Expresión de proteínas recombinantes en levaduras. Mercedes Goin Laboratorio Denver Farma Área Biotecnología

Transcripción

1 Expresión de proteínas recombinantes en levaduras Mercedes Goin Laboratorio Denver Farma Área Biotecnología

2 Elección del sistema de expresión Complejidad de la molécula: estructura terciaria y cuaternaria, modificaciones postraduccionales Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico Cantidad de producto Economía Aspectos regulatorios

3 BACTERIAS Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores. Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/l). En general las proteínas tendrán metionina N-terminal. Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión. No produce eventos postraduccionales. Endotoxinas

4 LEVADURAS Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores. Buenos rendimientos ( g/l). Introduce modificaciones postraduccionales. La glicosilación es distinta de la de mamíferos: high manosas La proteólisis suele ser un problema.

5 CÉLULAS DE MAMÍFEROS Los cultivos en grandes escalas son difíciles de realizar y muy costosos. Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1 g/l). Se producen modificaciones postraduccionales. Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de expresión posible.

6 PLANTAS Se producen modificaciones postraduccionales Expresión localizada en diferentes órganos Expresión en estadíos específicos del crecimiento Crecimiento en campo barato La glicosilación es distinta que la de mamíferos Eficiencias bajas de transformación y expresión Seguridad controvertida

7 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS

8 Producción de proteínas biofarmaceúticas Levaduras E. coli Cel. Eucariotas superiores Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.

9 Saccharomyces cerevisiae

10 Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de levadura Nº de copias /célula Frec. transformación (a) Inestabilidad mitótica (b) Integrativos YIp ADN homólogo ,1 % Reemplazo ADN homólogo 1 10 Estable ADNr ADNr nd Estable Episomales Replicadores (YRp) ARS % Centroméricos (YCp) ARS/CEN % Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP /FLP ,8-0,2 % (a) (b) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.

11 Integración cromosómica de ADN por recombinación homóloga

12 Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de levadura Nº de copias /célula Frec. transformación (a) Inestabilidad mitótica (b) Integrativos YIp ADN homólogo ,1 % Reemplazo ADN homólogo 1 10 Estable ADNr ADNr nd Estable Episomales Replicadores (YRp) ARS % Centroméricos (YCp) ARS/CEN % Basados en 2µ (YEp) ORI/STB/REP /FLP ,8-0,2 % (a) (b) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.

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14 Marcadores de selección 1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en cepas auxotróficas. Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas para leucina, triptofano, uracilo e histidina 2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de cepas. Ej: Tn903kan r : selección con G418 DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol

15 Promotores y terminadores transcripcionales Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa ADH: alcohol deshidrogenasa Son inducidos varias veces por glucosa Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados. Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2µ

16 Secreción de proteínas en Saccharomyces cerevisiae Para qué? Plegamiento correcto Evitar efectos tóxicos Facilita la purificación Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbico propio de levaduras MFα1: feromona SUC2: invertasa PHO5: fosfatasa ácida

17 Construcción del gen para expresar en levaduras 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5 no codificante (5 UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2 as son inhibitorias de la iniciación de la traducción 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente AAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción 3- Uso de codones propios del sistema 4- Usar ADNc 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2 as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc. 6- Incluir sitios de restricción para el clonado

18 Problemas asociados a la producción en S. c. La mayoría son promotores constitutivos. Falta de promotores fuertes. El producto representa 1-5% del total de las proteínas producidas. Inestabilidad plasmídica. Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.

19 Casi todos los productos derivados de levaduras que están en el mercado son producidos en Saccharomyces cereviciae 2009: la FDA apueba la 1 era proteína biofarmaceútica producida en una levadura distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.

20 LEVADURAS METILOTRÓFICAS Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente escalable a grandes volúmenes de producción La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar rendimientos de hasta el 30-40% de las proteínas solubles celulares. Sistema actualmente muy difundido

21 Hansenula polymorpha (Pichia angusta) Candida boidinii Pichia methanolica Pichia pastoris

22 Pichia pastoris

23 ALCOHOL OXIDASA Son las primeras enzimas del camino metabólico de metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2. A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de homología AOX esta constituída por un octámero de subunidades idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.

24 PEROXISOMA CITOSOL CH 3 OH CH 3 OH O 2 AOX GSH FDH H 2 O 2 HCHO HCHO GS-CH 2 OH HCOOH CO 2 CATALASA FLDH NAD NAD 1/2O 2 + H 2 O DHAS NADH 2 NADH 2 Xu 5 P GAP DHA 1/3 GAP constituyentes DHA DHAP celulares ATP ADP FBP F 6 P GAP P 2

25 AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células compensan esta baja actividad catalítica sintetizando grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable, mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de las proteínas celulares solubles. La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional. Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil Inductor: Metanol Represor: glucosa, glicerol, etanol

26 Peroxisomas

27 Vectores de expresión para Pichia pastoris Inducción con metanol Cepa a transformar His - : GS115

28 Inducción con glucosa o glicerol

29 Reemplazo génico Integración del ADN en genoma Recombinación homóloga Inserción génica

30 Inserción génica en AOX

31 Reemplazo génico

32 Vectores de expresión para Pichia pastoris Inducción con metanol Cepa a transformar His - : GS115

33 Selección de cepas recombinantes His + Mut + e His + Mut s Mut + Mut s Mut s Medio MD Medio MM Confirmación por PCR y Southern blot

34 Selección de cepas recombinantes His + Mut + e His + Mut s MD MM

35 Caracterización del producto de expresión SDS PAGE +/- DTT Western blot

36 Caracterización de la cepa productora PCR: presencia y estabilidad del gen Southern blot: Mut+/Muts Dot Blot: Nº de copias del gen PCR cuantitativa: Nº de copias del gen

37 GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos

38 GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS 1- N- GLICOSILACIÓN 2- O- GLICOSILACIÓN

39 Glicosilación de proteínas Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi donde los hidratos de carbono sufren modificacines N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación. Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales α 1-3 glicano

40 N- GLICOSILACIÓN Sequon : Asn-X-Thr/Ser X: cualquier aa menos Prolina Asn

41 O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS α - manosa Ser/Treo α 1,2 manosa Sequon? Abundancia inusual de ser/treo Prolinas cerca de ser/thr aa cargados cerca de ser/treo

42 GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras Tunicamicina Cepas mutantes Enzimas para desglicosilar No usar la vía de secreción Mutagénesis dirigida

43 Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas

44 La productividad de un sistema recombinante está determinada por muchos factores genéticos y fisiológicos. Posibles cuellos de botella: Uso de codones Número de copias del gen Transcripción eficiente usando promotores fuertes Señales de traducción Translocación determinada por el péptido señal Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi Secreción Proteólisis

45 Cambio de escala 50 ml Shake-flask cultures 2.5 l Fermenters, with 1.5 l working volume 20 l Fermenters, with 15 l working volume 400 l Fermenters, with 300 l working volume

46 COSECHA CENTRIFUGACIÓN

47 Qué construcción? Qué precursor? Qué promotor? Qué péptido señal?

48 Fenotipo Mut Selección del clon Nivel de expresión proteica Nº de copias del gen