MODIFICACIÓN GENÉTICA DE LEVADURAS VÍNICAS Amparo Querol IATA-CSIC, Valencia (España)

Transcripción

1 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE LEVADURAS VÍNICAS Amparo Querol IATA-CSIC, Valencia (España)

2 NUEVAS TENDENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA A VÍNICAV Selección de levaduras Desarrollo de técnicas moleculares de identificación y caracterización de levaduras Mejora genética de levaduras vínicas

3 VENTAJAS DE LAS LEVADURAS SECAS ACTIVAS 1. INICIO RÁPIDO DE LA FERMENTACIÓN 2. REGULARIDAD EN EL CURSO DE LA FERMENTACIÓN 3. SEGURIDAD DE UNA BUENA FERMENTACIÓN

4 Condiciones climatológicas favorables Condiciones climatológicas desfavorables

5 SELECCIÓN N DE LEVADURAS Fenotipo killer Microvinificación Catas

6 NUEVAS TENDENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA A VÍNICAV Selección de levaduras Desarrollo de técnicas moleculares de identificación y caracterización de levaduras Mejora genética de levaduras vínicas

7 TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN MOLECULAR - Análisis de restricción del mtdna - Cariotipos nucleares - Elementos delta -RAPD-PCR

8 La selección de levaduras para uso industrial requiere de una caracterización para su inequívoca identificación y diferenciación

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10 Se impone la levadura inoculada durante la fermentación? m T-73 B-II B-VI B-VIII T-73 B-II B-VI B-VIII m frecuencia (%) B-I (T73) B-II B-VI B-VIII tiempo de fermentación (días)

11 NUEVAS TENDENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA A VÍNICAV Selección de levaduras Desarrollo de técnicas moleculares de identificación y caracterización de levaduras Mejora genética de levaduras vínicas

12 MEJORA GENÉTICA DE STARTERS - Selección de variantes - Mutagénesis y selección de variantes - Hibridación entre células haploides - Fusión de protoplastos - Modificación genética: clonación de genes y transformación

13 MEJORA DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA -Inicio rápido de fermentación -Elevada velocidad de la fermentación -Alta resistencia a temperatura elevada -Alta resistencia a etanol -Alta tolerancia al CO 2 -Capacidad de floculación

14 MEJORA DE LA CALIDAD Y LA PRODUCCIÓN DEL VINO -Baja producción de metabolitos no deseados (ácidos volátiles, HS 2, derivados de SO 2 -No formación de espuma -Control de la acidez -Aumento de aromas afrutados -Estabilidad del color

15 MEJORA DEL PROCESO DE PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE LEVADURA COMERCIAL SECA -Aumento de la viabilidad -Estabilidad de la capacidad fermentativa

16 POSIBILIDAD DE MEJORA GENÉTICA 1. Del proceso de fermentación alcohólica 2. De la calidad de las propiedades del vino 3. Del proceso de producción de la levadura comercial

17 MEJORA GENÉTICA DE STARTERS - Selección de variantes - Mutagénesis y selección de variantes - Hibridación entre células haploides - Fusión de protoplastos - Modificación genética: clonación de genes y transformación

18 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE STARTERS 1 2 DNA NUEVA CARACTERÍSTICA DE INTERÉS INDUSTRIAL

19 K1 AMPLIACIÓN N DEL GENOTIPO KILLER K1 K1/K2 K2 2 K1 K2

20 FERMENTACIÓN N MIXTA S. cerevisiae LDH LDH Lactobacillus casei GLUCOSA ETANOL + ÁCIDO LÁCTICO

21 FERMENTACIÓN N MALOLÁCTICA L-malato NAD+ L-lactato + CO 2 mle mle mle mles Lactobacillus delbrueckii Lactococcus lactis mlea Leuconostoc oenos

22 FERMENTACIÓN N MALOLÁCTICA S. cerevisiae S. pombe mae1 mles mles mae1 L. lactis mles MÁLICO LÁCTICO

23 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE STARTERS evaduras vínicas modificadas genéticamente mediante técnicas del DNA recombinante Querol y Ramón, 1996 y Pretorius 2000). Gen expresado Efecto en la levadura vínica o en el vino Toxina killer K1 Ventaja ecológica de la cepa al inocular Pectato liasa Problemas de filatración e incremento del aroma afrutado Poligalacturonsas β-(1,4)-endoglucanas β-(1,4)-endoglucanas Arabinofuranosidasa β-glucosidasa ND Incremento del aroma afrutado Incremento del aroma afrutado Incremento del aroma afrutado Incremento del aroma afrutado e incremento de resveratrol Xilanasa L(+)-lactato deshidrogenasa Malato permeasa y enzima málico Incremento del aroma afrutado Aumenta la acidez del vino Disminución de la acidez del vino Disminución de la acidez del vino Incremento de los aromas secundarios: ésteres Sobreexpresión de glicerol-3-fosfato dehidrogenasa Incremento en la producción de glicerol Expresión de bacteriocinas de Pediococcus acidilactici y Leuconostoc carnosum Inhibición del crecimineto de baterias alterantes del vino

24 Enzimas comerciales - Pectinasas Mejorar rendimiento Mejorar procesos de filtración y clarificación Extracción de Fenoles (Antocianos, Taninos, otros) Extracción de precursores del aroma Estabilidad del vino -Glucanasas - Glucosidasas Liberación de aromas primarios

25 MEZCLAS COMERCIALES Falta de especificidad Numerosas actividades contaminantes Poca repetitividad de resultados de lote a lote Poco activas en condiciones de vinificación

26 POSIBILIDADES Adición directa: producción usando hongos filametosos Sobreexpresión en levadura vínica

27 INCREMENTO DE AROMA PRIMARIOS SECUNDARIOS TERCIARIOS

28 AROMA PRIMARIO Terpeno Glucosa Arabinosa Apiosa Ramnosa GLU T G + A BGL T + G Terpeno volátil Terpeno no volátil

29 LEVADURAS VÍNICAS V HIDROLÍTICAS Aspergillus niger Candida molischiana ABF BGL ABF BGL S. cerevisiae Terpeno volátil T G A Terpeno no volátil ABF T G + A BGL T + G

30 INCREMENTO DEL RESVERATROL t-piceid c-piceid t-resveratrol c-resveratrol µm T 73 AbfB BglN AbfB+BglN

31 AROMAS SECUNDARIOS ÉSTER - SINTASA ÉSTER - HIDROLASA ALCOHOL ACETIL TRANSFERASA A-CoA + Alcohol AATF ÉS T E R Éster - Hidrolasa Éster -sintasa Alcohol + Acido

32 COMERCIALIZACIÓN N DE LOS VINOS RECOMBINANTES Composición nutricional EQUIVALENCIA SUBSTANCIAL Sistemas simulados de fluidos digestivos FALTA DE ALERGENICIDAD Administración oral de proteína pura a animales de laboratorio FALTA DE TOXICIDAD

33 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE STARTERS 1. Sistemas de integración en el genoma de la levadura: levaduras GRAS 2. Regulación de la expresión génica 3. Mejora de respuesta al estrés de levaduras vínicas industriales

34 TRANSFORMACIÓN N GENÉTICA DE LEVADURAS VÍNICASV URA3 L p egl1 AG kan R AG URA3 R Cassette de integración

35 LEVADURAS VÍNICAS V GRAS URA3 URA3 L p egl1 AG kan R AG URA3 R TRANSFORMACIÓN URA3 L p egl1 AG kan R AG URA3 R Cepa transformada ( URA3, kan R, egl1)

36 LEVADURAS VÍNICAS V GRAS URA3 L p egl1 AG kan R AG URA3 R Cepa transformada ( URA3, kan R, egl1) - KANAMICINA URA3 L p egl1 AG URA3 R Cepa transformada GRAS ( URA3, egl1)

37 LEVADURAS VÍNICAS V GRAS a b c a) b) c) URA3 (2n) URA3, kan R, egl1 URA3, egl1

38 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE STARTERS 1. Sistemas de integración en el genoma de la levadura: levaduras GRAS 2. Regulación de la expresión génica 3. Mejora de respuesta al estrés de levaduras vínicas industriales

39 EXPRESIÓN GÉNICA EN LEVADURAS

40 REGULACIÓN GÉNICA (Diferencias entre vinos) Días Días PGK1 HSP30 SPI1 1/ / Vino blanco Vino tinto

41 MODIFICACIÓN GENÉTICA DE STARTERS 1. Sistemas de integración en el genoma de la levadura: levaduras GRAS 2. Regulación de la expresión génica 3. Mejora de respuesta al estrés de levaduras vínicas industriales

42 MEJORA DE RESPUESTA AL ESTRÉS DE LEVADURAS VÍNICAS INDUSTRIALES 1. Aspectos fisiológicos y moleculares de la adaptación a las condiciones adversas de los procesos industriales 2. Identificación de nuevos genes implicados en la resistencia a estrés de cepas vínicas 3. Mejora genética: aumento de la resistencia a estrés de cepas vínicas.

43 RESISTENCIA A ESTRÉS, EXPRESIÓN GÉNICAY COMPORTAMIENTO FERMENTATIVO 1. Viabilidad frente a varias condiciones de estrés 2. Expresión de genes marcadores de estrés 3. Comportamiento en condiciones de microvinificación

44 Expresión de genes marcadores de estrés

45 Expresión de genes marcadores de estrés

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