LAS EFICACES TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS LEVADURAS ENOLÓGICAS

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1 LAS EFICACES TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS LEVADURAS ENOLÓGICAS Antonio Palacios*; David Carrillo*; Jesús Iruzubieta*; Stéphane Boutou**; Antoine Fleury**; Dominique Labadie** y Pascal Chatonnet** Introducción: *Excell Ibérica; Calle Planillo Nº 12, Logroño, La Rioja; apalacios@labexcell.com **Excell France; Rue del Golf, Merignac, Francia Uno de los avances clave de la enología moderna es el reconocimiento de la importancia de la levadura como un agente imprescindible para la adecuada obtención de vino. De este reconocimiento nace, de manera inmediata, la necesidad de controlar las propiedades genéticas y metabólicas de las cepas empleadas para las fermentaciones enológicas, así como la de desarrollar sistemas analíticos capaces de distinguir entre las diferentes cepas de levadura, tanto por las cepas inoculadas para ejercer un férreo control biológico de la fermentación como las posibles levaduras contaminantes que pueden arruinar las acciones de las que desarrollan una buena fermentación. Actualmente existen varios métodos de identificación de levaduras de interés enológico. Son técnicas de biología molecular con resultados rápidos, fiables y económicos. Estos métodos se basan esencialmente en el análisis directo del ADN de la levadura; las diferencias entre las propiedades de este DNA se denominan polimorfismo, el cual hace posible su distinción. El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y especies que taxonómicamente están muy próximas, pero que tienen propiedades muy diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas. Además, durante las primeras fases de la fermentación aparecen en el mosto levaduras de los géneros Kloeckera, Candida, Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces o Hansenula, entre otros. La presencia de estas especies puede dar lugar a metabolitos secundarios que modifiquen las propiedades organolépticas del producto final, y, por tanto, es importante disponer de buenos métodos de detección para su control. Finalmente, también es posible utilizar las técnicas de identificación molecular para el análisis y comprobación de la estabilidad genética de las cepas de levadura, un aspecto importante cuando se manejan grandes volúmenes de cultivo, como es el caso de la multiplicación de levaduras seleccionadas en forma de LSA (levadura seca activa). Gracias a estas técnicas, el enólogo o elaborador de vino puede controlar mejor que tipo de cepas de levadura que está utilizando en la bodega en forma de inóculo iniciador, saber si ésta se implanta bien y si en definitiva, amortizar bien su inversión. En el mercado de levaduras enológicas se pueden encontrar ciertas controversias respecto a la cepa que va dentro del envase y darse la situación, que queriendo inocular una 1

2 determinada levadura acorde al estilo de vino a elaborar, se compre otra distinta por confusión intencionada o no. Para evitar esta embarazosa situación, los enólogos deben saber que existen técnicas muy finas de biología molecular que les permiten saber exactamente que cepa de Saccharomyces cerevisiae va dentro del paquete y por su puesto su origen. Se describen a continuación las técnicas disponibles en la actualidad, las cuales permiten con exactitud valorar la identidad genética de la levadura, saber el grado de implantación en bodega y su estabilidad genética, incluso el nivel de expresión génica, que será en definitiva la responsable del resultado final de la transformación del mosto en vino. Métodos clásicos de identificación de levaduras: Tradicionalmente, las levaduras han sido clasificadas e identificadas según sus características morfológicas y sus propiedades fisiológicas y bioquímicas. Entre los criterios morfológicos, se contaba con su reproducción vegetativa, sexual, esporulación, morfología celular, aspecto de colonia, etc. Entre los criterios fisiológicos y bioquímicos, la fermentación y asimilación de azúcares, poder fermentativo, asimilación de nitratos, escisión de la arbutina, etc. Estas técnicas son complejas y en algunos casos pueden llevarnos a clasificaciones e identificaciones incorrectas, ya que se basan principalmente en el estudio del fenotipo y éste depende de las condiciones ambientales del desarrollo y del estado vegetativo o amorfo, lo que puede llevar a duplicar especies, como es el caso de Brettanomyces bruxellensis y Dekkera bruxellensis. Métodos moleculares: identificación a nivel de especie Estas técnicas se basan en la caracterización e identificación de especies utilizando marcadores moleculares, normalmente de ADN, de cada especie o cepa. -. Secuenciación de genes ribosomales: Los genes ribosomales presentan una secuencia bastante conservada a nivel de género y especie en los organismos Eucariotas, por lo que se trata de análisis genéticos muy útiles para establecer relaciones filogenéticas. La técnica consiste en amplificar estas regiones conservadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) y posteriormente secuenciar los fragmentos amplificados. Esta técnica también permite diferenciar especies. -. Análisis de perfiles de restricción de ADNr (RFLP): Esta técnica (Restriction Fragment Length Polymorphisms) consiste en el análisis de perfiles de restricción mediante la comparación de los patrones de restricción de diferentes regiones de la zona ribosomal. Ésta técnica es muy utilizada para la identificación de especies de interés enológico y en estudios ecológicos y de dinámica poblacional. 2

3 Figura 1: detección de secuencias variables en los fragmentos de ADN, (RFLP). -. PCR: Las dos cadenas de ADN se separan y consiste en amplificar una región del genoma por PCR (Polymerase Chain Reaction) y posteriormente estos fragmentos amplificados se someten a una electroforesis en gel de poliacrilamida. Los fragmentos se separan según su tamaño. Esta técnica se emplea en la caracterización e identificación de levaduras y bacterias vínicas, también en estudios de biodiversidad. -. FISH: Se basa en la utilización de unas sondas de ADN o ARN marcados y un fluorocromo (Fluorescente In Situ Hybridization), que son capaces de hibridarse por tener ácidos nucleicos complementarios. Posteriormente a la hibridación, se observan las células marcadas al microscopio de fluorescencia. Es una técnica muy interesante, ya que permite diferenciar especies dentro de una misma muestra, utilizando sondas específicas y diferentes fluorocromos. Permite una buena exactitud en la diferenciación de especies, siendo útil para estudios de diversidad poblacional y detección de levaduras y bacterias alterantes del vino. Figura 2: Identificación de bacterias lácticas y observación al microscopio de fluorescencia. Fotografías tomadas de ww.probes.com. Métodos moleculares: identificación a nivel de cepa A veces no es suficiente con la identificación de especies y es necesario entonces ir más allá. Para poder diferenciar a nivel de cepas, existen otras técnicas de biología molecular: 3

4 -. Cariotipo o separación de cromosomas en PFGE: La separación de cromosomas se presenta como una técnica muy útil para diferenciar especies y también a nivel de cepas. Las diferentes cepas de una misma especie presentan una gran variabilidad en número y tamaño de cromosomas, presentando cariotipos diferentes. Este polimorfismo cromosómico se origina durante la reproducción. La técnica se basa en la separación de cromosomas en electroforesis de campos pulsados (Pulsed Field Gel Electrophoresis) que provoca una reorientación molecular del ADN, que es diferente dependiendo del tamaño molecular. Con esta técnica se pueden realizar análisis de implantación de levaduras inoculadas en bodega, que normalmente se hacen mediante PCR por ser rápida y mas económica, pero en caso de incertidumbre, esta técnica es complementaria. También se emplea en los programas de selección de levaduras enológicas de cepas Saccharomyces cerevisiae. Figura 3: separación de cromosomas sobre gel de agarosa por campos pulsados, (PFGE). -. Análisis de restricción del ADN mitocondrial: El ADNmt de la levadura Saccharomyces cerevisiae es una pequeña molécula con variabilidad dentro de la especie, así que puede ser utilizada para diferenciar cepas. Necesita un trabajo previo de extracción del ADNmt mediante la obtención de protoplastos y purificación del material genético, aunque existen técnicas más avanzadas que han simplificado el método mediante digestión total del ADN y utilización de enzimas de restricción que cortan más el ADN nuclear que el mitocondrial (Querol et al. 1992). Esta técnica permite diferenciar cepas no solo en el género Saccharomyces, si no que también lo consigue con otras levaduras de interés enológico, como por ejemplo Brettanomyces o Zygosaccharomyces. Figura 4: Digestión de fragmentos de ADN mitocondrial y separación sobre gel de agarosa. 4

5 -. RAPD-PCR: La técnica RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic ADN-PCR) consiste en amplificar al azar secuencias mediante la utilización de oligonucleótidos cortos de secuencia arbitraria. Estos oligonucleótidos hibridan de manera inespecífica y aleatoria a diferentes lugares del genoma, lo que permite la amplificación de fragmentos polimórficos de ADN. Para cada cepa se obtiene un número determinado de amplificaciones de diferente tamaño, lo que permite diferenciación entre cepas. La gran ventaja de esta técnica, es que no es necesario información previa de ninguna secuencia determinada y el principal inconveniente, es la reproducibilidad de resultados. Se utiliza esta técnica en estudios de implantación de cepas Saccharomyces cerevisiae, para estudios taxonómicos del grupo Saccharomyces y también para la caracterización de estirpes no-saccharomyces. Figura 5: amplificación aleatoria de segmentos de ADN y separación de los segmentos de tamaños diferentes en gel de agarosa, RAPD-PCR. -. Microsatélites: Los microsatélites son repeticiones en serie de secuencias cortas. Estas repeticiones están distribuidas a lo largo del genoma y son altamente variables entre especies. Este elevado polimorfismo hace que los microsatélites sean unos buenos marcadores moleculares para la identificación intra e ínter específico. La variabilidad de estas secuencias es detectada mediante la amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos específicos. Se obtienen entonces perfiles de amplificación que permiten distinguir cepas de una misma especie. Figura 6: amplificación de secuencias de ADN repetidas (microsatélites). Foto cedida por Dorit Schuller de la Universidad de Minho, (Portugal). 5

6 -. Secuencias delta (δ): Estos elementos son secuencias de 330 pares de base que están distribuidos de manera frecuente en el genoma de las levaduras. La técnica se basa en la utilización de cebadores específicos a estos elementos delta (δ) para amplificar las secuencias comprendidas entre estos elementos. Los elementos delta (δ) no están presentes en levaduras no-saccharomyces, por lo tanto esta técnica es limitada para Saccharomyces cerevisiae. -. AFLP: La técnica AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) se basa en la amplificación selectiva mediante PCR de los fragmentos de restricción de la digestión total de ADN. La detección de polimorfismo se observa en un gel de poliacrilamida a través de electroforesis capilar. Es una técnica muy sensible y reproducible, pero requiere alta inversión y personal especializado, por lo que no es muy utilizada en enología. Figura 7: Digestión d ADN en fragmentos y amplificación selectiva de ciertos fragmentos. Foto cedida por la Universidad de LLN (Bélgica). -. Microarrays: La técnica de análisis del ADN mediante la utilización de microarrays, ha revolucionado la investigación y el desarrollo de estudios genómicos. La premia básica de los microarrays de ADN es que las muestras de ARN o otros fragmentos de ADN estén hibridados a regiones conocidas de oligonucleótidos de ADNc en los arrays. Gracias a la alta densidad de los modernos microarrays, se puede medir el nivel de expresión de genes funcionales. Se utilizan mucho en estudios de expresión de estrés en Saccharomyces cerevisiae y permite determinar la función celular de los genes. Figura 8: Medida de expresión génica mediante microarrays. 6

7 -. PCR a tiempo real: La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase Caín reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología, como se ha visto antes, se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer"). La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes, como son que no es una técnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de obtener falsos positivos por contaminación. Para solventar este último problema se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en la localización correcta y realizar una adecuada manipulación de los reactivos. Por otra parte para solventar el problema de la cuantificación se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real. Figura 9: Curvas de calibración efectuada para cada tipo de micro-organismo diana que permite cuantificar precisamente la cantidad de células presentes. La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta 7

8 fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Ejemplos prácticos de diferenciación genética entre cepas comerciales: Vamos a exponer dos ejemplos ilustrativos de cómo diferenciar bien distintas cepas comerciales de la especie Saccharomyces cerevisiae y de cómo resolver problemas en la diferenciación de cepas, que pueden parecer similares con ciertas técnicas y no lo son. Uno de ellos sirve para diferenciar 3 cepas comerciales que pueden parecer idénticas mediante la técnica de PCR y el otro, diferenciando cepas dentro de Saccharomyces cerevisiae variedad bayanus. Dentro de esta raza fisiológica, la diferenciación suele ser más complicada, siendo necesario realizar varias técnicas en combinación para distinguirlas sin problemas. Normalmente, la técnica de PCR es suficiente para distinguir la gran mayoría de levaduras comerciales, pero algunas de ellas necesitan técnicas complementarias para resolver su definitiva distinción, como se verá más adelante. Ejemplo Saccharomyces cerevisiae: Las cepas denominadas 1, 2 y 3 no son diferenciables por métodos de RAPD-PCR, por lo que se podría decir que las 3 cepas son idénticas. Como se observa en la figura 9, los perfiles denominados como a) son iguales. Sin embargo, analizando las mismas cepas mediante el método denominado PFGE con unas condiciones electroforéticas de 60s-60s durante 15h seguido de 90s-90s por 9h a 6V/cm. En el apartado b) observamos que en esta condiciones, la cepa 1 es fácilmente diferenciable de las otras dos cepas, mostrando que en realidad se trata de una cepa distinta, aunque perteneciente a la misma especie de Saccharomyces cerevisiae. Con esté método, las cepas 2 y 3 no son todavía diferenciables. Pero cuando se aplica el método RFLP con las enzimas de restricción EcoRI, SalI, PstI y la sonda Ty, se puede demostrar fácilmente que la cepa 2 es diferente de la cepa 1 y de la cepa 3, como se deduce del análisis de los perfiles mostrados en los geles de los apartados c), d) y e). 8

9 Figura 10: a) Identificación de 3 cepas mediante PCR (RAPD) con primers específicos de secuencias de los elementos delta (δ). (1- cepa A, 2- cepa B, 3- cepa C y 4-Ladder 100 bp). b) Identificación de las 3 cepas mediante PFGE (CHEF). (1- Ladder, 2- cepa A, 3- cepa B y 4- cepa C). c) Identificación de las 3 cepas mediante RFLP con la enzima SalI, (1- Ladder, 2- cepa A, 3- cepa B, 4- cepa C). d) igual que c) pero con la enzima PstI y e) igual que c pero con la enzima EcoRI.. a) b) c) d) e) Ejemplo Saccharomyces cerevisisiae variedad bayanus En este caso, se comparan los perfiles genéticos de 7 cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae variedad bayanus. Los perfiles que se obtienen de estas levaduras con métodos de RAPD-PCR no muestran diferencias entre ellas. Sin embargo cuando las mismas cepas son estudiadas utilizando el método PFGE (figura 10), las diferencias se hacen visibles, distinguiéndose claramente sus perfiles. Figura 11: Perfiles por PFGE de 7 cepas de levadura diferentes de la especie Saccharomyces cerevisiae, variedad bayanus. A B C D E F G 9

10 Diferenciación de levaduras a nivel del fenotipo: Llegados a este punto, es necesario entonces explicar que el comportamiento en bodega de un microorganismo no depende solo de su estructura genética. Las condiciones de vinificación y el estado fisiológico de la levadura van a condicionar la respuesta genética en situaciones determinadas, como es la capacidad de respuesta al estrés, que en un proceso de fermentación alcohólica, el nivel es elevado y la levadura necesita estar bien provista metabólicamente para funcionar de forma correcta y cumplir así con sus expectativas de elaboración de un vino en particular. Un ejemplo de ello es la cantidad de glucógeno y trealosa celular, muy importante en relación a la capacidad de conseguir una óptima respuesta de la levadura después de su rehidratación (Novo et al. 2007). Dos cepas de levadura que comparten la misma carga genética, van a comportarse de forma diferente cuando son inoculadas en un mosto a baja temperatura después de la rehidratación y la cepa que mas trealosa y glucógeno tenga a nivel citoplasmático, resolverá mejor su adaptación al tener mayor material energético y a pesar de tener la misma carga genética de respuesta al estrés térmico. Entonces, de cara a la elaboración de un determinado estilo de vino, no solo es importante la carga genética de una cepa en particular, si no que también depende de la tecnología empleada en su producción de biomasa, las condiciones de crecimiento y secado y conservación. Así entonces, la estabilidad genética, la viabilidad celular, estado fisiológico, contenido en nutrientes, trealosa y glucógeno, nivel de contaminación microbiológica y la constitución lipídica de membrana, son factores determinantes que influyen en los procesos bioquímicos de la fermentación alcohólica. Por tanto, también son determinantes en la definición del resultado final cualitativo del vino. Conclusiones: 1. Existen en la actualidad técnicas de biología molecular lo suficientemente precisas y finas como para conseguir una buena diferenciación entre las levaduras Saccharomyces y no-saccharomyces, no solamente a nivel de especie, sino que algunas de ellas conducen a la diferenciación clonal. 2. Estas técnicas permiten entonces llevar a cabo estudios de dinámica poblacional y de biodiversidad, expresión génica de cada cepa, estudios de estabilidad genética, control de calidad en la producción industrial de levaduras seleccionadas. En bodega permiten realizar análisis de implantación de levaduras inoculadas y son concluyentes para distinguir bien cepas comerciales las unas de las otras. 3. Son herramientas que poco a poco se van introduciendo en la industria enológica por la gran información que proporcionan y van a permitir al enólogo y productor de vino una clarificación muy oportuna y esperada del mercado de levaduras enológicas. 10

11 4. La tecnología empleada en la producción de las levaduras enológicas y su estado fisiológico en el momento de su utilización condicionan la expresión génica, lo que hace posible que dos levaduras idénticas a nivel genético, se comporten de forma diferente según su capacidad de respuesta metabólica. Nada nuevo en realidad, el genotipo es independiente de las condiciones del medio, pero el fenotipo no. Este es totalmente dependiente de los recursos celulares disponibles en un momento determinado y de las condiciones medioambientales donde debe desarrollarse como ser vivo con capacidad de adaptación. Bibliografía: -. Carro, D.; Piña, B.; (2007). Identificación de cepas de levadura de interés enológico. ACE Revista de Enología. Nº Hierro, N.; (2007). Tesis Doctoral: Quantificaió, identificació i tipificació de llevats vínics mitjançant l ús de diferents tècniques moleculars. Universitat Rovira i Virgili, Tarragona. -. Guillamon, J.M., Sabaté, J., Barruio, E., Cano. J.; Querol, A. (1998). Rapid identification of wine yeast species based on RLFP analyses of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Arch. Microbiol. 169, Querol, A.; Barrio, E.; (1990). A rapad and simple method for the preparation of yeast mitochondrial DAN. Nucleic Acids Res. 18, Querol, A., Barrio E., Ramón D.; (1992). A comparative study of different methods of yeast strain characterization. System Appl. Microbiol.; 15: Novo, M.T.; Beltran, G.; Torija, M.J.; Poblet,; Rozes, N. y Guillamon, J.M.; Mas, A.; (2007). Changes in wine yeast storage carbohydrate levels during preadaptation, rehydration and low temperature fermentations. INIST-CNRS. -. Zuzuarregui, A.; (2005). Tesis Doctoral: Caracterización fisiológica y molecular de cepas vínicas de Saccharomyces sp. Influencia en su comportamiento durante la vinificación. IATA Valencia. 11