Cómo se logra esa diversidad funcional? estructuras tridimensionales posibles. diversidad de secuencias primarias

Transcripción

1 Proteínas Proteínas cumplen diversas funciones en sistemas biológicos: enzimática (enzimas intervienen en todos procesos biológicos y químicos en la célula) estructural (colágeno, queratina, elastina) hormonal (insulina) de reserva (proteínas semillas y huevos) transporte (albúmina, proteínas transportadoras de ácidos grasos) contráctil (miosina, actina y tubulina) protectora (toxinas y alergenos) anticuerpos (inmunoglobulinas)

2 Cómo se logra esa diversidad funcional? diversidad de secuencias primarias Pro-Ile-Asp-Asn-Glu-Glnl-Arg-Gly-Met-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Pro-Phe-Tyr-Trp-Pro-Phe-Tyr-Trp Tyr-Trp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-ThrPro-Phe-Tyr-Trp-Leu-Phe- Pro-Phe-Tyr--Lys-VaTrp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr Leu-Ile-Pro-Phe-Tyr-Trp-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr Phe-Tyr-TrPro-p-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Gln-Lys-Val-Gln-Lys-Val Pro-Phe-Tyr-Trp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp estructuras tridimensionales posibles Infinitas formas proteicas distintas dependiendo de la longitud de la cadena polipeptidica, tipo y proporción de aminoácidos presentes y la secuencia en que estos se encuentran

3 Niveles estructurales en las proteínas Estructura primaria: cadena lineal de aminoacidos unidos por enlace amida Estructura secundaria: disposición espacial periódica de los a.a. en segmentos de la cadena polipeptdidica Estructura terciaria: disposición espacial lograda cuando la cadena polipeptidica se pliega en una estructura tridimensional Estructura cuaternaria: disposición espacial de monómeros de proteínas

4 Plegamiento de proteínas Desplegado Nativo Conocer como ocurre el proceso de plegamiento es uno de los grandes problemas de la bioquímica importancia básica relevancia biotecnológica importancia médica Toda la información para el plegamiento se encuentra en la secuencia de aminoácidos (experimento de replegamiento de ribonucleasa (Anfinsen)

5 Proceso cooperativo no se acumulan estados parcialmente plegados

6 Paradoja de Levinthal: las proteínas no se pliegan explorando todas las conformaciones al azar Se fijan estados intermediarios parcialmente plegados

7 Conformación nativa: estado termodinámico en que se favorecen interacciones favorables y se minimizan desfavorables Qué fuerzas están implicadas en la estabilidad de proteínas? Interacciones electrostáticas (atractivas o repulsivas) su fuerza depende del medio Interacciones puente Hidrógeno: interacción entre átomo de hidrógeno unido covalentemente a átomo electronegativo (N, O, S) con otro átomo electronegativo Interacciones de van der Waals: dipolo-dipolo inducido, dipolo inducido-dipolo inducido entre átomos neutros Impedimentos estéricos Enlaces disulfuro: por oxidación de cisteínas Todas estas interacciones estabilizan la estructura de una proteína, pero no provocan su plegamiento en solución acuosa Interacciones hidrofóbicas

8 Porqué se pliegan las proteínas? Fuerza impulsora: efecto hidrofóbico (cadenas laterales apolares se esconden del solvente) G pleg = H pleg -T S pleg Cadenas laterales hidrofóbicas interaccionan con el agua ( H negativo). Al hacerlo, muchas moléculas de agua se estructuran a su alrededor ( S negativo) El sistema se rearregla para acomodar grupos hidrofóbicos escondidos del agua e hidrofílicos interaccionando con ella. La entropía del sistema aumenta y es la que dirige el proceso

9 Investigación en proteínas Proteoma: proteínas expresadas por el genoma función de proteínas interacciones entre proteínas en vía metabólica proceso dinámico (depende de estado fisiológico, edad, etc.) Pasos a seguir: Fraccionamiento celular Purificación Análisis de estructura

10 Material de partida: reconocer en que fracción celular se encuentra la proteína de interés.

11 Métodos de purificación: diferencias en solubilidad, tamaño, carga o afinidad por ligandos Importante! Ensayo para identificar proteína de interés Cuantificar proteína en cada paso de purificación

12 Precipitación salina (solubilidad) Las proteínas son menos solubles en soluciones concentradas de ciertas sales (carácter cosmotrópico de ciertos iones: aumentan la estructura del agua) proteínas presentan distinta solubilidad a alta concentración de sal Se precipitan las moléculas de proteína por interacción hidrofóbica entre aminoácidos de distintas moléculas

13 Diálisis (tamaño) Membrana porosa que permite el flujo de ciertas moléculas y retiene otras de acuerdo a su tamaño. Técnica muy utilizada para cambio de buffer o separación de proteínas grandes de moléculas pequeñas

14 Cromatografía de exclusión molecular: separa por tamaño molecular Se utiliza para: Separación de proteínas Desalado Cálculo de peso molecular (relación entre peso molecular y coeficiente de partición en una columna cromatográfica)

15 Cromatografía de intercambio iónico: separa de acuerdo a la carga de la molécula Intercambio aniónico Intercambio catiónico Cómo despego las proteínas unidas?

16 Cromatografía de afinidad Ventajas: especificidad Desventajas: especificidad Enzima-sustrato Antígeno anticuerpo Ligando-receptor Ligando-proteína transportadora Cómo despego las proteínas unidas?

17 HPLC: high pressure liquid cromatography aumenta la resolución disminuye la dilución de la muestra

18 Electroforesis en gel de poliacrilamida: separa por tamaño y carga (No se utiliza como método de separación sino de identificación y cuantificación) velocidad de migración Coeficiente de fricción ν = q E / f f = 6πηr E= campo eléctrico q= carga proteína η= viscosidad del medio r= radio proteína Condiciones nativas: migración depende de carga, masa y forma Soporte sólido actúa como tamiz

19 Electroforesis en condiciones desnaturalizantes: Se despliega la proteína y se la tapiza con cargas negativas con SDS Separa por masa molecular (relación inversamente proporcional entre la masa de una proteína y su movilidad relativa en un gel de electroforesis) Nos independizamos de la carga y la forma de la proteína Tinción con coomasie Técnica altamente resolutiva y económica

20 Isoelectroenfoque: separa por diferencia en pi velocidad de migración ν = q E / f

21 Electroforesis bidimensional isoelectroenfoque (carga) SDS-poliacrilamida (masa)

22 En cada calle se siembra igual cantidad de proteína total. Al final de la purificación la banda de la proteína de interés se hace más importante

23 Sedimentación diferencial Permite conocer masa, densidad, forma S= m(1-νρ)/f ν=volumen específico parcial ρ=densidad del medio f= coeficiente de fricción (1-νρ)= fuerza flotación ejercida por líquido

24 Obtenida la proteína pura.. Técnicas para estudiar distintos niveles de la estructura proteica Secuenciación (estructura primaria) Fluorescencia (estructura tridimensional y terciaria) NMR (estructura secundaria y terciaria) Rayos X (estructura secundaria y terciaria) Infrarrojo (estructura secundaria y terciaria) Dicroísmo Circular (estructura secundaria y terciaria)

25 Análisis de estructura primaria Determinación de composición de aminoácidos: hidrólisis con HCl 6N a 110ºC durante 24 hs y posterior análisis cromatográfico del producto.

26 Secuenciación de Edman: separa de a uno a la vez el residuo amino terminal En la práctica, los segmentos de aminoácidos no pueden ser muy largos: previamente a la secuenciación se somete a la proteína a proteólisis con distintas proteasas para obtener segmentos más cortos y fáciles de analizar Luego por solapamiento de secuencias se obtiene la secuencia de la proteína

27 Espectroscopía de emisión de fluorescencia Emisión siempre ocurre desde S 1 λ em > λ exc ; energía em < energía exc

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29 Triptofano: muy sensible a la polaridad del medio Muy útil para medir cambios conformacionales Proteína con muchos triptofanos, se observa un promedio: pierde sensibilidad

30 ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO medición de transiciones vibracionales entre el estado basal y el primer estado vibracional las vibraciones características de átomos unidos covalentemente son: stretching y bending

31 la banda de absorción más utilizada para el estudio de la estructura de proteínas es la Amida I (C=O stretching) Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP Amida I (') t(0) t(3 hs) el espectro de IR de proteínas presenta varias bandas que son debidas a la vibración de los átomos involucrados en el enlace peptídico Absorbance Amida II (y cadenas laterales) 0.00 Amida II' Wavenumber (cm -1 )

32 Asignación de bandas (cm -1 ) Conformación en solución de H 2 O en solución de D 2 O hélice alfa cadena beta antiparalela cadena beta paralela desordenadas de acuerdo a los distintos arreglos de puente hidrógeno (distintas estructuras secundarias) la banda Amida I aparecerá en distintas posiciones B-FABP α-lactalbumina BSA Absorbance Absorbance Absorbancia ν (cm -1 ) ν (cm -1 ) ν (cm -1 )

33 Cristalografía de rayos X

34 Patrón de difracción de rayos X Mapa de densidad electrónica Cristal proteico conserva actividad biológica: estructura nativa Desventajas: no todas las proteínas son cristalizables costoso permite solo el estudio de proteínas en solución

35 Nuclear magnetic resonance (NMR) Núcleos atómicos intrínsicamente magnéticos: spin (rotación) Rotación genera momento magnético Al aplicar un campo magnético este momento puede adoptar dos orientaciones Se aplica pulso de radiación electromagnética (radiofrecuencia)

36 Entorno químico afecta la frecuencia con la que el núcleo resuena Determinación de estructura Proteína de 55 aminoácidos Más compleja la molécula, más complejo el espectro