ES A1 C12Q 1/68 ( ) OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA. 11 Número de publicación:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl.: C12Q 1/68 (06.01) 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Fecha de publicación de la solicitud: Solicitante/s: Consejo Superior de Investigaciones Científicas c/ Serrano, Madrid, ES 72 Inventor/es: Zimmermann, Johannes; González Grau, Juan Miguel y Sáiz Jiménez, Cesáreo 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: Agente: No consta 4 Título: Oligonucleótidos dirigidos al gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias y su utilización. 7 Resumen: Oligonucleótidos dirigidos al gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias y su utilización. La detección rápida de bacterias es esencial para determinar su papel en los distintos procesos, tanto de organismos beneficiosos como perjudiciales. El objeto de esta invención es el diseño de secuencias características que permiten identificar las Acidobacterias y los subgrupos a los que pertenecen de forma rápida y eficaz. La identificación de esta división bacteriana se ha llevado a cabo en base a secuencias previamente desconocidas del gen 23S del RNA ribosómico de Acidobacterias. Esos oligonucleótidos pueden ser utilizados para preparar cebadores (primers) para su uso en reacciones de amplificación de ADN, como sondas de ácidos nucleicos, o para su uso en arrays de ADN/ARN. La detección de las Acidobacterias y la diferenciación de sus subgrupos es de aplicación en muestras de diversos tipos, preferentemente, en muestras ambientales, biológicas y/o médicas. ES A1 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Oligonucleótidos dirigidos al gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias y su utilización Sector de la técnica El sector principal de aplicación es la biotecnología en aquellos campos que requieran la detección de Acidobacterias tanto cultivadas como no cultivadas. Entre los campos de aplicación figuran la conservación de obras y objetos de arte, estudios biogeoquímicos y trabajos in situ sobre cualquier tipo de muestras. Estado de la técnica Hoy en día, los microorganismos pueden ser identificados sin necesidad de ser cultivados utilizando técnicas moleculares como la amplificación por PCR ( Polymerase Chain Reaction ) y secuenciación, Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) o hibridación in situ con sondas de ADN marcadas fluorescentemente, o con el empleo de microarrays de ADN. Estas técnicas requieren el uso de oligonucleótidos o sondas específicas diseñadas para detectar genes determinados. Uno de los genes o fragmentos de ADN más utilizados con este fin es el del ARN ribosómico 16S ya que el número de copias por célula de este gen es más elevado que el de otras secuencias. Los procedimientos de PCR y FISH son habituales en laboratorios de biología molecular. Ambos requieren el uso de oligonucleótidos que constan de una secuencia de unos 1- nucleótidos de longitud. En el caso de sondas de ADN, estos oligonucleótidos son marcados, generalmente, en su lado terminal con un colorante fluorescente o radioisótopos. Estos oligonucleótidos, también llamados primers o cebadores, en la reacción PCR sirven para amplificar el gen o fragmento de ADN de interés. Una reacción positiva indicaría la presencia de microorganismos del tipo buscado. El procedimiento FISH permite una rápida detección con la utilización de sondas de ADN marcadas fluorescentemente, permitiendo la rápida detección de células determinadas in situ (De Long et al. 1989). El uso de microarrays se está extendiendo en los últimos años ya que permite la utilización de numerosos oligonucleótidos simultáneamente dirigidos a la detección de diversos grupos microbianos o genes sobre un mismo portaobjetos o membrana (Peplies et al. 03). Estas técnicas constituyen los métodos más importantes que tenemos disponibles hoy en día para la detección de microorganismos no cultivables en ambientes naturales (Amann et al. 01) y en muestras médicas (Moter y Gbbel 00). Se han publicado muchos primers generales para microorganismos y para algunos grupos específicos así como sondas oligonucleotídicas para el rrna (Loy et al. 03). Las Acidobacterias constituyen una División bacteriana hasta hoy constituida por tan solo tres especies cultivadas Acidobacterium, Holophaga y Geothrix. Sin embargo, recientemente, se ha descubierto la existencia de mayor número de Acidobacterias utilizando métodos moleculares basados en secuencias del gen 16S rrna obtenidas por PCR. Se sabe que las Acidobacterias constituyen una fracción altamente significativa de la comunidad microbiana presente en suelos y monumentos, pueden alcanzar el 2% de presencia en muestras de cuevas, por ejemplo. Su papel en la biogeoquímica de estos ecosistemas, dada su elevada presencia, es sin duda de gran importancia. Esta abundancia justifica la necesidad de conocer con mayor detalle dichas acidobacterias para lo cual es preciso su previa identificación. Dado el interés por descubrir y comprender el papel de las Acidobacterias y sus implicaciones en los ecosistemas donde se desarrollan, se hace necesaria la existencia de una metodología capaz de detectar estos microorganismos de la manera más fiable y precisa posible. Las Acidobacterias descubiertas hasta ahora, mediante técnicas moleculares basadas en los genes de ARN ribosómico 16S, han sido clasificadas en ocho (8) subgrupos (Hugenholtz et al. 1998), siendo los correspondientes a las especies cultivadas los subgrupos número 1 y 8. Estos 8 subgrupos pueden caracterizarse en el gen ARN ribosómico 16S por las siguientes secuencias, con los números de acceso dados (GenBank, subgrupo 1, D26171; subgrupo 3, AF0131; subgrupo 4-I, U68644; subgrupo 4-II, AF013; subgrupo 4-III, AF013; subgrupo, Z9707; subgrupo 6, Z9733; subgrupo 7-I, Z9729; subgrupo 7-II, Z9713; subgrupo 8, U4163. Trabajos posteriores llevados a cabo por nuestro grupo (con 16S y 23S) han dado lugar al descubrimiento de nuevas secuencias que al ser clasificadas en base a su distancia filogenética no pertenecen a ninguno de los 8 subgrupos diferenciados con el 16S, indicando la existencia de nuevos subgrupos distintos. El gen de ARN ribosómico 23S es de mayor longitud (unas 00 bases) que el ARN ribosómico 16S (unas 0 bases). Tanto el gen 16S como el 23S de ARN ribosómico se encuentran en todas las bacterias y ambos reflejan fielmente la filogenia microbiana. El gen de ARN ribosómico 23S presenta zonas con gran variabilidad entre microorganismos distintos mientras que las diferencias encontradas entre genes ARN ribosómicos 16S son menores debido a su menor tamaño. El gen 23S ARN ribosómico ofrece por tanto más posibilidades para la diferenciación de microorganismos distintos y mayores opciones para el diseño de oligonucleotidos específicos para la detección de microorganismos determinados y, concretamente, para el análisis de la diversidad microbiana. En contrapartida, el trabajo de secuencia- 2

3 ción del 16S es más fácil que el del 23S por ser aquel más corto y esta es la razón por la que hasta el momento el gen ARN ribosómico 16S sea el gen más utilizado. En la presente invención se han diseñado primers y sondas que permiten la detección del gen ARN ribosómico 23S de las Acidobacterias. Referencias Amann R, Fuchs BM, Behrens S. 01. The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridisation. Curr Opin Biotechnol 12: DeLong EF, Wickham GS, Pace NR Phylogenetic stains: ribosomal RNA based probes for the identification of single cells. Science 243: Hugenholtz, P., Goebel, B.M., and Pace, N.R Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. J Bacteriol 180: Loy A, Horn M, Wagner M. 03. ProbeBase: an online resource for rrna-targeted oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res 31: Moter A, Gdbel UB. 00. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J Microbiol Methods 41: Peplies J, Glockner F0, Amann R. 03. Optimization strategies for DNA microarray-based detection of bacteria with 16S rrna-targeting oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol. 69: Zimmermann, J., W. Ludwig, K.-H. Schleifer. 01. DNA polynucleotide probes generated from representatives of the genus Acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples. System. Appl. Microbiol. 24: Breve descripción Tal como se ha mencionado previamente se hace necesaria una tecnología capaz de detectar a los microorganismos pertenecientes al grupo de las Acidobacterias, de la manera más rápida, fiable y precisa posible, y a su vez distinguirlas de otros microorganismos. La presente invención se refiere a la detección de Acidobacterias, utilizando secuencias de nucleótidos como sondas o primers (cebadores), y su aplicación en búsquedas de presencia, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias. 4 0 La presente invención describe una sonda y oligonucleótido de ADN específico diseñado para la detección de las Acidobacterias basándose en el gen ARN ribosómico 23S; más concretamente, utilizando el oligonucleótido propuesto ACIPHY631 en la presente invención que es específico para Acidobacterias, o su complementario. Constituye, por tanto, un objeto de la presente invención una secuencia aislada de nucleótidos útil para la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias que comprende la secuencia complementaria inversa a una secuencia parcial del gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias de ACIPHY631 o su complementaria, en adelante la secuencia. Asimismo, constituye otro objeto de la presente invención un kit de detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende la secuencia o sonda mencionada anteriormente. El método de detección, cuantificación, e identificación de Acidobacterias que utiliza al menos la secuencia, o sonda, o un kit de los mencionados anteriormente, constituye igualmente un objeto de la invención. La presente invención presenta el diseño de una secuencia de oligonucleótidos para la detección bien como primer o sonda de Acidobacterias en aplicaciones como por ejemplo, pero no restringido a, la amplificación por PCR, FISH, microarrays de ADN o reacciones de transcripción inversa a partir de ARN, así como el empleo de esos oligonucleótidos como reactivo o método para la detección de Acidobacterias. Estos oligonucleótidos van dirigidos a detectar específicamente las Acidobacterias utilizando secuencias únicas del gen de ARN ribosómico 23S de estos microorganismos. La utilización de estos oligonucleótidos permite la detección rápida de Acidobacterias sin necesidad de cultivar estos microorganismos con la utilización de técnicas moleculares (PCR, FISH, microarrays). 6 Otro aspecto de la presente invención se relaciona con la utilización de la secuencia, o sonda, o kits, objetos de la presente invención, en la detección, identificación y/o cuantificación de Acidobacterias en cualquier tipo de muestras, preferentemente en muestras ambientales, biológicas y/o médicas. 3

4 Descripción de las figuras Figura Análisis electroforético en gel de agarosa que muestra los productos de PCR obtenidos con la utilización del primer propuesto ACIPHY631 (reverse) y el primer universal 616 (forward). La detección positiva de acidobacterias se comprueba rápidamente por la presencia de producto ( muestra positiva ) y su ausencia denota la ausencia de acidobacterias ( muestra negativa ) en otra muestra analizada. Se presenta el resultado de un gradiente de temperatura de hibridación de los primers al ADN molde durante la PCR (desde 3 hasta 62.3ºC) para cada muestra. Figura 2 Microfotografías mostrando la detección de Acidobacterias. La técnica utilizada es FISH con la sonda de ADN propuesta ACIPHY631. A, fotografía utilizando luz de excitación verde con el colorante Cy3 unido a la sonda mencionada que muestra la presencia de los filamentos correspondientes a Acidobacterias. B, fotografía utilizando luz de excitación azul y el colorante SYBR Green I que tiñe inespecíficamente ADN mostrando todas las bacterias presentes en la muestra. C, fotografía en contraste de fases de la misma muestra de A y B. Las flechas indican las células de Acidobacteria a las que se dirigía la sonda. Descripción detallada de la invención Un objeto de la presente invención una secuencia aislada de nucleótidos útil para la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias que comprende la secuencia complementaria inversa a una secuencia parcial del gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias de ACIPHY631 o su complementaria, en adelante la secuencia. La invención se relaciona con el diseño de una secuencia de oligonucleótidos dirigida a detectar específicamente las Acidobacterias en cualquier tipo de muestra. Este oligonucleótido utiliza una secuencia única del gen ARN ribosómico 23S de estos microorganismos y puede ser empleada como primers para la amplificación de fragmentos del gen ARN ribosómico 23S de las Acidobacterias (por PCR o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos), como sonda de ADN para análisis por FISH, o microarrays de ADN. Tras realizar análisis exhaustivos de las secuencias conocidas y otras obtenidas durante los experimentos, se ha observado que la utilización del gen de ARN ribosómico 23S proporciona una secuencia de mayor longitud que la del gen ARN ribosómico 16S y existe un gran número de posiciones en esta secuencia que ofrecen gran interés para el diseño de sondas de hibridación y oligómeros o primers para su amplificación. Estas secuencias han sido utilizadas para el diseño de primers que permiten la amplificación de fragmentos del gen de ARN ribosómico 23S de Acidobacterias y de sondas de ADN que marcadas con colorantes fluorescentes sirven para la rápida detección de Acidobacterias en cualquier tipo de muestras. Constituye por tanto otro objeto de la presente invención, una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia mencionada anteriormente. Utilizando la secuencia y sonda propuesta en la presente invención se puede detectar y distinguir cualquier Acidobacteria entre un grupo de microorganismos. TABLA 1 Secuencia de oligonucleótidos propuesta y localización en el gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterium capsulatum 6 Constituye, asimismo, otro objeto de la presente invención un kit de detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende la secuencia o sonda de mencionada anteriormente. Otro objeto de la invención lo constituye un método de detección, cuantificación, e identificación de Acidobacterias en el que se utiliza la secuencia, o una sonda, o un kit mencionado anteriormente. 4

5 Otro aspecto de la presente invención se relaciona con la utilización de la secuencia, o sonda, o kit, objeto de la presente invención, en la detección, identificación y/o cuantificación de Acidobacterias en cualquier tipo de muestras, preferentemente en muestras ambientales, biológicas y/o médicas. Ejemplo de realización de la invención Ejemplo Detección de la presencia de Acidobacterias tras amplificación por PCR de fragmentos del gen ARN ribosómico 23S a partir de muestras ambientales Una muestra de la pared de la cueva de Altamira se recogió en un tubo de 1. ml estéril. La muestra se congeló hasta su posterior análisis. Se extrajo el ADN con el kit dé extracción Nucleospin food (Macherey-Nagel, Alemania). Un microlitro de la solución de ADN se utilizó en una reacción de PCR siguiendo el procedimiento estandard. Se utilizó la taq ADN polimerasa Extaq (Takara) y las condiciones recomendadas para esta enzima en su manual de utilización. Los primers utilizados fueron el oligonucleótido propuesto ACIPHY631 en la presente invención (Tabla 1) específico para Acidobacterias y el primer universal 616F ( - AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG). Se ensayaron una muestra positiva (con Acidobacterias) y otra negativa (sin Acidobacterias). Los productos de amplificación se observaron en geles de agarosa (1.% agarosa en TAE 0.x) siguiendo procedimientos establecidos en laboratorios de Biología Molecular. Los resultados se muestran en la Figura 1. Se observa que la presencia de Acidobacterias se revela por la obtención de un producto de PCR del tamaño esperado (muestra positiva) mientras que la ausencia de Acidobacterias (o presencia por debajo del nivel de detección) resulta en la ausencia de producto de amplificación y por tanto en la ausencia de la banda esperada (muestra negativa) en el gel de agarosa. Así, queda demostrada la utilidad del oligonucleótido propuesto en la detección de Acidobacterias. Ejemplo 2 Detección de Acidobacterias por FISH utilizando el oligonucleótido propuesto como sonda de ADN 3 4 Una muestra de la pared de la cueva de Altamira se recogió en un tubo de 1. ml estéril. La muestra se suspendió en paraformaldehido (PFA) al 4% y se mantuvo a 4ºC durante 4 horas. Se centrifugó a.000 x g durante minutos, se retiró el sobrenadante y se suspendió en solución de PBS (Phosphate Buffered Solution). El PBS se eliminó tras centrifugación, la muestra se resuspendió nuevamente en PBS y se almacenó a -ºC hasta que fue hibridada a las sondas fluorescentes. La preparación de la muestra sobre un portaobjetos y su hibridación con una sonda de ADN marcada fluorescentemente se realizó tal y como lo describió Zimmermann et al. (01) siguiendo el protocolo estandard para FISH. La astringencia idónea para cada sonda de ADN se obtuvo tras comparar el mismo procedimiento llevado a cabo a distintas concentraciones de formamida tal y como ha sido previamente descrito (por ejemplo, Zimmermann et al. 01). La observación de las muestras hibridadas se realizó con un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axiophot. La sonda diseñada fue sintetizada con el marcaje fluorescente Cy3 por Thermos Corporation (Alemania). La secuencia de nucleótidos correspondiente a la sonda utilizada (ACIPHY631) se muestra en la Tabla 1. Este ejemplo demuestra que con la sonda utilizada podemos detectar Acidobacterias in situ por microscopía. 0 6

6 REIVINDICACIONES Secuencia aislada de nucleótidos útil para la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizada porque comprende la secuencia complementaria inversa a una secuencia parcial del gen ARN ribosómico 23S de Acidobacterias de SEQ ACIPHY631 (SEQ.ID.NO1) o su complementaria. 2. Sonda de ácido nucleico útil para la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos según la reivindicación Kit útil para la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende al menos una secuencia según la reivindicación Kit de detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias caracterizado porque comprende al menos una sonda según la reivindicación 2.. Método de detección, cuantificación, e identificación de Acidobacterias caracterizado porque utiliza al menos una secuencia según la reivindicación 1, o una sonda según la reivindicación 2, o un kit según las reivindicaciones 3 y Utilización de una o más secuencias según la reivindicación 1 como cebador o primer, para la amplificación, secuenciación y/o hibridación de secuencias de Acidobacterias. 7. Utilización de una o más secuencias según la reivindicación 1 como cebador o primer, en reacciones de PCR u otras reacciones de amplificación, FISH, micro y macroarrays. 8. Utilización de una o más secuencias según la reivindicación 1 para la detección, identificación y/o cuantificación de Acidobacterias en cualquier tipo de muestras. 9. Utilización de una o más sondas o cebadores (primers) según la reivindicación 2 para la detección y/o cuantificación de Acidobacterias.. Utilización de un kit según las reivindicaciones 3 y 4 para la detección, cuantificación y/o la identificación precisa de Acidobacterias. 11. Utilización de un kit según las reivindicaciones 3 y 4 caracterizada porque la detección, cuantificación y/o identificación de Acidobacterias se lleva a cabo en muestras ambientales, biológicas y/o médicas

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9 <1> Consejo Superior de Investigacines Científicas LISTA DE SECUENCIAS <1> OLIGONUCLEÓTIDOS DIRIGIDOS AL ARN RIBOSÓMICO 23S DE ACIDOBACTERIAS. SU UTILI- ZACIÓN COMO PRIMER O SONDA EN PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN <1> oligonucleótidos de Acidobacterias ARN ribosómico 23S <1> 22 1 <170> PatentIn version 3.1 <2> 1 <211> 18 <212> DNA <213> División Acidobacteria <0> 1 2 aactagccrg ctcattat

10 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 1 Int. Cl.: C12Q 1/68 (06.01) DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas X ZIMMERMANN, J., GONZALEZ, J. M., SAIZ-JIMENEZ, C. Detection and 1-11 phylogenetic relationships of highly diverse uncultured Acidobacerial communities in Altamira Cave using 23S rrna sequence analyses. Geomicrobiology Journal. Octubre-Noviembre 0, Vol. 22, Nº 7-8, páginas ISSN X LUDWIG, W., DORN, S., SPRINGER, N. et al. PCR-based preparation 1-11 of 23S rrna-targeted group-specific polynucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. Septiembre 1994, Vol., Nº 9, páginas ISSN A PANKRATOV, T. A., BELOVA, S. E., DEDYSH, S. N. Evaluation of the 1-11 phylogenetic diversity of prokaryotic microorganisms in Sphagnum peat bogs by means of fluorescence in situ hybridization (FISH). Microbiology. Noviembre 0, Vol. 74, Nº 6, páginas ISSN Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página E. Relaño Reyes 1/1