PROYECTO No.: RM C Dra. M.LL. Palop Herreros (UCLM) Dr. P.M. Izquierdo Cañas (IVICAM)

Transcripción

1 BIODIVERSIDAD DE LA MICROBIOTA LÁCTICA PRESENTE EN LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA DE VINOS TINTOS CENCIBEL ELABORADOS EN CASTILLA-LA MANCHA EN DOS VENDIMIAS CONSECUTIVAS PROYECTO No.: RM C02-00 Dra. M.LL. Palop Herreros (UCLM) Dr. P.M. Izquierdo Cañas (IVICAM)

2 INTRODUCCIÓN FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Leuconostoc Pediococcus bacterias lácticas ácido málico ácido láctico y CO 2 Oenococcus Lactobacillus

3 Efectos en el vino: INTRODUCCIÓN FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Disminución de la acidez total (desaparición del ác. málico) Aumento de la acidez volátil (degradación del ác. cítrico) Modificación del aroma Mejora del sabor Mayor estabilidad biológica Ventajas: FML espontánea FML dirigida Mejor control del proceso Menor tiempo Evita alteraciones organolépticas Permite la obtención de un producto con características organolépticas

4 INTRODUCCIÓN Selección de un cultivo iniciador: etapas Estudio de la biodiversidad de la microbiota que participa en los procesos espontáneos 1) Caracterización genética: genotipado 2) Identificación de especies Caracterización tecnológica de las cepas predominantes Estudio de la capacidad de implantación

5 INTRODUCCIÓN Objetivos: 1. Caracterización molecular de la microbiota láctica presente en la FML de vinos tintos Cencibel elaborados en CLM. 2. Estudio de la diversidad genética de las especies de bacterias lácticas presentes en distintas bodegas y en dos vendimias consecutivas. 3. La creación de un banco de cepas de bacterias lácticas autóctonas potencialmente utilizables en procesos industriales.

6 METODOLOGÍA Toma de muestras 6 Bodegas E-Casarrubios del Monte D-Noblejas B-Tomelloso E-Pozoamargo 2 Elaboraciones C-Villarrubia de los Ojos A- Villarrobledo 3 Momentos del proceso (T0, T1 y T2) 2 Vendimias

7 Identificación 16S-ARDRA METODOLOGÍA Análisis físico-químicos convencionales Análisis microbiológicos: Recuentos de bacterias lácticas Obtención de aislados de bacterias lácticas Purificación Genotipado RAPD-PCR REA-PFGE DD-PCR

8 RESULTADOS Análisis físico-químicos vinos 1ª vendimia 0,0 0,24 0,00 0,26 0,26 0,28 0,00 0,22 0,00 0,33 0,00 0,09 Cítrico (g/l) 0,5 0,43 0,52 0,45 0,37 0,34 0,44 0,30 0,37 0,22 0,29 0,21 Acidez volátil (g/l) 1,3 0,76 1,77 0,44 1,60 0,22 1,70 0,21 1,96 0,33 1,46 0,19 L-láctico (g/l) 0,2 1,27 0,17 1,78 0,21 2,20 0,22 2,31 0,00 2,20 0,00 2,16 L-málico (g/l) 3,7 3,71 4,03 3,88 3,67 3,56 3,96 3,56 3,90 3,56 3,84 3,47 ph 14,10 13,84 14,43 13,85 13,22 13,12 Etanol (% v/v) b a b a b a b a b a b a Elaboración C B A Bodega 0,00 0,21 0,00 0,38 0,22 0,36 0,08 0,35 0,00 0,31 0,16 0,32 Cítrico (g/l) 0,52 0,35 0,52 0,25 0,38 0,32 0,48 0,28 0,27 0,20 0,39 0,28 Acidez volátil (g/l) 1,86 0,32 1,96 0,48 1,80 0,31 1,79 0,37 1,14 0,14 1,07 0,15 L-láctico (g/l) 0,18 2,31 0,19 2,42 0,27 1,54 0,26 1,88 0,34 1,94 0,13 1,85 L-málico (g/l) 4,08 3,74 4,07 3,75 3,89 3,49 3,81 3,47 3,51 3,37 3,60 3,47 ph 14,02 13,99 13,21 12,94 14,26 13,82 Etanol (% v/v) b a b a b a b a b a b a Elaboración F E D Bodega

9 RESULTADOS Recuentos de bacterias lácticas vinos 1ª vendimia Recuentos (ufc/ml) Etapas Número Bodegas Elaboración Duración FML aislados A ,87E+04 3,70E+06 1,61E ,80E+05 6,60E+06 3,12E B ,20E+04 2,90E+06 1,96E ,60E+02 2,45E+05 1,80E C ,07E+06 9,00E+06 1,42E ,36E+05 1,65E+07 2,36E D ,10E+02 4,45E+05 4,28E ,02E+05 1,69E+06 2,00E E ,50E+02 3,60E+05 4,32E ,26E+03 5,15E+06 1,52E F ,38E+04 1,10E+06 1,71E ,30E+06 2,47E+07 1,69E Total aislados 339

10 METODOLOGÍA Ramdomly Amplified Polymorphic DNA - PCR (RAPD-PCR) Aislados de bacterias lácticas Obtención ADN Mezcla de Reacción PCR Amplificación en termociclador Carga en gel M ºC M-14 Electroforesis productos amplificados Digitalización de perfiles Análisis Cluster

11 METODOLOGÍA estriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE) Agarosa Células Cultivo Obtención de insertos Lisis celular Digestión enzimática ApaI SfiI Análisis Cluster PFGE de los fragmentos de restricción Digitalización de perfiles

12 METODOLOGÍA Estudios de reproducibilidad 6 aislados 6 X siembras Productos amplificados Fragmentos restricción Valor de similitud Análisis Cluster 2 perfiles GEL 1 2 perfiles GEL 2 Dendrograma de similitud

13 Isolates of cellar B (70) RESULTADOS Selección del método de genotipado M13 RAPD-PCR ApaI REA-PFGE R1/11 R2/1 R3/1 R4/4 R5/1 R6/18 P1/9 P2/1 P3/1 P4/1 P5/1 P6/6 P7/1 R7/6 R8/1 R9/1 R10/3 R11/8 R12/2 R13/1 R14/1 R15/1 R16/1 R17/1 R18/1 R19/1 R20/1 R21/5 P8/27 P9/12 P10/6 P11/1 P12/4

14 RESULTADOS M13 RAPD-PCR ApaI REA-PFGE Similarity (%) Genotype/No. isolates Similarity (%) Genotype/No. isolates R1/4 R2/1 R3/1 R4/1 R5/2 R6/2 R7/4 R8/9 R9/1 R10/1 R11/1 R12/1 R13/1 R14/4 R15/1 R16/14 R17/1 R18/1 R19/9 R20/1 P1/17 P2/11 P3/7 P4/5 P5/4 P6/1 P7/1 P8/8 P9/5 P10/1 82% 83% Isolates of cellar D (60)

15 RESULTADOS Dendrograma consenso RAPD-PCR/REA-PFGE C1/2 C2/1 C3/1 C4/2 C5/1 C6/1 C7/1 C8/4 C9/1 C10/4 C11/4 C12/5 C13/1 C14/4 C15/1 C16/2 C17/2 C18/1 C19/1 C20/2 C21/1 C22/1 C23/2 C24/4 C25/1 C26/4 C27/1 C28/1 C29/1 C30/1 C31/2 Dendrograma consenso obtenido para los aislados de la bodega D combinando los perfiles M13 RAPD-PCR and ApaI PFGE

16 METODOLOGÍA Differential Display PCR (DD-PCR) Cultivo Obtención ARN Transcripción inversa ARNm-ADNc Mezcla de Reacción PCR M-13 Amplificación en termociclador 55 ºC Carga en gel Análisis Cluster Electroforesis productos amplificados Digitalización de perfiles

17 RESULTADOS DD-PCR bp M13 DD-PCR patterns. Lane 1, molecular size marker (100 bp ladder,biotools). Lane 2, D12L10(1) isolate, Lane 3, D12L10(2) isolate, Lane 4, D21L4(1) isolate, Lane 5, D21L4(2) isolate, Lane 6, D22L5(1) isolate, Lane 7, D22L5(2) isolate

18 RESULTADOS Los resultados de este primer estudio permitieron concluir que: La discriminación alcanzada con la RAPD-PCR y el cebador M13 era superior a la alcanzada con la REA- PFGE y el enzima ApaI. La Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD- PCR) es una técnica adecuada tanto por su capacidad de discriminación intraespecífica, como por su sencillez metodológica. La DD-PCR resultó ser una técnica con escasa reproducibilidad y fue por ello descartada su utilización.

19 RESULTADOS Genotipos obtenidos en cada una de las bodegas Bodega Elaboración No. aislados No. genotipos A B C D E F Total

20 METODOLOGÍA: Identificación de genotipos 16S - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (16S-ARDRA) Aislados de bacterias lácticas Obtención ADN Mezcla de Reacción PCR pa / ph Amplificación en termociclador 56 ºC Restricción del amplificado MseI Electroforesis fragmentos de restricción

21 RESULTADOS Identificación de genotipos 16S-ARDRA bp MseI Líneas 2 y 4-14 son O. oeni y la línea 3 es un aislado no-oenococcus

22 RESULTADOS Identificación de genotipos 92.3% de los aislados pertenecían a la especie Oenococcus oeni Sólo 26 aislados fueron no-oenococcus Ocurrence of the different species (%) L. casei L. plantarum L. hilgardii Lc. mesenteroides 2 0 A B C D E F Cellar Porcentaje de especies no-oenococcus presentes en cada bodega

23 RESULTADOS

24 RESULTADOS Frequency of isolation (%) of the 33 major genotypes of O. oeni

25 RESULTADOS Recuentos de bacterias lácticas vinos 2ª vendimia Winery Batch MLF duration (days) Stages No. of isolates No. of genotypes A I x x x II x x x B I x x x II x x x C I x x x II x x x D I x x x II x x x E I x x x II x x x

26 RESULTADOS Identificación de genotipos 94.1% de los aislados pertenecían a la especie Oenococcus oeni Sólo 21 aislados fueron no-oenococcus Ocurrence of the different species (%) A B C D E Cellar L. plantarum Lc. mesenteroides Porcentaje de especies no-oenococcus presentes en cada bodega

27 RESULTADOS Dendrograma de similitud de los aislados de la bodega C procedentes de ambas vendimias

28 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Genotipos de O. oeni presentes en cada etapa de la FML, en cada bodega y en ambas vendimias % = (nº aislados de cada genotipo / nº total de aislados) x 100 Vendimia 1 Vendimia 2 Vendimia 1 Vendimia 2 Vendimia 1 Vendimia 2 Vendimia 1 Vendimia 2 Vendimia 1 Vendimia 2

29 RESULTADOS 1. Cuando se realizó el análisis cluster de los patterns de los aislados de todos las bodegas y de ambas vendimias de obtuvo un gran dendrograma, en el que pudieron diferenciarse 60 clusters diferentes de estos incluían aislados de diferentes bodegas 3. El genotipo XVII estuvo presente en todas las bodegas y el XXIII estuvo presente en al menos una de las elaboraciones en todas las bodegas.

30 RESULTADOS % = (no. of isolates of each genotype / total no. of isolates) Winery A Winery B Stage Stage Stage Stage 2006 vintage 2007 vintage 2006 vintage 2007 vintage Vintage 1 Vintage 2 Vintage 1 Vintage 2 Winery C Winery D Stage Stage Stage Stage Vintage 2006 vintage 1 Vintage 2007 vintage Vintage vintage Vintage vintage Winery E Stage Stage 2006 vintage 2007 vintage Vintage 1 Vintage 2 Genotypes VII XI XIII XIV XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXVI XXVII XXIX XXXVI XXXVII XXXVIII XL XLVI LI LIII * Frequency of isolation of the genotypes of O. oeni (%) at each stage of MLF at both vintages. Genotypes with a percent of participation lower than 10% have been grouped.

31 CONCLUSIONES 1. O. oeni es la especie predominante en la FML de los vinos de la variedad Cencibel si bien también han podido identificarse, aunque en baja proporción, las especies: L. casei, L. plantarum, L. hilgardii y Lc. mesenteroides. 2. La caracterización genética de un gran número de aislados procedentes de diferentes bodegas de la región de Castilla-La Mancha usando RAPD-PCR ha puesto de manifiesto la existencia de un gran polimorfismo entre la microbiota láctica presente en la FML. 3. La presencia de genotipos coincidentes en muestras tomadas en diferentes vendimias y procedentes de bodegas situadas en diferentes provincias de la región, sugiere una distribución geográfica de las cepas de O. oeni que crecen espontáneamente en el vino y confirma la existencia de una microbiota bien adaptada no sólo a las condiciones de elaboración utilizadas en la bodega, sino también a las condiciones ecológicas de esta región.

32 CONCLUSIONES 4. La permanencia de algunas cepas de O. oeni en todas las bodegas y en las dos vendimias analizadas, hace pensar en su idoneidad para un uso industrial y fue el criterio utilizado en la selección de aquellas que iban a ser utilizadas en el estudio de caracterización tecnológica. 5. La caracterización tecnológica de los aislados seleccionados tras la caracterización genética ha permitido obtener una cepa con excelentes propiedades para ser utilizada a escala industrial, habiéndose iniciado por ello el proceso para su patente. A estos efectos la cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) como O. oeni Este estudio ha permitido la creación de una banco de cepas potencialmente utilizables en procesos industriales y con las que actualmente se lleva a cabo un estudio de caracterización enzimática.

33 METODOLOGÍA PCR - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) Muestra de vino Extracción ADN con kit Mezcla de Reacción PCR Amplificación en termociclador Mezcla de Reacción PCR W01 / W ºC HDA-GC / HDA2 rpob1 / rpob10 / rpob2 Amplificación en termociclador 58 ºC Electroforesis en geles de poliacrilamida Clonaje y secuenciación del ADN

34 RESULTADOS PCR-DGGE

35 CONCLUSIONES 1. El análisis PCR-DGGE aporta una información diferente de las especies de bacterias presentes en el vino, aunque no proporciona una información completa, lo que sugiere que 2. un estudio polifásico combinando ambos métodos, RAPD-PCR y PCR- DGGE, sería una solución interesante para alcanzar un mejor conocimiento de la ecología microbiana de un ecosistema complejo como es el vino.

36 INFORMACIÓN CIENTÍFICA GENERADA 1. Artículos científicos 1.1. Revistas internacionales de impacto (6+2) Ruiz, P., Izquierdo, P.M., Seseña, S. y Palop, M.Ll Intraspecific genetic diversity of lactic acid bacteria from malolactic fermentation of Cencibel wines as derived from combined analysis of RAPD-PCR and PFGE patterns. Food Microbiol. 25, Izquierdo Cañas, P. M.; García Romero, E.; Gómez Alonso S.; Fernández González, M.; Palop Herreros, M. LL. (2008). Amino acids and biogenic amines during spontaneous malolactic fermentation in Cencibel red wines. J. Food Composition and Analysis 21, Izquierdo, P.M., Ruiz, P., Seseña, S. y Palop, M.Ll Ecological study of lactic acid microbiota isolated from Tempranillo wines of Castilla-La Mancha. J. Biosci. Bioeng. 108, Izquierdo, P.M., Gómez, S., Ruiz, P., Seseña, S., García, E. y Palop, M.Ll Biogenic amine production by Oenococcus oeni isolates from malolactic fermentation of Tempranillo wine. J. Food Protect. 72,

37 INFORMACIÓN CIENTÍFICA GENERADA 1.1. Revistas internacionales de impacto (cont.) Ruiz, P., Izquierdo, P.M., Seseña, S. y Palop, M.Ll Analysis of lactic acid bacteria populations during spontaneous malolactic fermentation of Tempranillo wines at five wineries during two consecutive vintages. Food Control 21, Ruiz, P., Izquierdo, P.M., Seseña, S. y Palop, M.Ll Selection of autochthonous Oenococcus oeni strains according to their oenological properties and vinification results. Int. J. Food Microbiol. DOI information: /j.ijfoodmicro Ruiz, P., Seseña, S., Izquierdo, P.M. y Palop, M.Ll. Bacterial biodiversity and dynamics during malolactic fermentation of Tempranillo wines as determined by a culture-independent method (PCR-DGGE). Appl. Microbiol. Biotechnol. (En revisión). Ruiz, P., Izquierdo, P.M., Seseña, S. y Palop, M. Ll. Colonizing ability of a selected autochthonous strain of Oenococcus oeni (En preparación) Artículos de divulgación Izquierdo, P.M., Seseña, S., Ruiz, P. y Palop M.Ll Producción de acidez volátil y degradación de ácido cítrico por cepas de Oenococcus oeni aisladas de la fermentación maloláctica espontánea de vinos Cencibel elaborados en Castilla-

38 INFORMACIÓN CIENTÍFICA GENERADA 2. Comunicaciones presentadas en Congresos Nacionales e Internacionales Pósters Ruiz, P., Seseña, S., Izquierdo, P. M. y Palop, M. L l Genetic diversity of lactic microflora isolated from malolactic fermentation of Cencibel wines elaborated in two vintages in a cellar of Castilla-la Mancha. VIII Symposium international d Oenologie. Bourdeaxu, de Junio. Ruiz, P., Izquierdo, P. M., Seseña, S., Palop, M. L l Ecological study of lactic microbiota isolated from malolactic fermentation of Cencibel wines from cellars of Castilla-La Mancha. XXXI Congreso Mundial de la Viña y el Vino. Verona de Junio. Comunicación oral Seseña, S., Ruiz, P., Izquierdo, P. M., Palop, M. LL Estudio de la implantación de cepas de Oenococcus oeni aisladas de la fermentación maloláctica de vinos Cencibel. XVI Congreso Nacional de Microbiología de los Alimentos. Córdoba de Septiembre

39 INFORMACIÓN CIENTÍFICA GENERADA 3. Tesis Doctorales Titulo: Biodiversidad de la microbiota láctica presente en la fermentación maloláctica de vinos tintos de la variedad Cencibel: Caracterización molecular y tecnológica para la selección de cepas. Doctoranda: Patricia Ruiz Fecha prevista de defensa: Enero 2010