BIBLIOGRAFIA: Brock, Biología de los Microorganismos. Introducción a la Microbiología Microbiology. 7

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1 Unidad 12: Microbiología industrial. Tecnología de fermentación. Procesos industriales: bebidas alcohólicas, aminoácidos, acido cítrico, enzimas, vitaminas, alimentos y productos farmacéuticos. Fuentes alternativas de energía con utilización de microorganismos. BIBLIOGRAFIA: Madigan MT, Martinko JM, Parker J Brock, Biología de los Microorganismos. 12º ed. Pearson/Prentice-Hall (Cap. 25) Tortora, Funke, Case. Introducción a la Microbiología 9º Ed. Ed. Médica Panamericana 2007 (Cap. 28) Prescott, Harley, Klein Microbiology. 7º ed. McGraw Hill Interamericana (Cap. 40 y cap 41). Microbiología, 2015

2 Antecedentes Históricos La era antes de Pasteur Cerveza, quesos, vinos, pan Civilización sumeria (6000 años ac ) Louis Pasteur ( ) padre de la microbiología industrial Ácido láctico, etanol, ácido butírico Siglo XX (1900 a 1940) Penicilina, acetona, butanol, glicerol y otros

3 Levaduras utilizadas en la industria Levadura Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces ellipsoideus Torulopsis utilis Candida lipolytica Schizosaccharomyces sp Producto Pan, cerveza Vino Fuente de proteína Alcohol industrial

4 Algunos ejemplos de mohos utilizados en la industria Mohos Aspergillus niger Penicillum sp Penicillum roqueforti Rhizopus oryzae Aspergillus terreus Penicillum griseofulvum Producto Ácido cítrico Ácido glucónico Quesos roquefort Ácido láctico Ácido itacónico griseofulvina

5 Algunos ejemplos de bacterias utilizadas en la industria Bacterias Acetobacter Acetobacter suboxydans Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus delbrueckii Clostridium acetobutylicum Streptomyces griseus Producto Vinagre Sorbitol Yogur Ácido láctico Butanol, acetona Estreptomicina

6 Capacidad microbiana en la producción de compuestos industriales Poseen toda la información genética en el genoma natural Poseen información genética sólo para algunas etapas de la síntesis No poseen naturalmente la información genética pero es introducida mediante tecnología del ADN recombinante

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8 Requisitos de un microorganismo industrial El microorganismo debe: 1. Producir la sustancia de interés en forma rentable 2. Obtenerse en cultivo puro 3. Ser genéticamente estable. 4. Poder desarrollarse en cultivos a gran escala. 5. Poder mantener el cultivo del MO durante períodos largos en el laboratorio y en la planta industrial. 6. Microorganismos esporulados 7. Tener un tiempo de duplicación bajo y fabricar el producto deseado en un período corto. Crecimiento rápido: i) ocupar menos tiempo los equipos industriales ii) disminuir los riesgos de contaminación en el fermentador iii) mejor control de los factores ambientales 8. Ser susceptible de manipulación genética. 9. Debe poder ser capaz de crecer en un medio de cultivo líquido relativamente barato, que se obtenga en grandes cantidades.

9 Muchos procesos microbiológicos industriales utilizan productos de desecho carbonados provenientes de otras industrias, para los medios de cultivo a gran escala. Por ej. el licor de maceración del maíz (rico en nitrógeno y factores de crecimiento), suero de leche (contiene lactosa y minerales), y otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgánico. Con el fin de poder separar las células microbianas del medio de cultivo con facilidad, en la industria se prefieren los MOs grandes ya que este proceso es muy costoso a gran escala. Por este motivo se prefieren los hongos, levaduras y bacterias filamentosas. Es más económico efectuar la separación por filtración que por centrifugación. Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial Los microorganismos industriales no deben: 1. ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interés económico. 2. liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas fácilmente.

10 Sustratos: 1. ácido desoxicólico (buey) 1g de acetato de cortisona/615 g ácido desoxicólico Y C/AD = Estigmasterol (soja) 3 diosgenina (barbasco mejicano) Etapas de Síntesis: 31 pasos a 11 pasos Rhizopus arrhizus Ventas mundial de los 4 principales esteroides: cortisona, aldosterona, prednisona y prednisolona: kg/año A A Corynebacterium simplex

11 Metabolitos microbianos Conceptos: Metabolito primario Metabolito secundario SUSTRATO DE CRECIMIENTO CÉLULAS METABOLITO PRIMARIO METABOLITO SECUNDARIO

12 Producción de metabolitos primarios y secundarios en un cultivo discontinuo Nucleótidos Proteínas Ácidos nucleicos Ácidos orgánicos Lípidos Carbohidratos Actividad antimicrobiana Inhibición enzimática Promotor del crecimiento Acciones farmacológicas diversas

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14 Características de los metabolitos secundarios (Particularmente los que presentan actividad antimicrobiana) 1.- Son específicos de grupos restringidos de microorganismos. Bacterias y hongos filamentosos Bacterias esporuladas 2.- No son indispensables para el crecimiento y reproducción. 3.- Su formación depende de las condiciones de crecimiento del organismo productor. 4.- Se producen como grupo de sustancias relacionadas (Ej: Penicilinas) 5.- Se puede obtener superproducción del metabolito por manipulación genética y mejoramiento de condiciones fermentativas. 6.- En algunos casos se han identificado inductores específicos.

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16 Tecnología de la Fermentación Biodigestor Brock, Biología de los Microorganismos Cap.25

17 Fermentador 1. Debe diseñarse para funcionar asépticamente por prolongados períodos de tiempo 2. Debe proporcionar adecuada agitación y aireación para satisfacer las necesidades metabólicas microbianas 3. Bajo consumo de energía 4. Sistema de control de ph 5. Sistema de toma de muestra 6. Sistema de control de temperatura 7. Mínimas pérdidas de evaporación 8. Mínimas operaciones laborales para su funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento 9. Versatilidad en las diversas aplicaciones de los procesos 10. Superficies internas lisas 11. Similitud en la geometría en las distintas escalas 12. Materiales económicos con resultados satisfactorios 13. Servicios de repuestos adecuado

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24 Ácidos Orgánicos (Ácido Cítrico: Aspergillus niger) Purificación: 1. Agregado de OCa. Filtración 2. H 2 SO 4. Filtración. 3. Cristales de ácido cítrico por evaporación

25 Ácidos Orgánicos (Vinagre: Acetobacter-Gluconobacter) Producción de vinagre: 1. Método de la Tinaja (M. Pasteur, M. deorleans) 2. Método del goteo (M. de Schuetzenbach) 3. Método del burbujeo MP: Vino, cerveza, arroz fermentado, sidra

26 Vitaminas y Aminoácidos En el hombre, una deficiencia importante en la vitamina B12 produce la llamada anemia perniciosa, que se caracteriza por la baja producción de eritrocitos y alteraciones en el sistema nervioso. Los requerimientos de esta vitamina por los animales se realizan a través de la dieta o por la adsorción de la vitamina producida por los microorganismos que colonizan el intestino de los animales. Las plantas no producen ni utilizan vitamina B12. El rendimiento de esta vitamina se incrementa mucho utilizando cepas sobreproductoras del género Propionibacterium o Pseudomonas y añadiendo cobalto al medio de cultivo. La riboflavina es una coenzima muy importante y es sintetizada por muchos M.O.s. El hongo Ashbya gossypii produce en forma natural cantidades enormes de esta vitamina (hasta 7g/l).

27 Ácido L- ascórbico: i) Síntesis de Reichstein-Grüssner (1934) Y A/G :50% ii) Síntesis de Sonoyama (1982) Y A/G : 86% iii) Síntesis de Genentech (1985) Producción mundial: ton/año

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31 Cepa de Kinoshita (1957) Cepa aislada: Biotina - No sintetiza α- CGD Condiciones limitantes de Biotina α- cetoglutarato deshidrogenasa.

32 Inhibición por Retroalimentación Concentada (C. glutamicum) Aspartato quinasa Homoser- Brevibacterium flavum: mutante resistente a un análogo de lisina (S-aminoetil cisteína)

33 Alimentos Productos Farmacéuticos Textiles Usos de la Enzimas Detergentes Papel Energía

34 Enzimas como productos industriales

35 Distribución de la Enzimas industriales Tm (1981) Proteasas (59%) Carbohidratasas (28%) Lipasas (3%) Otras (10%) Alcalinas (25%) α-amilasas 13% Analíticas Neutras (12%) Isomerasas 6% Farmacéuticas Acidas (cuajos) (10%) β amilasas 5% Para desarrollo Alcalinas (otras) (6%) Pectinasas 3% Tripsinas (3%) (Acidas) (otras) (3%) Celulasas Lactasas (1%)

36 Exoenzimas: Digestión de polímeros insolubles Extremoenzimas Inmovilización de enzimas: 1.Unión a un soporte 2.Entrecruzamiento 3. Inclusión

37 Fuentes de obtención de antimicrobianos Las tres principales fuentes de obtención de antimicrobianos son: 1) Microorganismos 2) Síntesis química (quinolonas, sulfonamidas, fosfomicina, pirrolnitrina, agentes antituberculosos (PAS, isoniacida) 3) Semisíntesis 1) 3)

38 INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS 1.- Manipulación ambiental Catabolito: eliminación de la glucosa del medio. Inducción: adición de manano al medio. Carga energética: disminución de fosfato en el medio. Precursores: adición de precursores al medio. 2.- Selección de mutantes mal regulados A. Revertientes B. Resistencia a análogos C. Mutasíntesis D. Cosíntesis

39 SISTEMAS DE REGULACION EN LA BIOSINTESIS DE METABOLITOS SECUNDARIOS INDUCCION ENZIMATICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS Ej: Triptófano en la biosíntesis de alcaloides por Claviceps Metionina (norleucina) en la biosíntesis de cefalosporina por Cephalosporium acremonium Manano en el equilibrio entre manósido estreptomicina y estreptomicina REGULACION CATABOLICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS Monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) en el equilibrio entre manósido estreptomicina y estreptomicina (Streptomyces griseus) REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA EN LOS METABOLITOS SECUNDARIOS La producción de clortetraciclina es inversa al contenido de fosfato inorgánico en el medio (Streptomyces aureofaciens) REGULACION POR RETROALIMENTACION Producción de penicilina (P. chrysogenium) y estreptomicina (S. griseus)

40 Mejoras de cepas Programa convencional en el mejoramiento de cepas Conseguir la sobreproducción Mantenimientos de tales características Adaptación del crecimiento a materias primas económicas Agentes mutagénicos más comunes: Radiación UV, Rayos X, Rayos γ, agentes alquilantes, nitritos y nitrosoguanidina Logros: crecimiento como bolas (pellets) y no en forma filamentosa cultivos sin pigmentación eliminación de productos laterales Introducción de genes para la producción de nuevos antibioticos Manipulación de cepas bacterianas y de las enzimas en los procesos de producción

41 Producción de penicilinas naturales Licor de maceración de maíz Producción de penicilinas biosintéticas Precursores: 1. ácido fenilacético (Penicilina G: bencilpenicilina) 2. ácido fenoxiacético (Penicilina V: fenoximetilpenicilina) Producción de penicilinas semisintéticas Vía química: 3 etapas, a bajas temperaturas, en condiciones anhidras, solventes Vía enzimática (acilasas)

42 Proceso de Producción Scaling-up Downstream Processing T:5ºC

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