RESOLUCIÓN OIV-OENO

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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA IDENTIFICAR LA LEVADURA DE VINIFICACIÓN SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y OTRAS ESPECIES DE LEVADURA RELACIONADAS CON LA VINIFICACIÓN LA ASAMBLEA GENERAL VISTO el artículo 2, párrafo 2 iv, del acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino, A PROPUESTA del grupo de expertos Microbiología, DECIDE adoptar las siguientes herramientas de biología molecular para identificar la levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levadura relacionadas con la vinificación. DECIDE incluir el siguiente Preámbulo cuando se divulguen las Herramientas de biología molecular para identificar la levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levadura relacionadas con la vinificación y las Herramientas de biología molecular para la identificación de bacterias lácticas [Oeno-MICRO ] en la uva y el vino. Preámbulo [a Oeno MICRO y Oeno MICRO ] El origen, el desarrollo, los cambios y la sucesión de varias especies de levadura y bacterias puede seguirse utilizando técnicas moleculares específicas que permiten la diferenciación y tipificación de cepas de levadura. En los últimos años se han empleado diferentes técnicas en el estudio de la microbiología enológica. Estos métodos son sensibles y específicos, atendiendo a las diferentes necesidades, y son sencillos, rápidos, reproducibles, eficientes, fiables y económicos. La implementación de métodos moleculares para la identificación puede realizarse sin cultivo previo, o después de un enriquecimiento, o también después de aislar un microorganismo. Esto permite conocer mejor el sistema microbiano que se desarrolla sobre la superficie de la uva o en el vino. El objetivo de esta guía es ayudar a los laboratorios que llevan a cabo análisis microbiológicos en su tratamiento de la identificación de la levadura Saccharomyces cerevisiae y de otras especies de levaduras [Oeno MICRO ] relacionadas con la vinificación y para la identificación de bacterias lácticas [Oeno MICRO ] en la uva y el vino. Las técnicas presentadas consisten en la utilización principal de las técnicas moleculares existentes. Los métodos detallados se mencionan en la bibliografía. 1

2 Herramientas moleculares para identificar la levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levaduras relacionadas con la vinificación Para identificar y caracterizar levaduras en las diferentes etapas de vinificación, envejecimiento y almacenamiento se pueden usar métodos dependientes e independientes del cultivo. MÉTODOS DEPENDIENTES DEL CULTIVO IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE LEVADURA A NIVEL DE ESPECIE Reacción en cadena de la polimerasa y polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) del ADN ribosómico (ADNr) PRINCIPIO: Se trata de un método dependiente del cultivo porque requiere la extracción de ADN de un cultivo puro. Se basa en la amplificación de regiones específicas de las unidades de repetición del ADNr (como los espaciadores transcritos internos, ITS1 e ITS2, y el gen ARNr 5,8S situado entre los espaciadores o el gen ARNr 26S). Estas regiones contienen secuencias con alto grado de conservación y secuencias que presentan una gran variabilidad genética entre cepas de diferentes especies. En la mayoría de los casos, los productos amplificados por PCR de cepas de la misma especie y del mismo género tienen tamaños moleculares idénticos, y las especies del mismo género tienen tamaños similares. Aun siendo del mismo tamaño, la secuencia de estas regiones amplificadas difiere dependiendo de las especies. La diferencia entre secuencias se detecta mediante un análisis de restricción usando endonucleasas de restricción diferentes, tales como Cfo I, Hae III, Hinf I, DdeI, MboI. Los patrones de restricción difieren entre las especies. La enzima DdeI se requiere para la diferenciación entre H. uvarum y H. guilliermondii, como fue señalado por Esteve-Zarzoso et al. (1999) y Cadez et al., 2002; mientras que la enzima MboI es necesaria para distinguir C. zemplinina de C. stellata (Sipicki, 2004). Además, se deben usar otras enzimas de restricción para diferenciar especies del género Saccharomyces y sus híbridos (González et al., 2006). RESULTADOS: Esta metodología ya se ha usado para identificar aproximadamente 145 especies de levaduras pertenecientes a 26 géneros diferentes y los perfiles de restricción de todas las especies identificadas aparecen documentados en Esteve-Zarzoso et al. (1999) y Zanol et al. (2010). Se encuentra información disponible sobre ITS-5,8S en la web ( 2

3 Esteve-Zarzoso et al., (1999). Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic Bacteriology 49, Fernández-Espinar et al. (2000). RFLP analysis of the ribosomal transcribed spacers and the 5.8 S rrna gene region of the genus Saccharomyces: a fast method for species identification and the differentiation of flor yeasts. Antoine Van Leeuwenhoek 78: De Llanos et al (2004). Identification of species of genus Candida by RFLP analysis of the 5.8 S rrna gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Antoine Van Leeuwenhoek 85: Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non-saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102, Zanol G., Baleiras-Couto M.M., Duarte F.L. (2010) Restriction profiles of 26S rdna as a molecular approach for wine yeasts identification. Ciência e Técnica Vitivinícola 25: Cadez N., Raspor P., de Cock A.W.A.M., Boekhout T., Smith M.Th. (2002) Molecular identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and Kloeckera. FEMS Yeast Research 1, Sipiczki M. (2004) Species identification and comparative molecular and physiological analysis of Candida zemplinina and Candida stellata. J. Basic Microbiol. 44 (6), González S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A. (2006) Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, Secuenciación de la región D1/D2 tras la amplificación del PCR PRINCIPIO: Este es un método dependiente de cultivo dado que requiere la extracción de ADN desde un cultivo puro. Se basa en la amplificación de la región D1/D2 del gen ARN 26S y de la posterior secuenciación del amplicón resultante. La secuencia de D1/D2 difiere más de un 1% entre especies distintas y menos de un 1% entre cepas pertenecientes a la misma especie. RESULTADOS: La secuencia de la región D1/D2 del gen ARNr 26S se puede distinguir entre la mayoría de especies conocidas de levadura. La secuencia de la región D1/D2 del gen ARNr 26S permite la clasificación y la identificación filogenética de aislados desconocidos porque la base de datos existente es con mucho la mayor de los genes de levaduras. 3

4 Kurtzman y Robnett (1997) Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene. J Clin Microbiol. 35, 5 :: Kurtzman y Robnett (1998) Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van Leeuwenhoek. 73, 4,: Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rdna restriction analysis as a tool to characterise non-saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol 102, IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE VINIFICACIÓN A NIVEL DE CEPA Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del ADN mitocondrial (mtdna) PRINCIPIO: el ADN mitocondrial (mtdna) de S. cerevisiae es una pequeña molécula de Kb cuyo grado de variabilidad se puede ver mediante análisis de restricción. El alto grado de polimorfismo del mtdna sirve para analizar la variabilidad de las cepas de S. cerevisiae del vino. Se trata de uno de los métodos más usados para caracterizar aislados de vino durante la fermentación alcohólica. Querol et al (1992) y López et al (2001) simplificaron el método de análisis: sólo se necesita la extracción de ADN total de un aislado de cultivo puro y un análisis de restricción con enzimas Hinf I o RsaI (Guillamón et al, 1994, Schuller et al, 2004; Lopes et al, 2006). RESULTADOS: Esta técnica permite analizar en poco tiempo una gran cantidad de cepas. Se puede usar en la industria del vino porque es rápida y segura, y porque no requiere equipos de PCR. Querol et al (1992). A comparative study of different methods of yeast strain characterization. Syst. Appl. Microbiol. 15: Guillamón et al (1994). Rapid characterization of four species of the Saccharomyces sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. Int. J. Bacteriol. 44: López et al (2001). A simplified procedure to analyse mtdna from industrial yeast. Int. J. Food Microbiology 68: Schuller D, Valero E., Dequin S., Casal (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiology Letters 231, Lopes C.A, Lavalle T.L, Querol A., Caballero A.C. (2006) Combined use of killer biotype and mtdna-rflp patterns in a Patagonian wine Saccharomyces cerevisiae diversity study. Antonie van Leeuwenhoek 89,

5 Amplificación de secuencias Delta (δ) PRINCIPIO: Las secuencias Delta son elementos de 0,3 Kb (334 bp) que flanquean los retrotransposones Ty1 en S. cerevisiae. Se han encontrado entre 35 y 55 copias de secuencias delta en el genoma de la levadura como parte de los retrotransposones Ty1 o como elementos aislados. No obstante, estas secuencias delta se concentran en las regiones genómicas que unen los genes del ARNt. El número y la ubicación de estos elementos tienen una cierta variabilidad intraespecífica que Ness et al (1993) usaron para diseñar cebadores específicos: δ 1 y δ 2 útiles para la diferenciación de cepas S. cerevisiae. Legras y Karts (2003) optimizaron esta técnica diseñando dos nuevos cebadores: δ 12 y δ 21, que están situados cerca de δ 1 y δ 2. El uso de δ 12 y δ 21 o de δ 12 con δ 2 revelan un mayor polimorfismo que se ve reflejado en la aparición de un mayor número de bandas en el gel de electroforesis. RESULTADOS: Legras y Karts (2003) distinguieron 53 cepas comerciales con la combinación de δ 12 y δ 21 o δ 12 con δ 2. Schuller et al. (2004) fueron capaces de diferenciar un buen número de cepas de levadura de vinificación usando cebadores δ 12 y δ 2. Ness et al. (1993). Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62: Legras y Karst, Optimisation of interdelta for Saccharomyces cerevisiae strain characterization. FEMS Microbiol. Lett. 221: Schuller et al Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: Genotipado por microsatélites PRINCIPIO: Los microsatélites son secuencias cortas compuestas de repeticiones en tándem de uno a diez nucleótidos. Dichas secuencias se dispersan a lo largo del genoma de la levadura, tanto en regiones codificantes como no codificantes, pero su tasa es menor en regiones codificantes. Los marcadores microsatélites son locus polimórficos cuya diversidad alélica permite diferenciar entre variedades de una misma especie de levadura. Se conocen varios loci que pueden utilizarse para tipificar las cepas de S. cerevisiae (Legras et al. 2005). Los perfiles que se obtienen al combinar al menos seis microsatélites permiten una diferenciación eficiente de cepas de S. cerevisiae. RESULTADOS: Los marcadores microsatélites se utilizan frecuentemente como marcadores genéticos en estudios de mapeo genético y en genética de poblaciones. La combinación de seis loci microsatélites se muestra como una técnica altamente 5

6 discriminante y reproducible y a su vez revela relaciones geográficas y tecnológicas entre cepas. Estos loci polimórficos pueden utilizarse fácilmente para determinar el perfil de cepas de S. cerevisiae durante la fermentación. Schuller et al. (2004). Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231: Legras et al. (2005) Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: Schuller and Casal (2007) The genetic structure of fermentative vineyard-associated Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis. Antonie van Leeuwenhoek 91: MÉTODOS INDEPENDIENTES DEL CULTIVO PCR CUANTITATIVA (qpcr) CAMPO DE ESTUDIO: Detección y cuantificación rápida de levaduras a nivel de especie en mosto o vino PRINCIPIO: Este método se basa en el uso de cebadores universales de levaduras designados en los campos variables D1/D2 del gen ARNr 26S. Se trata de una de las pocas secuencias genéticas disponibles de todas las especies conocidas de ascomicetos. La cuantificación es posible a partir de la determinación del número de ciclos de polimerización necesarios para superar una señal umbral. Cuanto más elevada sea la concentración de ADN de la especie objetivo en la muestra, menor será el número de ciclos necesarios para traspasar el umbral. Las curvas de calibración permiten una cuantificación precisa. RESULTADOS: Esta técnica se ha usado para el recuento de células de Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum y Saccharomyces cerevisiae en fermentaciones mixtas, tanto en medio sintético como en vino. El ensayo es lineal en 5 grados de magnitud, siendo el límite de detección de aproximadamente 10 2 UFC/ml. La presencia de otros microorganismos no diana (levaduras y/o bacterias) en las muestras no afecta significativamente el estudio de la PCR cuantitativa. Se desarrolló un método rápido de PCR cuantitativa para detectar y cuantificar varias levaduras no Saccharomyces, usando cebadores específicos de cada especie para C. zemplinina, T.delbrueckii, I. orientalis, y M. pulcherrima (Zott et al., 2010). 6

7 Hierro, Esteve-Zarzoso, Gonzalez, Mas y Guillamon et al (2006) Real-Time Quantitative PCR (qpcr) and Reverse Transcription-QPCR for Detection and Enumeration of Total Yeasts in Wine. Appl. Environ. Microbiol. 72: Zott K, Claisse O, Lucas P, Coulon J, Lonvaud-Funel A, Masneuf-Pomarede I (2010) Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology 27: Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE) CAMPO DE ESTUDIO: Identificación de levaduras a nivel de especie en mosto o vino PRINCIPIO: Este método se basa en la amplificación del ADNr 26S de la levadura usando cebadores universales U1 (unidos con una abrazadera de GC) y U2. Los fragmentos de amplificación se separan según su longitud y composición nucleótida en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (gradiente de 20 a 60% de urea y formamida). Los fragmentos de amplificación interesantes se pueden escindir directamente del gel y secuenciarlos para identificar las especies microbianas, refiriéndose a la banda de frecuencia ADN 26S de las levaduras. Una de las ventajas es la posibilidad de identificar también levaduras viables pero no cultivables para las cuales el ADN es también amplificable. RESULTADOS: Esta técnica se ha usado para identificar poblaciones microbianas en muestras de uva y de vino de diferentes especies de levadura (Candida diversa, Candida sorboxylosa, Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora occidentalis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia hanoiensis, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Issatchenkia terricola, Kluyveromyces thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii y Zygosaccharomyces bailii). Las poblaciones de levaduras de más de 10 3 células/ml se detectan y se identifican bien mediante PCR-DGGE. La PCR- DGGE no es una herramienta cuantitativa. Cocolin L, Heisey A, y Mills D.A. et al. (2001) Direct Identification of the Indigenous Yeasts in Commercial Wine Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 52:01: