, Buenos Aires, Argentina 85

86 GENOMA Y PROTEOMA GENOME: GENes and ChromosOMEs (Winkler, 1920): Conjunto completo de los cromosomas y sus genes. PROTEOME: Conjunto completo de las proteínas de un organismo (el conjunto de proteínas codificadas por un genoma, Wilkins y Williams, 1994; Wasinger et al., 1995). DETERMINACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES Determinación de las características químicas, bioquímicas y biológicas de las proteínas. 1) Estructura molecular. 2) Modificaciones post-traduccionales. 3) Capacidad de unir ligandos. 4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion intracelular. 5) Especificidad de tejido, célula y organela. 6) Especificidad de sexo. 7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post natal y de envejecimiento. 86

87 Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás. 87

88 HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES? NO. Hay frecuentemente mas de una proteína proveniente de un único gen. Causas principales: 1) Splicing alternativo: A nivel de la maduración del mrna. Diferentes proteínas armadas usando diferentes combinaciones de exones. 2) Modificación post-traduccional: La proteína es modificada después de la traducción, ya sea procesándola proteolíticamente, o modificando quimicamente residuos de aminoácidos, o de ambas maneras. 88

89 MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. Muchas proteínas no están terminadas cuando se completa la traducción, y requieren madurar, a través de modificaciones posttraduccionales. Estas modificaciones pueden consistir en: Modificación covalente de residuos de aminoácidos: Se estima que hay más de 200 modificaciones posibles en las proteínas, y que hay complejos sistemas regulatorios que controlan esas modificaciones. Se piensa que entre el 5 y el 10 % de los genes de un mamífero codifican proteínas que modifican otras proteínas. Proteólisis parcial. Las modificaciones pueden ser: Reversibles o irreversibles. Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas. Enzimáticas o no enzimáticas. Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales tardías. 89

90 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MAS COMUNES EN LAS PROTEINAS. - Formación de puentes disulfuro. - N- y O- glicosilación (Asn, Ser/Thr). - Fosforilación (Ser/Thr; Tyr; His; Arg; Lys; Asp o Glu) - Acetilación (N-terminal) - Amidación (C-terminal) - Remoción reversible del C-terminal en tubulinas. - Metilación (Leu, Isoprenil-Cys, Lys, Arg, His) - Hidroxilación (Pro, Lys) - Sulfatación (Tyr) - ADP-ribosilación - Modificaciones para inserción en membranas: - Palmitoilación y miristoilación. - Prenilación (farnesilación, geranilgeranilación). - Unión de ancla de glicosil fosfatidil inositol. - Procesado proteolítico: - Remoción del péptido señal. - Remoción de dominios pro- - Procesamiento de precursores hormonales, poliproteínas virales. - Splicing de proteínas. 90

91 ALGUNAS SECUENCIAS CONSENSO PARA MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. 1) N-Glicosilación: N*XT/S (X no puede ser Pro). 2) O-glicosilación: PXS*/T*XXP 3) Fosforilación: Ser/Thr: RRXS* ; KRXXS* ; K/RK/RXS*/T* ; K/RS*/T*XK/R; K/RS*/T*P Tyr: K/RXXXD/EXXXY* 4) Sulfatación: XE/DY*X 5) Prenilación: C*AAX ; C*C ; C*XC* (en el C-terminal). 6) Miristoilación: M-G*XXXS/T 91

92 LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS. Para la funcionalidad adecuada de una proteína se requiere mucho mas que la integridad del gen estructural que la codifica. Si este está mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la proteína no será funcional. Pero puede suceder algo parecido si el gen estructural está intacto, pero hay mutaciones en otros genes que participan en lo que realmente le interesa a la célula, que es la proteína perfectamente plegada, con las modificaciones posttraduccionales requeridas y localizada en el compartimento subcelular correcto. genes: Se requerirá la integridad y funcionalidad correcta de otros 92

93 a) Los que codifican a enzimas que introducen modificaciones post-traduccionales. b) Los que codifican proteinasas de procesamiento. c) Los que codifican proteínas requeridas para el transporte e integración de la proteína en el compartimento correcto. d) Los que codifican enzimas que catalizan la degradación de la proteína. e) Los genes regulatorios que codifican factores de transcripción necesarios para la expresión de la proteína. f) Secuencias regulatorias, como enhancers, etc. g) Genes involucrados en metilación del DNA, estructura de la cromatina, etc. 93

94 DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA. 1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma humano, y que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más proteínas, el número total de proteínas en un organismo superior puede variar entre 50,000 y 500,000. 2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que los ácidos nucleicos. La composición y secuencia de aminoácidos de una proteína determina: a) su masa molecular; b) su carga total a diferentes valores de ph; c) su hidrofobicidad; d) su forma, es decir el plegamiento de la proteína nativa. Esto a su vez determina la solubilidad de las proteínas en diferentes solventes, su comportamiento en los métodos de separación y purificación, y su vida media in vitro. La diversidad de propiedades fisicoquímicas es muchísimo mayor que la de los ácidos nucleicos. 3) Los valores de pi de las proteínas varían entre menos de 3 y más de 12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5 y el otro alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango estrecho de pi, en la zona ácida. 94

95 4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas, en tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello insolubles en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas totales nunca entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema hidrofobicidad. 5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos miles y varios millones de Daltons, y su tamaño no puede predecirse con certeza a partir de la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de DNA, por las modificaciones post-traduccionales. 6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango muy amplio, probablemente mayor que el rango de los mrnas. La diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras en los flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud. 95

96 MACROMOLECULAS DE UNA CELULA TIPICA HUMANA: 1) DNA: unos 22,000 genes. 2) mrnas: Alrededor de 40,000 moléculas en todo momento, pertenecientes a alrededor de 5,000 especies moleculares diferentes. Un 80 % están en bajos niveles. 3) Proteínas: Unos de moléculas, de las cuales las 100 proteínas más abundantes constituyen alrededor del 90 % de la masa proteica total celular. La diferencia entre las proteínas de mayor abundancia, como la actina, y las de menor abundancia, como proteínas regulatorias, es de alrededor de de veces. 96

97 LAS HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DEL PROTEOMA La técnica principal utilizada es la separación de las proteínas por electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, seguida de identificación de dichas proteínas por secuenciación o por espectrometría de masa, en general después de hidrólisis enzimatica parcial. Actualmente se utilizan otras combinaciones de técnicas, por ejemplo cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien combinada con espectrometría de masa. Se está trabajando activamente en la identificación por métodos similares de proteínas en mezclas complejas, previa hidrólisis enzimática parcial. 97

98 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Electrophoresis 2000, 21,

99 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA. Ventajas: Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000 proteínas en un solo gel. Ninguna otra técnica es capaz de analizar simultáneamente miles de proteínas. Desventajas: 1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes condiciones de rango de ph y de concentración de acrilamida, para resolver las mezclas muy complejas. 2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy ácidas o muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas). 3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden variar en concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver proteínas minoritarias, es necesario en general purificar la organela en que se encuentran y trabajar con ese material. Tambien se puede trabajar previa marcación radioactiva, para aumentar la sensibilidad de detección. 99

100 NUMERO DE MANCHAS PROTEICAS REVELADAS EN GELES GRANDES DE 2-DE A PARTIR DE TRES ORGANOS DE RATON. Fracción tisular Número de manchas Hígado Cerebro Corazón (A) Sobrenadante (buffer) 9,204 8,458 4,790 (B) Extracto del pellet (urea, CHAPS) 1,975 1,692 1,470 (C) Pellet suspendido, DNA digerido Manchas totales por órgano 11,252 10,200 6,300 NOTA: Las manchas contadas en (A) no están en (B) ni en (C), y así sucesivamente. (A) son probablemente proteínas citosólicas; (B) de organelas, y (C) proteínas cromosomales, como las histonas. LOS EXTRACTOS CONCENTRADOS DE ORGANELAS REVELAN MUCHAS PROTEINAS MINORITARIAS. 100

101 Relationship between protein copy number and cell level μ g ng pg fg Coomassie silver 1x10 4 1x10 5 1x10 6 1x10 7 1x10 8 1x10 9 1x10 10 (1 μg) (10 μg) (100 μg) (1mg) (10mg) (100mg) (1g) # of cells loaded on gel (Protein quantity) 10 copies/cell 1000 copies/cell copies/cell nmole pmole fmole amole R. Simpson, LICR, Melbourne, Australia 101

102 Prefix # molecules Amount BSA 1 mole 6x kg 1 mmole 6x g 1 µmole 6x mg 1 nmole 6x µg 1 pmole 6x ng 1 fmole 6x pg 1 amole 6x fg 1 zmole 6x ag 1 ymole 6x zg 102

103 ID OF PROTEINS BY EDMAN vs MALDI-ToF-MS EDMAN DEGR. MALDI-ToF-MS Sensitivity Low pmole Low fmole Clean-up? Yes No Running cost US$ 150/peptide < 1 /analysis Analysis time Overnight A few min # Cell culture flasks needed PTM analysis? Only using std s Possible (?) 103

104 Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) Utilized to identify SUMO-targets in yeast by Wohlschlegel and co-workers. 1) Yeast expressing an 8His-tagged yeast SUMO (Smt3). Control, an untagged yeast strain. 2) IMAC affinity chromatography under denaturing conditions. 3) Digestion by sequential addition of LysC and Trypsin. 4) Chromatography on a triphasic microcapillary column loaded with a strong cation exchange (SCX) resin flanked by two segments of reverse phase (RP) material. 5) Elution directly into the mass spectrometer, peptide fragmentation by CID and recording of MS/MS spectra. 6) Analysis of the data using appropriate algorithms, and substraction of the proteins identified in the control sample. 104

105 Analysis of membrane proteins from mouse brain by multidimensional chromatography. Frozen mouse brain extracted in 5 steps (the last buffer containing SDS). Samples submitted to 1D-PAGE; 4 mm slices separately digested with trypsin. Peptide separation by cation-exchange chromatography; eluate fed on line to ESI mass spectrometer, and MS/MS analysis performed. Data analysed and 126 membrane proteins identified (twice as many as when 2D PAGE was used). Lohaus, C. et al. (2007) J. Proteome Res. 6,

106 Strategy of protein identification by peptide mass fingerprinting. (A) The unknown protein is excised from a gel and converted to peptides by the action of a specific protease. The mass of the peptides produced is then measured in a mass spectrometer. (B) The mass spectrum of the unknown protein is searched against theoretical mass spectra produced by computer-generated cleavage of proteins in the database. 106

107 Protein identification by MS/MS. (A) Protein from P. falciparum was resolved on a one-dimensional polyacrylamide gel, excised, and ingel digested with trypsin. The resulting peptides were ionized by electrospray and analyzed by a Quadrupole-TOF mass spectrometer. (B) The MS spectrum produced was scanned, and a parent ion of was selected for fragmentation. (C) Enlargement of the parent ion peak at 678 shown in panel B. The multiplet of peaks is due to the contribution in mass from the naturally occurring isotope 13C. A mass difference between the peaks of 0.5 Da indicates that the peptide is doubly charged. (D) MS/MS scan of the 678 parent ion and analysis of the daughter ions produced. All y-ions (except for y-11) produced from fragmentation of the peptide are shown. (E) Identification of rhoptryassociated protein-2 using BioAnalyst software (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). 107

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