MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.

Transcripción

1 MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. Muchas proteínas no están terminadas cuando se completa la traducción, y requieren madurar, a través de modificaciones posttraduccionales. Estas modificaciones pueden consistir en: Modificación covalente de residuos de aminoácidos (más de 200). Proteólisis parcial. Las modificaciones pueden ser: Reversibles o irreversibles. Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas. Enzimáticas o no enzimáticas. Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales tardías. 1

2 MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MAS COMUNES EN LAS PROTEINAS. - Formación de puentes disulfuro. - N- y O- glicosilación (Asn, Ser/Thr). - Fosforilación (Ser/Thr; Tyr; His; Arg; Lys; Asp o Glu) - Acetilación (N-terminal) - Amidación (C-terminal) - Remoción reversible del C-terminal en tubulinas. - Metilación (Leu, Isoprenil-Cys, Lys, Arg, His) - Hidroxilación (Pro, Lys) - Sulfatación (Tyr) - ADP-ribosilación - Modificaciones para inserción en membranas: - Palmitoilación y miristoilación. - Prenilación (farnesilación, geranilgeranilación). - Unión de ancla de glicosil fosfatidil inositol. - Procesado proteolítico: - Remoción del péptido señal. - Remoción de dominios pro- - Procesamiento de precursores hormonales, poliproteínas virales. - Splicing de proteínas. 2

3 ALGUNAS SECUENCIAS CONSENSO PARA MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS. 1) N-Glicosilación: N*XT/S (X no puede ser Pro). 2) O-glicosilación: PXS*/T*XXP 3) Fosforilación: Ser/Thr: RRXS* ; KRXXS* ; K/RK/RXS*/T* ; K/RS*/T*XK/R; K/RS*/T*P Tyr: K/RXXXD/EXXXY* 4) Sulfatación: XE/DY*X 5) Prenilación: C*AAX ; C*C ; C*XC* (en el C-terminal). 6) Miristoilación: M-G*XXXS/T 3

4 ALTERACIONES DE LOS AMINOACIDOS TERMINALES. 1) N-terminal: 1) Metionina N-terminal: Grupo formilo: Deformilasa. Metionina inicial: Aproximadamente la mitad de las proteínas, tanto eucarióticas como procarióticas. Metionina aminopeptidasa, asociada con los ribosomas. 2) Agregado de residuos al N-terminal: Transferencia de residuos de aminoácidos desde trnas cargados (p.ej.: Leu o Phe a una Arg o Lys N- terminal). Función desconocida: Marcado de la proteína para degradación inmediata? 3) Acetilación del N-terminal: 60 a 90 % de las proteínas sintetizadas en el citosol de células eucarióticas. N-α-acetil transferasa. Acetil-CoA. Co-traduccional. Recientemente se ha propuesto que puede participar en el marcado de proteínas para su degradación en el proteasoma. Problema para la secuenciación automática de la proteína intacta por Edman. 4

5 4) Otras acilaciones: Adición de grupos formilo, piruvoílo, α-cetoacilo, glucuronilo. Formación de piroglutamilo, a partir de Gln N-terminal, por la acción de una glutaminil ciclasa. Acido piroglutámico. Acido L-2-pirrolidona-5-carboxilico. Puede ser eliminado de las proteínas que lo contienen como residuo N-terminal por las piroglutamil peptidasas. Ejemplo: la hormona liberadora de la tirotropina (TRH) 5

6 LIPIDACION El morfógeno secretado Hedgehog se autoprocesa en un motivo GCF y a la nueva Gly C- terminal se le une colesterol; luego este producto es N- palmitoilado en la Cys en la zona N-terminal. Otro morfógeno secretado, Wnt, es S-palmitoilado en Cys 77 y O-acilado con ácido palmitoleico en Ser 209; la O- acilación está asociada a la salida del retículo endoplásmico y su ulterior secreción. 6

7 5)Miristoilación: Proteínas citosólicas. Miristoil-CoA: proteína N-miristoil transferasa. Co-traduccional. Gly N-terminal, expuesta por eliminación de la Met N-terminal o por clivage proteolítico. Permitiría asociaciones débiles con membranas o interacción con otras proteínas. 7

8 2)C-terminal: 1) Anclas de glicosilfosfatidilinositol. Se sintetizan completas y se transfieren a la proteína en el RE, enseguida de la traducción. Permiten la rápida difusión en el plano de la membrana. 8

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12 THE GPI:PROTEIN TRANSAMIDASE COMPLEX 12

13 2) Farnesilación y geranilgeranilación: Secuencia CAAX, con A alifático. El grupo SH es prenilado, se eliminan proteolíticamente los tres residuos del C- terminal, y la Cys C-terminal se metila en el carboxilo a partir de la S-adenosilmetionina (SAM). 13

14 Procesamiento de la Prelamina A. La falta de la enzima responsable de la última etapa causa una forma de progeria humana. 14

15 Palmitoilación de Cys: Unión tioéster, reversible. Presente en general en proteínas que ya son intrínsecas de membrana. Agregado en el RE o en el Golgi. Algunas veces se presenta sólo si el C- terminal está farnesilado. Funciones: 1) Aumentar la afinidad de una proteína soluble por las membranas, regulando su tráfico o retención; 2) modular la estabilidad de algunas proteínas, a através de un control de calidad del plegamiento correcto. 15

16 LIPIDACION DOBLE: FARNESILACION Y PALMITOILACION 16

17 ACETILACION DE RESIDUOS INTERNOS DE LISINA. Recientemente se ha descripto que un número muy sustancial de enzimas de vías metabólicas centrales (glucólisis, ciclo de Krebs, ciclo de la urea, metabolismo del glucógeno, metabolismo de los ácidos grasos) pueden ser acetiladas por acetilasas y deacetiladas por deacetilasas, teniendo esta reacción finalidad regulatoria, pues producen cambios en la actividad de esas enzimas. Se ha propuesto que esta modificación, detectada en muchos organismos, desde bacterias hasta el hombre, tendría una significación similar a las reacciones de fosforilación y defosforilación. Una comparación entre las proteínas acetiladas en hepatocitos humanos y de ratón demostró un 70 % de identidad, en tanto que hubo sólo un 14 % de coincidencia entre las presentes en hepatocitos y una linea celular de leucemia humana, lo que sugiere que hay grandes variaciones en los patrones de acetilación en diferentes células. 17

18 SULFATACION DE PROTEINAS Sulfatación de Tyr (O-sulfatación): Tirosil proteína sulfotransferasa, proteína integral de membrana con su sitio activo en el lumen del trans-golgi. Dador de sulfato: PAPS (3 fosfoadenosina-5 fosfosulfato). Función desconocida; podría estar relacionada con las modulación de interacciones proteína - proteína en proteínas secretadas o ligadas a membrana. 18

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20 3) Amidación del C-terminal: El grupo amido deriva de una Gly C-terminal. La reacción es catalizada por dos enzimas, con intervención de ácido ascórbico, Cu y O 2. 4) Eliminación reversible de la Tyr C-terminal en la tubulina: La α-tubulina se sintetiza con Tyr C-terminal. Hay una tubulinil-tirosina carboxipeptidasa y una tubulinil-tirosina ligasa (Tyr y ATP). Importante en la formación y desensamblado de microtúbulos (monómero tirosinado). 20

21 Carboxilación de Glu: Carboxilasa dependiente de vitamina K, que requiere O 2 y CO 3 H -. Proteína integral de membrana, con su sitio activo en el lumen del RE. Presente en factores de coagulación. En el factor X, el propéptido dirige la carboxilación de los 12 residuos de Glu más cercanos al N-terminal. El Gla está involucrado en la unión de Ca++. Las proteínas sintetizadas en presencia del antagonista dicumarol son inactivas. 21

22 Hidroxilación: Pro y Lys. Maduración del colágeno en el RE. Las enzimas son la prolil 4-hidroxilasa, la prolil 3-hidroxilasa y la lisil 5-hidroxilasa. Requieren Fe ++, ascorbato, O 2 y α-oxoglutarato. Son esenciales para el plegamiento y ensamble del colágeno maduro. 22

23 Fosforilación: Normalmente reversible, con funciones regulatorias. Proteína quinasas y proteína fosfatasas. 23

24 ADP-ribosilación: Reversible. Regulatoria. Núcleo y citosol. Las mono- ADP-ribosil transferasas (MART) usan el NAD para transferir el grupo ADP-ribosilo a cadenas laterales de aminoácidos (N de His, Arg, Asn o Lys, carboxilo de Glu, carboxilo de Lys C-terminal). Este grupo puede ser removido por la mono-adpribosil-x-hidrolasa. Existe además una familia de poli-adp ribosa polimerasas (PARP) capaces de polimerizar numerosas unidades de ADP-ribosa, dando estructuras lineales o ramificadas de poli-adp ribosa, pero no hay evidencia de que estos polímeros estén unidos covalentemente a proteínas. Estos polímeros pueden ser hidrolizados por la poli (ADP-ribosa) glicohidrolasa, y el grupo directamente unido a la PARP por la ADP-ribosil proteína liasa. Los efectos tóxicos de las toxinas diftérica, colérica y pertussis se deben a la ADP-ribosilación de proteínas regulatorias. La ADP-ribosilación tiene un papel importante en procesos como la señalización inter- e intracelular, la transcripción, la reparación del DNA, la regulación del ciclo celular y la mitosis, así como de necrosis y apoptosis. 24

25 REACCIONES DE ADP- MONORIBOSILACION El residuo de aminoácido aceptor puede ser Arg, Asn, Cys, Glu, Asp, P-Ser. 25

26 METABOLISMO DE POLI-ADP-RIBOSA. 26

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44 O-GLICOSILACION Las mucinas son típicas glicoproteínas que presentan O-glicosilación. Cuando el porcentaje de carbohidrato es alto, como en este caso, estas proteínas se extraen en solución acuosa en una partición fenol/agua, como lo hacen los ácidos nucleicos, y no son precipitables por ácidos tricloroacético o perclórico. Hay heterogeneidades en el peso molecular, dependiendo del contenido variable en carbohidrato, y tienen comportamiento anómalo en SDS- PAGE. El contenido en carbohidrato puede determinarse por el método del fenol-sulfúrico, que tiene relativamente poca interferencia con los aminoácidos de la parte proteica. FUNCIONES: estabilización de la proteína contra proteólisis y desnaturalización térmica. Modulación de agregación. Funciones en el reconocimiento celular (selectinas, por ejemplo) 44

45 TIPOS COMUNES DE O-GLICOSILACION 1) Tipo O-GalNAc. Son las mas abundantes, con GalNAc unida a Ser o Thr por una unión α-glicosídica: Mucinas. 45

46 2) Tipo O-GlcNAc. Proteínas regulatorias, nucleares o citosólicas. 3) O-fucosilación. Presente en algunas proteínas involucradas en procesos tales como coagulación (Factor VII, Factor XII) y señalización celular. 4) O-manosilación. Frecuente en levaduras, pero tambien presente en glicopéptidos de cerebro de rata. 5) O-glucosilación. Detectada en proteínas de la cascada de coagulación, como Factor VII y Factor IX. 6) Fosfoglicosilación. GlcNAc, Fuc y Man ligadas a Ser indirectamente por una unión fosfodiester. Probablemente involucrada en tráfico intracelular. 7) Glicosilación tipo O-glicosaminoglicano. Los mucopolisacáridos se unen a los proteoglicanos a través de una xilosa unida en β a Ser o Thr. P. ej.: condroitinsulfato. 8) Glicosilación tipo colágeno. HidroxiLys glicosilada por una Gal unida en β. 46

47 Estas uniones son lábiles al alcali, y se rompen por tratamiento con OHNa M, durante 24 hs. a temperatura ambiente. 47

48 Esta unión, en configuración β-d- es más estable que la unión peptídica a la hidrólisis alcalina. En presencia de 2M OHNa a o C, durante hs. se aísla Gal-Hyl o Glc(1-2)Gal-Hyl. Tambien es estable en condiciones ácidas (0.05 M H 2 SO 4 a 100 o C, durante 28 hs.), debido a que la carga positiva del ε-amino estabiliza la unión. 48

49 BIOSINTESIS DE PROTEÍNAS O-GLICOSILADAS Hay diferentes N-acetilgalactosaminil transferasas, cuya localización es específica del tipo celular y puede variar con la diferenciación. Una glicoproteína puede estar O-glicosilada de manera diferente en diferentes tejidos. La O-glicosilación se produce luego de la traducción y del plegamiento de la proteína. Por eso sólo los residuos de Ser y Thr expuestos podrán ser glicosilados. Por eso ocurre en general en los giros β o en regiones extendidas, por su alto contenido en Pro. Este proceso ocurre en general en el Golgi, aunque en algunos casos podría iniciarse en el retículo endoplásmico. Los monosacáridos se transfieren de a uno por vez, no en bloque como en la N-glicosilación. 49

50 BIOSINTESIS DE LOS DETERMINANTES DE LOS GRUPOS SANGUINEOS A Y B 50

51 IDENTIFICACION DE MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES. 1) Establecer la presencia de un aminoácido inusual en la proteína, ya sea por predicción a partir de la secuencia del cdna, o por características inusuales de la proteína, o por observaciones casuales. 2) Determinar la estructura química del compuesto y establecer su localización en la cadena polipeptídica. NO HAY REGLAS O PROCEDIMIENTOS GENERALES, PUES HAY CERCA DE 200 AMINOACIDOS SECUNDARIOS DERIVADOS DE LOS 20 PRIMARIOS. Se requiere, en general, equipo para análisis de aminoácidos, secuenciación (Edman), espectrometría de masa, NMR. Hidrólisis enzimática preferible a la ácida. Comportamiento del derivado en los métodos de análisis standard. Edman: No se observará el derivado si el N-terminal está bloqueado, o si el producto primario no pasa a la fase orgánica, por ejemplo por ser muy hidrofílico, o si el PTH derivado eluye fuera de la región monitoreada en el cromatograma standard. 51

52 Determinación de la presencia de N-glicosilación: Unión a ConA-Sepharose y elución específica. Aumento de movilidad electroforética después del tratamiento con enzimas como la endo-n-acetilglucosaminidasa H (Endo H). X en secuenciación automática por Edman. Una vez determinado el sitio de la cadena peptídica donde se encuentra unido el oligosacárido, su composición y estructura deben determinarse por métodos de química de carbohidratos, incluyendo HPLC (Dionex) y el uso de glicosidasas específicas de monosacárido y tipo de unión. 52

53 O-glicosilación: β-eliminación Estos compuestos absorben en el UV y se puede detectar su formación por absorbancia. La β- eliminación reduce el nivel de Ser y hr en la proteína, y su cuatificación antes y después sirve para cuantificar. El NaNH 4 reduce el carbohidrato eliminado a alditol, y puede ser usado para su identificación. 53

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55 Fosforilación: Marcación con 32 P i, in vivo o in vitro. Localización del fosfato: Método de Edman modificado para extraer el fosfoaminácido-pth y contar la radioactividad. Tambien puede hacerse por β- eliminación, agregando β-mercaptoetanol para formar un tioéter con la dehidroalanina o la β-metil dehidroalanina, detectando el derivado con el secuenciador (Edman). Puentes disulfuro: 1) establecer si hay puentes disulfuro (SDS-PAGE con muestras reducidas y sin reducir). 2) Evitar el intercambio de puentes disulfuro (catalizado por trazas de tioles a ph algo alcalino). 3) Fragmentar la proteína sin reducirla; separar los péptidos; romper los puentes por oxidación (ácido perfórmico) o reducción (β-mercaptoetanol); repetir el método de separación. Esto se hacía (Hartley) por cromatografía bidimensional en papel, con oxidación con vapores de ácido perfórmico después de la primera corrida, y actualmente por HPLC en fase reversa. La respuesta definitiva sobre los puentes disulfuro la da la determinación de la estructura tridimensional de la proteína. 55

56 MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL POR PROTEOLISIS LIMITADA. Puede llevarse a cabo por autoproteólisis, en enzimas proteolíticas, o por proteinasas específicas de procesamiento. La proteólisis debe llevarse a cabo de modo muy específico, y requiere la presencia de la o las enzimas necesarias en el mismo compartimento en que se encuentra la proteína a procesar. Veremos cuatro casos principales: - Remoción del péptido señal. - Remoción de dominios pro- - Procesamiento de precursores hormonales y poliproteínas virales. - Splicing de proteínas. 56

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