PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS PICHIA PASTORIS RECOMBINANTES EN. Procesos biotecnológicos Dra. Claudia Elena Año 2015

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1 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN PICHIA PASTORIS Procesos biotecnológicos Dra. Claudia Elena Año 2015

2 CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN EN PICHIA Ventajas del sistema de expresión eucariota Procesamiento proteico Plegamiento proteico Modificaciones post-traduccionales Fácil manipulación genética Alcanza alta densidad celular Altos niveles de expresión de proteínas recombinantes

3 PICHIA PASTORIS LEVADURA METILOTROFA Capaz de utilizar metanol como unica fuente de carbono AOX La enzima alcohol oxidasa (AOX) tiene una muy baja afinidad por el O2, por lo cual Pichia pastoris lo compensa sintetizando grandes cantidades de esta enzima. El promotor que dirige la síntesis de esta enzima es el que se utiliza en aplicaciones biotecnológicas para la producción de proteínas recombinantes!!!

4 DESARROLLO DE CEPAS CLASIFICACIÓN FENOTÍPICA DE ACUERDO A CAPACIDAD DE UTILIZACIÓN DE METANOL Mut+ X33 GS115 Poseen ambos genes AOX1 y AOX 2 MutS KM71 Solo poseen el gen AOX2. Su crecimiento en metanol es mucho mas lento Mut- No posee ningún gen AOX, por lo que es incapaz de metabolizar metanol. Otras variantes. CEPAS AUXOTROFICAS: Existen distintas cepas auxotroficas ( ade1, arg4, his4, ura3) y por lo tanto combinaciones con distintos vectores para poder ser complementadas con los respectivos marcadores de selección. CEPAS DEFICIENTES EN PROTEASAS

5 CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL CLONADO Y EXPRESIÓN EN PICHIA PASTORIS Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:

6 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN PICHIA PASTORIS La expresión de proteínas recombinantes en Pichia pastoris puede ser tanto intracelular o secretoria. La secreción de proteínas requiere de una secuencia señal en la secuencia de la proteína a expresar que la dirija hacia la ruta de secreción. La secuencia del factor α-mating factor de Saccharomyces cerevisiaees la secuencia señal de secreción mas ampliamente utilizada. El sobrenadante de cultivos de Pichia contiene muy poca cantidad de proteína, por lo cual lograr una buena expresión secretoria de la proteína recombinante de interés facilita luego los pasos downstream de purificación!!!

7 CARACTERÍSTICAS DE LOS VECTORES DE CLONADO Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:

8 RECOMBINACIÓN E INTEGRACIÓN EN PICHIA PASTORIS La integración de DNA lineal puede generar transformantes estables de Pichia pastoris a través de mecanismos de recombinación homologa en regiones regiones homologas del genoma de Pichia. Estas integraciones muestran una alta estabilidad inclusive en ausencia de presión selectiva Las integraciones pueden darse en simple copia (mas frecuentes) o bien a través de múltiples integraciones.

9 Expresión constitutiva Expresión inducible SELECCIÓN DEL VECTOR DE CLONADO Expresión intracelular Expresión secretoria

10 PROMOTORES CONSTITUTIVOS Facilitan el manejo de los cultivos, ya que no necesitan el agregado de un agente inductor. En el caso de Pichia, elimina el uso de metanol. Promueve la transcripción continua del gen de interés. PGAP Generalmente es utilizado en presencia de glucosa, aunque también puede hacerse en presencia de glicerol.

11 PROMOTORES INDUCIBLES PAOX1. MECANISMOS DE REGULACIÓN. 1-Represión: El crecimiento en presencia de glucosa reprime la transcripción del gen, aun en presencia de metanol. 2-Inducción: La presencia del agente inductor, METANOL, es necesario para la expresión a partir del promotor AOX1! el crecimiento en presencia de glicerol (des represión) no es suficiente para la inducción del promotor. En ausencia del inductor

12 PROMOTORES INDUCIBLES: AOX1 Promotor fuerte V VENTAJAS: : D DESVENTAJAS: : Es necesario monitorear la concentración de metanol Requiere bajas concentraciones de metanol Transcripción altamente regulada Es altamente toxico inflamable, lo que dificulta su almacenamiento en altas cantidades

13 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EVALUACIÓN DEL NUMERO DE COPIAS INTEGRADAS Aw and Polizzi Microbial Cell Factories 2013, 12:128

14 QUE FACTORES AFECTAN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN PICHIA PASTORIS?

15 CO EXPRESIÓN DE FACTORES HELPERS Y CHAPERONAS BMH2: Factor involucrado en los procesos de exocitosis y en la regulacion del transporte vesicular. HAC1: Factor de transcripcion(bzip). Regula la via de Unfolded protein Response y vias de sintesis de membrana. PDI: Disulfuro isomerasa: cataliza la formacion e isomerizacion de enlaces S-S durante el plegamiento proteico. SSA4: ypertenece a la familia de las 70 kda heat shock protein. Esta involucrado en la transclocacion de polipeptidos al reticulo endoplasmico. SSO2: t-snare de membrana plasmatica involucrada en la fusion de vesiculas de secrecion. Kex-2: Endoproteasa. Remueve la secuencia señal de las pre-proteinas liberando la forma madura de la proteina secretada. COMO SE CO-EXPRESAN ESTOS FACTORES HELPERS?

16 Selección de cepa X33? KM71? GS115? Clonado delgende interés en vector de expresión Linealizacion del plásmido (con enzima de estricción) Transformación (electroporación) Selección de clones en placa por antibiótico o por complementación de autotrofia. Selección de colonias para ensayos de expresión en escala chica Selección del clon de mayor expresión para ensayos en batchy/o fermentación

17 COMO ALMACENAR CEPAS DE PICHIA? SepuedenmantenerenplacasdeYPDpordiassemanas. Para conservar por tiempos mas prolongados es convenientes, congelar lascepasen un stock conglierol. Paralocualse crece lacepaen medio de YPD a 30 C, overnight OD600 of (approximately cells/ml). Se realiza un stock con glicerol 35% en criovilaes para congelar a-80 C.

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