QUÉ TÉCNCIAS SE PUEDEN UTILIZAR PARA COMPROBAR LA AUTENTICIDAD Y ASEGURAR LA TRAZABILIDAD DE LEVADURAS SECAS O ALTERANTES?

Transcripción

1 QUÉ TÉCNCIAS SE PUEDEN UTILIZAR PARA COMPROBAR LA AUTENTICIDAD Y ASEGURAR LA TRAZABILIDAD DE LEVADURAS SECAS O ALTERANTES? Amparo Querol

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3 ORIGEN DE LAS LEVADURAS VÍNICAS UVA 50-75% Kloeckera apiculata/hanseniaspora Metschnikowia Candida stellata, C. pulcherrima 1-10% Cryptococcus Rhodotorula Pichia membranefaciens Kluyveromyces Hansenula Torulaspora delbrueckii. Saccharomyces cerevisiae BODEGA Durante la Fermentación: S. cerevisiae S. uvarum Después de la Fermentación: Brettanomyces/Dekkera Zygosaccharomyces bailii

4 Saccharomyces cerevisiae

5 TRAZABILIDAD EN LEVADURAS 1. Autenticidad de levaduras secas activas 2. Seguimiento e implantación a lo largo de la fermentación 3. Determinación de contaminantes

6 AUTENTICIDAD DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS Diferenciar a nivel de cepa -Análisis de restricción del mtdna -Métodos basados en la técnica de PCR: elementos delta y RAPDS - Electroforesis en campo pulsante CARIOTIPOS

7 Autenticidad de levaduras secas activas Análisis de restricción del mtdna -Análisis de restricción del mtdna Querol y col. (1992) desarrollaron un método muy sencillo. Se basa en el uso de enzimas del tipo GCAT que reconocen un gran número de secuencias en el DNA nuclear y pocas en el mtdna. Las bandas del mtdna se visualizan como bandas definidas sobre una sombra de degradación correspondiente al DNA nuclear. Ventajas (Rápida, reproducible, económica, no requiere material sofisticado ni personal especializado). Por todo ello, es útil pensando en una aplicación industrial.

8 AUTENTICIDAD DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS Métodos basados en la técnica de PCR: elementos delta y RAPDS Son los métodos más rápidos. Se utilizan oligonucleótidos como cebadores los cuales se unen a secuencias diana en cada hebra del DNA. La amplificación se lleva a cabo con una DNA polimerasa termoestable y el protocolo de amplificación incluye un nº variable de ciclos (25-45) (desnaturalización del DNA, hibridación y periodo de extensión). Los perfiles de amplificación se visualizan en geles de agarosa al 1.4%.

9 Autenticidad de levaduras secas activas Métodos basados en la técnica de PCR: elementos delta Las secuencias delta son elementos de 0.3 KB que flanquean los retrotransposones Ty1. En el genoma están presentes unas 100 copias de estos elementos. Su nº y localización posee cierta variabilidad intraespecífica (útiles para diferenciar cepas). Ventaja (Muy resolutiva). Desventajas (Patrones de amplificación muy dependientes de la concentración de DNA, aparición de bandas fantasmas por la baja Tª de anillamiento (42ºC).

10 AUTENTICIDAD DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS Métodos basados en la técnica de PCR: cariotipos Los cromosomas se separan gracias a la aplicación alterna de dos campos eléctricos transversos. Las levaduras se crecen en medio líquido y luego se combinan con agarosa fundida y se colocan en pequeños moldes. Las células así embebidas se lisan in situ y el DNA libre se inmoviliza en la matriz de agarosa. Estos bloques se insertan en el gel.

11 AUTENTICIDAD DE LEVADURAS SECAS ACTIVAS Aplicación de métodos moleculares para la caracterización de 45 cepas vínicas de Saccharomyces (10 casas comerciales) (pb) *** * * * * * * * * * * * * * * m m m m A H : 1, 10, 14, 19, 20, 23, 31, 39, 44 B H : 6, 8, 30, 40 C H : 9, 41 D H : 11, 12 E H : 21, 34, 35, 43 F H : 22, 45 G H : 28, 29, 38 H H : 32, cepas identificadas (*) 28 cepas 8 grupos

12 Autenticidad de levaduras secas activas Aplicación de métodos moleculares para la caracterización de 45 cepas vínicas de Saccharomyces (10 casas comerciales) PCR: elementos delta Cariotipos De 45 cepas comerciales analizadas sólo 30 pueden considerarse distintas. Cepas de las misma casa comercial con distintos nombres y distintas casas comerciales vendiendo la misma cepa

13 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? Colonias de levaduras m T-73 B-II B-VI B-VIII T-73 B-II B-VI B-VIII m DNA total Restrición (mtdna)

14 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? mtdna PATTERNS DAY 0 DAY 2 DAY 4 DAY 6 DAY 21 Cuántas cepas de Saccharomyces cerevisiae están presentes inicialmente en el mosto? Más de 40 cepas de Saccharomyces cerevisiae en los mostos analizados I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV XXV XXVI XXVII XXVIII XXIX XXX XXXI XXXII XXXIII XXXIV XXXV XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX

15 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? m T-73 B-II B-VI B-VIII T-73 B-II B-VI B-VIII m B-I (T73) B-II B-VI B-VIII frecuencia (%) tiempo de fermentación (días)

16 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? Seguimiento de levaduras en fermentaciones especiales: el caso de vinos de Jerez

17 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación?

18 SEGUIMIENTO E IMPLANTACIÓN A LO LARGO DE LA FERMENTACIÓN Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? Evolución de cepas de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación alcohólica 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Patró V Patró IV Patró III Patró II Patró I 20% 10% 0% Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4

19 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES Pichia membranefaciens, P.anomala Candida spp., Saccharomycodes ludwigii Zygosaccharomyces bailii, Saccharomyces cerevisiae, S. ludwigii Dekkera/Brettanomyces spp.

20 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES B. bruxellensis B. nanus B. anomalus B. custersianus B. naardenensis Problema Modificación organoléptica del vino: olor a establo, sudor animal o cuero envejecido Causas Presencia de etilfenol, etilguayacol y ácido isovalérico producidos por Brettanomyces a partir de polifenoles y aminoácidos. LOD sensorial > 200 ng/ml.

21 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES (Identificación a nivel de especie) Colonia de levaduras Muestras de vinos Mezcla de reacción PCR RFLPs 5,8S-ITS

22 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES: Dekkera/Brettanomyces Dekkera spp? Identificación de levaduras presentes en mostos y vinos aisladas en un DBDM Producción de bajos niveles Candida cantarelli Candida wickerhamii Debaryomyces hansenii Kluyveromyces lactis Producción de altos niveles Dekkera anomala Dekkera bruxellensis Pichia guillermondii

23 DETERMINACIÓN ORIGEN DE CONTAMINACIÓN: Dekkera/Brettanomyces Characterización de levaduras para determinar el origen de contaminación en las bodegas Dekkera bruxellensis Insecto Drosophila Vino Vino en barrica Madera de barrica Pichia guillermondii Uva Raspones Drosophila Prensa Vino Vinos barrica Madera de barrica

24 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES: Dekkera/Brettanomyces Dekkera bruxellensis Insecto Drosophila Vino*** Vino en barrica*** Madera de barrica RFLP s of mtdna A De Portugal, España y USA Altos niveles de 4-ethylphenol (60mg/l) La contaminación puede ser anterior a poner el vino en la barrica

25 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES Vinos dulces Vino embotellado Sedimentos Producción de gas Malos olores Zygosaccharomyces bailii, Saccharomyces cerevisiae, S. ludwigii

26 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES Recuento microorganismos del vino mediante PCR cuantitativa a tiempo real - Sensibilidad - Rapidez (no cultivo) - Específica - Cuantifica - Compleja técnicamente Disponibilidad de sondas (oligonucleótidos) para la mayoría de microorganismos del vino: bacterias y levaduras incluyendo alterantes como Brettanomyces

27 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES - Especificidad -Melting curve: T m of 78.5ºC Species Strain reference Standard PCR S. bayanus CECT (1640, 1969, 1693, 10174), IFI (369, 371) Real-Time PCR - - Fluorescencia S. cerevisiae CECT (1462, 1475, 1485, 1881, 1882, 1894, 1985, 10120, 10131, 10308, 10322, 10557, 10995), CR a, PV a S. paradoxus CECT (1939 NT, 10175, 10176, 10308, 11143, 11152, 11158, 11422) S. pastorianus CECT (1940 NT, 1970, 11037, 11185) Temperatura (ºC) Candida rugosa CECT T Candida vini CECT T Candida zeylanoides CECT T - - Dekkera Bruxellensis IGC Issatchenkia orientalis CECT Pichia membranefaciens CECT 1115 T - - Saccharomycodes ludwigii CECT T - - Schizosaccharomyces pombe CECT Zygosaccharomyces bailli CECT : detection; -: no detection. Culture collections abbreviated as follows: CECT, Colection Española de Cultivos Tipo, Valencia, Spain; IFI, Instituto de Fermentaciones Industriales, Madrid, Spain; IGC, Portuguese Yeast Culture Collection, Portugal. a S. cerevisiae commercial baker s strains.

28 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES

29 DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES Este método es rápido y reproducible, es posible cuantificar, y es más sensible que los métodos convencionales.

30 Biología de Sistemas en Levaduras de Interés Biotecnológico: Biotecnología enológica Jose Manuel Guillamón Eladio Barrio Amparo Querol Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC