In México, mosquitoes of the genera Anopheles and

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1 PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS EN LABORATORIO Y DE Anopheles pseudopunctipennis EN CAMPO PARASITISM OF Romanomermis iyengari IN LARVAE OF THREE SPECIES OF MOSQUITO IN LABORATORY, AND OF Anopheles pseudopunctipennis IN THE FIELD Rafael Pérez-Pacheco 1, Cesáreo Rodríguez-Hernández 2, Joel Lara-Reyna 2, Roberto Montes-Belmont 3, Gustavo Ramírez-Valverde 2 y Laura Martínez-Martínez 1 1 CIIDIR-Oaxaca, Instituto Politécnico Nacional-COFAA. Hornos 1003, Santa Cruz Xoxocotlán, Oaxaca, México. (rperez88@prodigy.net.mx). 2 Colegio de Postgraduados. Carretera México- Texcoco, Km 36.5, Montecillo, Estado de México. 3 CEPROBI, Instituto Politécnico Nacional-COFAA. Carretera Yautepec-Jojutla Km 8.5, Yautepec, Morelos. RESUMEN ABSTRACT Se evaluó en laboratorio el parasitismo del nematodo Romanomermis iyengari en larvas de mosquitos de tercero y cuarto ínstares de Aedes aegypti, Anopheles pseudopunctipennis y Culex quinquefasciatus, aplicando una dosis de 10 nematodos larva 1. La efectividad de R. iyengari en larvas de An. pseudopunctipennis en campo se determinó en criaderos naturales en Pochutla, en el Estado de Oaxaca, México. R. iyengari parasitó eficientemente larvas de los ínstares tercero y cuarto de las tres especies de mosquitos. Las larvas del tercer ínstar de las tres especies son más susceptibles al parasitismo que las del cuarto. Las larvas de An. pseudopunctipennis fueron más susceptibles de ser parasitadas por R. iyengari ( %) en comparación con las de Ae. aegypti ( %) y Cx. quinquefasciatus ( %). Los adultos de larvas parasitadas en los ínstares tercero y cuarto murieron 3-6 d después de emerger. El desarrollo de la fase parásita del nematodo transcurrió normalmente a través de la pupa y el adulto del mosquito. La aplicación de R. iyengari a una densidad de 3000 nematodos m 2 en diez criaderos naturales de An. pseudopunctipennis produjo 90 a 100% de parasitismo, infestación de 1.8 a 3.1 nematodos larva 1 y reducción poblacional de larvas de 82.2 a 99.0%. Palabras clave: Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, control biológico, nematodo. INTRODUCCIÓN En México los mosquitos de los géneros Anopheles y Aedes son vectores de patógenos causantes de paludismo y dengue. En el distrito de Pochutla, en la costa del Estado de Oaxaca, México, se registran los índices más altos de paludismo del país (Secretaría de Salud, 1996). El combate a mosquitos vectores de enfermedades se ha hecho tradicionalmente con insecticidas Recibido Septiembre, Aprobado: Julio, Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 38: A laboratory evaluation was carried out to determine the parasitic capacity of the nematode Romanomermis iyengari on III and 1V instar larvae of the mosquitoes Aedes aegypti, Anopheles pseudopuntipennis, and Culex quinquefasciatus, applying a dose of 10 nematodes larva 1. The effectiveness of R. iyengari in larvae of An. pseudopunctipennis in the field was evaluated in Pochutla, State of Oaxaca, México. R. iyengari efficiently parasitize III and IV instar larvae of the three mosquito species. The III instar larvae of the three species of mosquitoes were more susceptible to parasitism than the IV instar larvae. The larvae of An. pseudopunctipennis were the most susceptible to infestation by R. iyengari ( %) in comparison with Ae. aegypti ( %) and Cx. quinquefasciatus ( %). The adults from larvae parasitized during III and IV died 3-6 d after emergence. The development of the parasitic phase of the nematode normally took place during the pupal and adult stages of the mosquito. Field applications of R. iyengari were made at a density of 3000 nematodes m 2 to ten natural larval rearing sites of An. pseudopunctipennis causing 90% to 100% parasitism, infestations ranging from 1.8 to 3.1 nematodes per larvae, and with larval population reductions of 82.2 to 99.0%. Key words: Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, biological control, nematode. INTRODUCTION In México, mosquitoes of the genera Anopheles and Aedes are vectors of pathogens causing malaria and dengue. In the district of Pochutla, on the coast of the State of Oaxaca, México, the highest indices of malaria in the country were registered (Secretaría de Salud, 1996). The fight against disease vector mosquitoes has traditionally been carried out with organo-synthetic insecticides which have caused pollution to the atmosphere, intoxication to humans and resistance in mosquitoes. One alternative is the use of the nematode 413

2 414 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004 organosintéticos que han ocasionado contaminación al ambiente, intoxicaciones a personas y resistencia de los mosquitos. Una alternativa es la utilización del nematodo Romanomermis iyengari, especie nativa de la India y empleada por primera vez en México en el Estado de Oaxaca (Pérez et al., 1996). R. iyengari se ha evaluado en laboratorio y campo en diferentes especies de Aedes, Anopheles y Culex en Cuba (Santamarina et al., 1992, 1996; Santamarina, 1994), India (Gajanana et al., 1978; Chandrahas y Rajagopalan, 1979) y Rusia (Pridantseva et al., 1990; Vladimirova et al., 1990), donde ha evidenciado su efectividad. En México se han realizado estudios de diagnóstico (Pérez et al., 1996; Santamarina et al., 1996) para conocer la capacidad parasítica de los nematodos R. iyengari y R. culicivorax sobre larvas de mosquitos. Sin embargo, para obtener una caracterización completa del potencial de estos nematodos, específicamente de R. iyengari, es necesario evaluar su capacidad para controlar poblaciones en criaderos naturales de larvas de mosquitos. En estudios realizados en Cuba, India, México y Rusia (Gajanana et al., 1978; Chandrahas y Rajagopalan, 1979; Vladimirova et al., 1990; Santamarina et al., 1992, 1993, 1996; Santamarina, 1994; Pérez et al., 1998), se ha planteado que las larvas de los ínstares tres y cuatro son menos susceptibles al parasitismo de los nematodos, en comparación con los dos primeros. Pero aún no se ha estudiado específicamente el potencial parasítico de R. iyengari sobre larvas de los ínstares III y IV, ni la continuidad de su biología en larvas, pupas y adultos parasitados. En este estudio se realizaron experimentos de laboratorio con el objetivo de determinar la capacidad parasítica de R. iyengari sobre larvas de Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis y Cx. quinquefasciatus de III y IV ínstares, así como el desarrollo del nematodo en las fases de pupa y adulto. Así mismo, se evaluó el control de este nematodo sobre poblaciones naturales de larvas de An. pseudopunctipennis, en 10 criaderos naturales en Pochutla, Estado de Oaxaca, México. MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico Se obtuvieron larvas de los ínstares tercero y cuarto del mosquito Cx. quinquefasciatus y los nematodos preparasíticos de R. iyengari de la planta de producción masiva de nematodos ubicada en las instalaciones del CIIDIR-IPN Oaxaca. Las larvas de Ae. aegypti y de An. pseudopunctipennis se recolectaron en criaderos naturales localizados en los alrededores de las instalaciones del CIIDIR-IPN Oaxaca y en comunidades de la región de la costa del Estado de Oaxaca, México. Las larvas se capturaron con una red de 10 cm de diámetro por 20 cm de profundidad de tela de malla de nylon. Se transportaron en agua del criadero al laboratorio donde fueron seleccionadas para los bioensayos. Romanomermis iyengari, a species native to India and used for the first time in México in the State of Oaxaca (Pérez et al., 1996). R. iyengari has been evaluated in the laboratory and in the field in different species of Aedes, Anopheles and Culex in Cuba (Santamarina et al., 1992, 1996; Santamarina, 1994), India (Gajanana et al., 1978; Chandrahas and Rajagopalan, 1979) and Russia (Pridantseva et al., 1990; Vladimirova et al., 1990), where its effectiveness has been demonstrated. In México, diagnostic studies have been made (Pérez et al., 1996; Santamarina et al., 1996) to find out the parasitic capacity of the nematodes R. iyengari and R. culicivorax on mosquito larvae. However, in order to obtain a complete characterization of the potential of these nematodes, specifically of R. iyengari, it is necessary to evaluate its capacity for controlling populations in natural rearing sites of mosquito larvae. In studies carried out in Cuba, India, México and Russia (Gajanana et al., 1978; Chandrahas and Rajagopalan, 1979; Vladimirova et al., 1990; Santamarina et al., 1992, 1993, 1996; Santamarina, 1994; Pérez et al., 1998), it has been suggested that the larvae of instars III and IV are less susceptible to the parasitism of the nematodes, in comparison with the first two. However, no specific studies have been made of the parasitic potential of R. iyengari on larvae of instars III and IV, nor of the continuity of its biology in parasitized larvae, pupae and adults. In this study, laboratory experiments were performed with the objective of determining the parasitic capacity of R. iyengari in larvae of Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis and Cx. quinquefasciatus of instars III and IV, as well as the development of the nematode in the phases of pupa and adult. Furthermore, an evaluation was made of the control of this nematode over natural larvae populations of An. pseudopunctipennis, in 10 natural rearing sites in Pochutla, State of Oaxaca, México. MATERIALS AND METHODS Biological material Larvae were obtained of the third and fourth instars of the mosquito Cx. quinquefasciatus and the preparasitic nematodes of R. iyengari from the mass production plant of nematodes located in the installations of CIIDIR-IPN Oaxaca. The larvae of Ae. aegypti and An. pseudopunctipennis were collected in natural breeding sites located in the vicinity of the CIIDIR-IPN Oaxaca installations and in communities of the coastal region of the state of Oaxaca, México. The larvae were captured with a net 10 cm in diameter by 20 cm in depth, of nylon mesh cloth. They were transported in water from the rearing site to the laboratory, where they were selected for the biotests.

3 PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 415 Cría del mosquito Cx. quinquefasciatus Rearing of the mosquito Cx. quinquefasciatus Para iniciar la cría de Cx. quinquefasciatus se recolectaron huevecillos, larvas y pupas en agua sucia de estanques y de floreros de panteones de la Ciudad de Oaxaca, México. Para su desarrollo este material biológico se colocó en bandejas de plástico de cm con agua. Las pupas se recolectaron diariamente y se depositaron en un recipiente de plástico ( ) cm con agua y se colocó en una jaula entomológica ( cm). Los adultos se alimentaron con azúcar y agua azucarada; a las hembras se les proporcionó alimento de sangre de pollo. Los huevecillos depositados por las hembras en la superficie del agua se recolectaron diariamente, colocándolos en bandejas de plástico ( cm) con agua, para su eclosión. En estas bandejas se desarrollaron las larvas, las cuales recibieron alimento para peces tilapia (Apitilapia nivel 1) previamente molido, cada 2 d. Las pupas se trasladaron a jaulas de emergencia para adultos y el ciclo se repitió para disponer continuamente de material biológico para los bioensayos y cría del nematodo. Cría del nematodo R. iyengari Se depositaron cinco grupos de aproximadamente 200 huevecillos de mosquito Cx. quinquefasciatus en bandejas de plástico ( cm) con 4 L de agua. Cuando las larvas alcanzaron el segundo ínstar (4 a 5 d) se infestaron con nematodos preparasíticos (juvenil 2) de R. iyengari, aplicando una dosis de cinco nematodos por larva de mosquito. Los nematodos procedían de cultivos con seis semanas de almacenamiento. Estos cultivos se inundaron con agua destilada para inducir la eclosión de los huevecillos y la emergencia de preparasíticos infectivos del sustrato. Cuatro horas después de inundados los cultivos, el agua se decantó y se calculó la concentración de nematodos en la solución mediante el método de dilución volumétrica (Petersen y Willis, 1972), para determinar el volumen necesario a aplicar en las infestaciones. Después de 8 d, las larvas del mosquito murieron y flotaron en la superficie indicando el término de la fase parasítica del nematodo (juvenil 3). Las larvas muertas de mosquito se pasaron a un tamiz sumergido parcialmente en una bandeja con agua limpia, de tal manera que al retirar el tamiz se permitió la separación de las larvas muertas del mosquito y de los nematodos emergidos (juvenil 4), que se fueron al fondo de la bandeja. Estos nematodos se depositaron en recipientes de plástico ( cm) con arena (previamente esterilizada) inundada con agua destilada. Dos horas después se eliminó el agua y se taparon los recipientes para almacenarse durante seis semanas, con el propósito de que los nematodos alcanzaran su madurez sexual, copularan y ovipositaran. Experimentos en laboratorio Se establecieron tres experimentos, uno para cada especie de mosquito, en el laboratorio, en las instalaciones del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) unidad Oaxaca, del Instituto Politécnico Nacional (IPN), ubicado en Oaxaca, México. To initiate the rearing of Cx. quinquefasciatus, eggs, larvae and pupae were collected from dirty water from ponds and flower pots of cemeteries of the city of Oaxaca, México. This biological material was placed to be developed in cm plastic containers with water. The pupae were collected daily and deposited in a cm plastic recipient with water and placed in an entomological cage ( cm). The adults were fed with sugar and sugared water; the females were provided with chicken blood feed. The eggs deposited by the females on the surface of the water were collected daily, and placed in plastic recipients ( cm) with water for their eclosion. The larvae developed in these recipients, receiving tilapia feed fish (Apitilapia level 1) which had been previously ground, every 2 d. The pupae were transferred to emergence cages for adults, and the cycle was repeated, in order to have a continuous supply of biological material for the biotests and rearing of the nematode. Rearing of the nematode R. iyengari Five groups of approximately 200 Cx. quinquefasciatus mosquito eggs were deposited in plastic containers ( cm) with 4 L of water. When the larvae reached the second instar (4 to 5 d), they were infested with preparasitic nematodes (juvenile 2) of R. iyengari, applying a dose of five nematodes per mosquito larva. The nematodes were taken from cultures which had been stored for six weeks. These cultures were flooded with distilled water to induce the eclosion of the eggs and the emergence of infective preparasites from the substrate. Four hours after flooding the cultures, the water was decanted, and the concentration of nematodes in the solution was calculated by means of the volumetric dilution method (Peterson and Willis, 1972), to determine the necessary volume to apply in the infestations. After 8 d, the mosquito larvae died and floated on the surface, initiating the end of the parasitic phase of the nematode (juvenile 3). The dead mosquito larvae were passed to a sieve which was partially submerged in a recipient with clean water, so that when the sieve was removed, the dead mosquito larvae were separated from the emerged nematodes (juvenile 4), which sank to the bottom of the recipient. These nematodes were deposited in plastic containers ( cm) with sand (previously sterilized) filled with distilled water. Two hours later, the water was eliminated, and the containers were covered to be stored for six weeks, so that the nematodes could reach their sexual maturity, copulate and deposit eggs. Experiments in the laboratory Three experiments were established, one for each species of mosquito, in the installations of the Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), Oaxaca unit, of the Instituto Politécnico Nacional (IPN), located in Oaxaca, México. The biotests were carried out in plastic containers ( cm) with 500 ml of distilled water and 100 mosquito larvae, to which 1000 R. irengari preparasitic nematodes were added by means of a

4 416 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004 Los bioensayos se realizaron en bandejas de plástico ( cm) con 500 ml de agua destilada y 100 larvas de mosquitos, a las que se adicionaron con pipeta 1000 nematodos preparasíticos R. iyengari. Como testigo se utilizó un grupo de 100 larvas de tercer ínstar, sin aplicación de nematodos, para determinar el tiempo de supervivencia de los adultos desde la emergencia hasta su muerte, en comparación con adultos provenientes de larvas expuestas al tratamiento con nematodos. Tres días después de las aplicaciones se recolectaron 20 larvas o pupas y se depositaron individualmente en frascos de plástico con 30 ml de agua destilada. Los frascos se taparon con una cinta plástica (parafilm) con perforaciones, para que no escaparan los adultos. Con un microscopio estereoscópico en cada frasco se cuantificó el número de mosquitos con y sin nematodos, para calcular el porcentaje de parasitismo (PP). También se cuantificó el número de nematodos emergidos de los mosquitos parasitados para calcular las medias de infestación (MI). Las larvas restantes se conservaron en bandejas dentro de jaulas de madera forradas con tela mosquitera, para cuantificar el tiempo de emergencia de adultos y registrar su tiempo de vida, con o sin la aplicación de nematodos. Los adultos emergidos en las jaulas se alimentaron con azúcar y agua azucarada para dar seguimiento al ciclo de vida del mosquito. Para observar el desarrollo parasítico del nematodo se disectaron cinco ejemplares de larvas, pupas y adultos parasitados de cada especie de mosquito. Experimentos en campo El estudio de campo se realizó en las comunidades El Zapote y San Bernardino, Tonameca, en Pochutla, Oaxaca, México, ubicadas en altitudes de 100 a 150 m. Se seleccionaron 10 criaderos naturales de larvas de An. pseudopunctipennis; el tamaño de los cuerpos de agua para los tratamientos varió de 11 a 114 m 2 y el testigo fue de 8 m 2. Antes de las aplicaciones de nematodos en los criaderos se determinó la densidad larval pretratamiento (DLpre) utilizando un colector cónico (20 cm diámetro y 20 cm profundidad) con un mango (1 m longitud), realizando 10 caladas por criadero (Dubitsky, 1978). Se aplicaron nematodos a una densidad de 3000 por m 2 con mochilas aspersoras de espalda marca Swiss Mex-82 (Jas cañera, 15 L), adaptando un aguilón de 1.5 m de longitud para lograr mayor cobertura de la aplicación. En el criadero testigo no se aplicaron nematodos. Tres días después de las aplicaciones de nematodos se recolectaron 20 larvas o pupas de An. pseudopunctipennis por criadero y se disectaron bajo un microscopio estereoscópico para registrar los PP y las MI. Cinco días después de las aplicaciones de nematodos se determinó la densidad larval postratamiento (DLpos) para determinar la efectividad de las aplicaciones. Se calculó el porcentaje de reducción (PR) de la población larval de mosquitos en cada criadero, de acuerdo con la ecuación de Lawrence y Mulla (1979): pipette. As a control, a group of third instar larvae were used, without the nematode application, to determine the time of survival of the adults from emergence until death, compared to adults from larvae which had been exposed to the nematode treatment. Three days after the applications, 20 larvae or pupae were collected and individually deposited in plastic jars with 30 ml of distilled water. The jars were covered with plastic tape which had been perforated, so that the adults could not escape. With a stereoscopic microscope, the mosquitoes were quantified in each jar with and without nematodes, in order to calculate the percentage of parasitism (PP). In addition, a quantification was made of the nematodes which had emerged from the parasitized mosquitoes, to thus calculate the means of infestation (MI). The remaining larvae were kept in containers within wooden cages covered with mosquito netting, in order to quantify the time of emergence of adults and to register their life span, with or without the application of nematodes. The adults which had emerged in the cages were fed with sugar and sugared water to permit the continuity of the life cycle of the mosquito. In order to observe the parasitic development of the nematode, five examples of larvae, pupae and parasitized adults of each mosquito species were dissected. Experiments in the field The field study was carried out in the communities of El Zapote and San Bernadino, Tonameca, in Pochutla, Oaxaca, México, located at altitudes from 100 to 150 m. Ten natural breeding sites of An. pseudopunctipennis larvae were selected; the size of the bodies of water for the treatments varied from 11 to 114 m 2, and the control was 8 m 2. Before the nematodes were applied in the breeding sites, the pretreatment larval density (DLpre) was determined using a conical collector (20 cm in diameter and 20 cm in depth) with a handle (1 m in length), with 10 samplings per site (Dubitsky, 1978). Nematodes were applied at a density of 3000 per m 2 with a Swiss Mex-82 (Jas cañera, 15 L) back pack sprayer, adapting a 1.5 m long nozzle in order to achieve greater coverage of the application. Nematodes were not applied in the control breeding site. Three days after the nematode applications, 20 larvae or pupae of An. pseudopunctipennis were collected per breeding site, and were dissected under a stereoscopic microscope to register the PP and the MI. Five days after the nematode application, the posttreatment larval density (DLpos) was determined to calculate the effectiveness of the applications. The percentage of reduction (PR) was calculated for the larval mosquito population in each breeding site, according to the equation of Lawrence and Mulla (1979): PR= 100 [(C1/T1 T2/C2) 100] where C 1 = DLpre in the control; C 2 = DLpos in the control; T 1 = DLpre in the treatment; T 2 = DLpos in the treatment. PR= 100 [(C 1 /T 1 T 2 /C 2 ) 100] Statistical analysis donde C 1 = DLpre en el testigo; C 2 = DLpos en el testigo; T 1 = DLpre en el tratamiento; T 2 = DLpos en el tratamiento. The laboratory experiments were established with a completely random experimental design with six repetitions per treatment (larvae

5 PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 417 Análisis estadístico Los experimentos en laboratorio se establecieron con un diseño experimental completamente al azar con seis repeticiones de dos tratamientos (larvas de tercer y cuarto ínstares de cada especie). Se hizo un análisis de varianza (SAS, 2000) y una comparación de medias mediante la prueba de (Tukey, p 0.05) para los datos de PP y MI. Para determinar la efectividad de las aplicaciones de nematodos en la reducción poblacional de larvas de mosquito en campo, se compararon los datos de DLpre con los de DLpos mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon (p 0.05), (SAS, 2000). Los datos de PP y MI no se analizaron estadísticamente por carecer de información para comparar los criaderos. RESULTADOS Experimentos en laboratorio Los PP y las MI causados por R. iyengari en larvas de tercer y cuarto ínstares de Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis y Cx. quinquefasciatus fueron mayores en larvas del tercer ínstar en las tres especies (Cuadro 1). Hubo diferencia significativa (p ) en los resultados de larvas de tercer y cuarto ínstares y se comprobó que los PP y las MI fueron estadísticamente diferentes (Tukey, p 0.05). Las larvas de An. pseudopunctipennis fueron más susceptibles al parasitismo. En las fases de larva, pupa y adulto de las tres especies hubo desarrollo de la fase parasítica del nematodo, la cual no es afectada por la metamorfosis del mosquito, debido a que su desarrollo biológico fue normal hasta la emergencia del nematodo, provocando la muerte del mosquito adulto. La fase parasítica del nematodo se localizó en la región del tórax y abdomen de los mosquitos adultos, ocurriendo la emergencia de los postparásitos del nematodo por la parte posterior del abdomen. La vida de los adultos en la población tratada fue de 3 a 6 d (cuando el nematodo terminó su fase parasítica), en tanto que en el testigo fue de 40 d. La mayoría de los mosquitos parasitados murieron en la superficie del agua de la bandeja, lo que permitió observar en el fondo los nematodos postparásitos emergidos. Experimentos en campo Los resultados de parasitismo, infestación y reducción poblacional ocasionados por el nematodo R. iyengari en larvas de An. psudopunctipennis en criaderos naturales se muestran en el Cuadro 2. Los PP variaron de 90 a 100% ( x = 93%) y las MI de 1.8 a 3.1 nematodos larva 1 ( x = 2.3%). Los porcentajes de reducción poblacional variaron de 82.2 a 99.0% ( x = 92.8%) en los 10 criaderos. of the third and fourth instar of each species). A variance analysis was made (SAS, 2000), as well as a means comparison with the Tukey test (p 0.05) for the data of PP and MI. To determine the effectiveness of the nematode applications on the populational reduction of the mosquito larvae in the field, the data of DLpre was compared with that of DLpos by means of the rank test with Wilcoxon sign (p 0.05), (SAS, 2000). The data of PP and MI was not statistically analyzed, as there was not enough information to compare the breeding sites. RESULTS Laboratory experiments The PP and MI caused by R. iyengari in third and fourth instar larvae of Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis and Cx. quinquefasciatus were greater in third instar larvae in the three species (Table 1). There was a significant difference (p ) in the results of the third and fourth instar larvae, and it was demonstrated that the PP and the MI were statistically different (Tukey, p 0.05). The larvae of An. pseudopunctipennis were more susceptible to the parasitism. In the phases of larva, pupa and adult of the three species, there was development in the parasitic phase of the nematode, which is not affected by the metamorphosis of the mosquito, because their biological development was normal until the emergence of the nematode, causing the death of the adult mosquito. The parasitic phase of the nematode was located in the region of the thorax and abdomen of the adult mosquitoes, and the emergence of the nematode postparasites occurred through the posterior part of the abdomen. The life of the adults in the treated population was from 3 to 6 d (when the nematode finished its parasitic phase), whereas in the control, it was 40 d. Most of the parasitized mosquitoes died on the surface Cuadro 1. Parasitismo e infestación de R. iyengari en larvas de III y IV ínstares de tres especies de mosquitos. Table 1. Parasitism and infestation of R. iyengari in III and IV instar larvae of three species of mosquitoes. Especie Ínstar Parasitismo Media de (%) infestación Ae. aegypti III 88.3 a 2.4 a IV 80.0 b 1.5 b An. pseudopunctipennis III 96.7 a 4.1 a IV 85.8 b 2.5 b Cx. quinquefasciatus III 91.7 a 3.4 a IV 80.8 b 1.7 b Medias con letras distintas en una columna son significativamente diferentes (p 0.05).

6 418 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004 Cuadro 2. Reducción poblacional, parasitismo e infestación de R. iyengari en larvas de An. pseudopunctipennis en Oaxaca, México. Table 2. Populational reduction, parasitism and infestation of R. iyengari in larvae of An. pseudopunctipennis in Oaxaca, México. Criadero natural Área DLpre DLpos Reducción Parasitismo Media de (m 2 ) (larvas m 2 ) (larvas m 2 ) poblacional (%) (%) infestación a 19.0 b a 12.0 b a 4.0 b a 25.0 b a 5.0 b a 7.0 b a 1.0 b a 2.0 b a 4.0 b a 1.0 b Testigo Promedio Medias con letras distintas son significativamente diferentes (p 0.05). La prueba de rangos con signo de Wilcoxon detectó diferencia significativa (p 0.001) entre las DLpre y DLpos. Además, hubo reducción poblacional por el efecto de la aplicación de nematodos. DISCUSIÓN En los estudios de laboratorio se encontró que R. iyengari parasita eficientemente larvas de mosquitos en los últimos ínstares de desarrollo, con una dosis de 10 nematodos larva 1. Los valores de parasitismo y de infestación muestran que las larvas del tercer ínstar fueron más susceptibles, en comparación con las del cuarto, lo que se atribuye al menor grosor de la pared cuticular de las primeras a consecuencia de un menor depósito de quitina, que facilita la invasión de los nematodos preparasíticos (Petersen, 1975; Santamarina, 1994). En las larvas del cuarto ínstar se observó que influyen otros factores en los niveles de parasitismo, como el menor tiempo de exposición del cuarto ínstar a los nematodos preparasíticos debido a la proximidad de transformación a pupa, y los movimientos más fuertes de desplazamiento como reacción al ataque de los nematodos preparasíticos; esto dificulta su acción cuando intentan insertar su estilete. La mayoría de los mosquitos parasitados murieron en la superficie del agua de la bandeja, donde se observó la emergencia de los postparásitos; esto permite sugerir que las larvas parasitadas en los ínstares tercero y cuarto se desarrollan hasta adultos, y pueden ser un vehículo para la dispersión de los parásitos de forma natural en criaderos cercanos donde se apliquen nematodos. Petersen y Willis (1972) y Kurihara y Maeda (1980) mencionaron que larvas infestadas en el cuarto ínstar permiten que los adultos diseminen R. culicivorax en of the water in the container, which made it possible to observe the emerged post-parasitic nematodes at the bottom. Field experiments The results of parasitism, infestation and populational reduction caused by the nematode R. iyengari in An. pseudopunctipennis in natural rearing sites are shown in Table 2. The PP varied from 90 to 100% ( x = 93%), and the MI from 1.8 to 3.1 nematodes larva 1 ( x = 2.3%). The percentages of populational reduction varied from 82.2 to 99.0 % ( x = 92.8%) in the 10 breeding sites. The Wilcoxon signed rank test detected a significant difference (p 0.001) between the DLpre and DLpos. Furthermore, there was a populational reduction due to the effect of the application of nematodes. DISCUSSION In the laboratory studies, it was found that R. iyengari efficiently parasitizes mosquito larvae in the final instars of development, with a dose of 10 nematodes larva 1. The values of parasitism and infestation show that the third instar larvae were more susceptible compared with those of the fourth, which is attributed to the reduced thickness of the cuticular wall due to a reduction in the deposition of chitin, which facilitates the invasion of the preparasitic nematodes (Petersen, 1975; Santamarina, 1994). In the fourth instar larvae, it was observed that other factors influence the levels of parasitism, such as the shorter time of exposure of the fourth instar to the preparasitic nematodes due to the proximity of the transformation to pupa, and to the stronger movements of displacement as a reaction

7 PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 419 criaderos naturales, facilitando el establecimiento de nematodos de forma natural. Esto se ha comprobado con la distribución geográfica natural del nematodo R. culicivorax en un área restringida de Louisiana y Florida, EE.UU. (Savage y Petersen, 1971; Poinar, 1979). Por tanto, sería adecuado agregar la presencia de un mosquito adulto al esquema del ciclo vital del nematodo (Figura 1), debido a que se ha señalado el desarrollo de este ciclo únicamente sobre larvas. El corto período de vida de los mosquitos adultos parasitados (3 a 6 d) evidencia que los provenientes de larvas parasitadas no serían vectores de enfermedades como paludismo y dengue, debido a que en este tiempo de vida el patógeno causante de estas enfermedades no logra incubarse (Dirección General de Epidemiología, 1990). En comparación, los mosquitos no parasitados y alimentados con agua azucarada murieron hasta 40 d después. En las larvas de An. pseudopunctipennis se presentó mayor parasitismo e infestación, atribuibles a su conducta típica: además de alimentarse en la superficie del agua, para respirar adoptan una posición paralela al plano superficial del agua, debido a que carecen de sifón respiratorio. Esta conducta las hace más vulnerables al ataque del nematodo; por tanto, aumenta la posibilidad de contacto con los nematodos preparasíticos que tienen el hábito de vivir en la superficie del agua (geotropismo negativo). Ae. aegypti y Cx. quinquefasciatus respiran en la superficie del agua por medio de un sifón respiratorio, y adoptan una posición oblicua a la superficie del agua y se alimentan de la materia orgánica depositada en el sustrato de los criaderos, conducta que disminuye la posibilidad de encuentro con los nematodos preparasíticos (Ross y Smith, 1976). Estos resultados coinciden con los de Santamarina (1994), que observó mayor parasitismo de R. iyengari sobre larvas de Anopheles albimanus, en comparación to the attack of the preparasitic nematodes; thus it is difficult for the nematode to insert its stylet. Most of the parasitized mosquitoes died on the surface of the water in the container, where the emergence of the post-parasites was observed. Therefore, it can be suggested that the parasitized larvae in the third and fourth instars develop into adults, and can be a vehicle for the dispersal of the parasites in a natural form in breeding sites in the vicinity of where the nematodes are applied. Petersen and Willis (1971), and Kurihara and Maeda (1980) mentioned that the infestation of larvae in the fourth instar makes it possible for the adults to disseminate R. culicivorax in natural breeding areas, thus facilitating the establishment of nematodes in a natural form. This has been demonstrated with the natural geographic distribution of the nematode R. culicivorax in a restricted area of Louisiana and Florida, U.S.A. (Savage and Petersen, 1971; Poinar, 1979). Therefore, it would be adequate to add the presence of an adult mosquito to the diagram of the life cycle of the nematode (Figure 1), due to the fact that the development of this cycle has only been shown with larvae. The short life span of the parasitized adult mosquitoes (3 to 6 d) shows that those adults which come from parasitized larvae would not be vectors of diseases such as malaria and dengue, because in that period of time the pathogen which causes these diseases does not have enough time to incubate (Dirección General de Epidemiología, 1990). On the other hand, the nonparasitized mosquitoes fed with sweetened water died up to 40 d later. The larvae of An. pseudopunctipennis presented a greater degree of parasitism and infestation as a result of its typical behavior; in addition to feeding on the surface of the water, it adopts a position parallel to the surface plane of the water in order to breathe, due to the fact that Mosquito adulto Nematodos preparasíticos (5 d) Emergencia del nematodo ocasionando la muerte del hospedero Adultos Etapa parásita 5-10 d 1 mes Eclosión de huevecillos Posparásitos 1 semana Oviposición Huevecillos Figura 1. Ciclo vital del nematodo R. iyengari, parásito de larvas de mosquitos. Figure 1. Life cycle of the nematode R. iyengari, parasite of mosquito larvae.

8 420 AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004 con Cx. quinquefasciatus, Cx. nigripalpus y Uranotaenia saphirina; y con los de Santamarina et al. (1996), quienes registraron mayor parasitismo de R. culicivorax en larvas de An. pseudopunctipennis en relación con Cx. quinquefasciatus. Petersen (1975) determinó que tres especies de Anopheles fueron más susceptibles que especies de Aedes y Culex a la capacidad parasítica de R. culicivorax (antes llamado Reesimermis nielseni). Con los resultados del experimento de campo se evidencia que R. iyengari es un agente efectivo para reducir poblaciones de larvas de An. pseudopunctipennis en el área de estudio. Los altos valores de PP (90 a 100%), MI (1.8 a 3.1 nematodos larva 1 ) y reducción poblacional (82.2 a 99.0%) se atribuyen a la pequeña extensión de los criaderos (11 a 114 m 2 ) y a que el agua estaba estancada, lo que facilitó una aplicación uniforme de los nematodos favoreciendo su acción al tener mayor oportunidad de búsqueda de las larvas de mosquito. Pérez et al. (1998) determinaron valores similares de PP (85 a 95%), MI de 5.2 nematodos larva 1, y reducción poblacional de 94 a 96%, en cinco criaderos de 15 a 25 m 2 de área en An. pseudopunctipennis. También Santamarina et al. (1992 y 1993) obtuvieron resultados semejantes: PP 75 a 100%, MI 1.2 a 3.0 nematodos larva 1 y reducción poblacional de 80 a 96%, en criaderos de 12 a 80 m 2 de área en An. albimanus, Cx. quinquefasciatus y Cx. nigripalpus. Los valores de PP, Mi y reducción poblacional pueden presentar mayor variación en criaderos de grandes extensiones y presencia de agua corriente, debido a que no es fácil garantizar la aplicación uniforme de nematodos en toda el área del criadero, por las grandes extensiones, irregularidades topográficas e hidrológicas del área, y al arrastre del inóculo ocasionado por el agua corriente, lo cual disminuye la densidad de nematodos por m 2 y, por consiguiente, su efectividad. CONCLUSIONES R. iyengari (10 nematodos larva 1 ) parasita eficientemente larvas de los ínstares tercero y cuarto de los mosquitos Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis y Cx. quinquefasciatus. Las larvas del tercer ínstar son más susceptibles. Las larvas de An. pseudopunctipennis son más susceptibles que las de Ae. aegypti y Cx. quinquefasciatus. El nematodo reduce drásticamente las poblaciones de larvas de An. pseudopunctipennis en condiciones naturales. El desarrollo de la fase parásita del nematodo transcurre normalmente a través de las fases pupal y adulta del mosquito, sin interrumpir su proceso biológico, pero los mosquitos adultos que emergen de larvas parasitadas mueren de tres a seis días después de emerger. it lacks a respiratory siphon. This behavior makes it more vulnerable to the attack of the nematode; therefore, increases the possibility of contact with the preparasitic nematodes, which have the habit of living on the surface of the water (negative geotropism). Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus breathe on the surface of the water through a respiratory siphon, and adopt a position oblique to the surface of the water, feeding on the organic material deposited in the substrate of the rearing sites, thus reducing the possibility of encountering the preparasitic nematodes (Ross and Smith, 1976). The results coincide with those of Santamarina (1994), who observed a greater parasitism of R. iyengari in larvae of Anopheles albimanus, with respect to Cx. quinquefasciatus, Cx. nigripalpus and Uranotaenia saphirina; as well as with those of Santamarina et al. (1996), who registered a greater parasitism of R. culicivorax in larvae of An. pseudopunctipennis with respect to Cx. quinquefasciatus. Petersen (1975) determined that three species of Anopheles were more susceptible than species of Aedes and Culex to the parasitic capacity of R. culicivorax (previously named Reesimermis nielseni). With the results of the field experiment, it is shown that R. iyengari is an effective agent in the reduction of populations of An. pseudopunctipennis larvae in the area of study. The high values of PP (90 to 100%), MI (1.8 to 3.1 nematodes larva 1 ) and populational reduction (82.2 to 99.0%) are attributed to the limited extension of the breeding areas (11 to 114 m 2 ), and to the fact that the water was stagnant, which facilitated a uniform application of the nematodes, favoring their action by providing a greater opportunity to find mosquito larvae. Pérez et al. (1998) determined similar values of PP (85 to 95%), MI of 5.2 nematodes larva 1, and populational reduction of 94 to 96%, in five breeding sites between 15 and 25 m 2 in area in An. pseudopunctipennis. Santamarina et al. (1992 and 1993) also obtained similar results: PP 75 to 100%, MI 1.2 to 3.0 nematodes larva 1 and populational reduction of 80 to 96%, in breeding sites 12 to 80 m 2 in area in An. albimanus, Cx. quinquefasciatus and Cx. nigripalpus. The values of PP, MI and populational reduction may present a greater variation in large scale breeding sites and in the presence of running water, due to the fact that it is not easy to guarantee the uniform application of nematodes in the entire breeding area, because of its large dimensions, topographical and hydrological irregularities of the area, and the dragging of the inocula caused by the flowing water, which reduces the density of nematodes per m 2, and consequently, their effectiveness. CONCLUSIONS R. iyengari (10 nematodes larva 1 ) efficiently parasitize larvae of the third and fourth instars of the

9 PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 421 LITERATURA CITADA Chandrahas, R. K., and P. K. Rajagopalan Mosquito breeding and the natural parasitism of larvae by a fungus Coelomomyces and mermithid nematode Romanomermis in paddy fields in Pondicherry. Indian J. Med. Res. 69: Dirección General de Epidemiología Dengue hemorrágico. Sistema Nacional de Salud México. Boletín trimestral 4: Dubitsky, A. M Métodos de Control Biológico de los Dípteros Hematófagos en Rusia. Tomo 1. Editorial Ac. Alma Atá, Rusia. Gajanana, A., S. J. Kazmin, U. S. Bheema Rao, S. G. Suguna, and R. K. Chandrajas Studies on a nematode parasite (Romanomermis sp.: Mermithidae) of mosquito larvae isolated in Pondicherry. Indian J. Med. Res. 68: Kurihara, T., and R. Maeda Observations on the development of the nematode parasite Romanomermis culicivorax. Mosquito News 40: Lawrence, L., and M. S. Mulla Field evaluation of Diflubenzurón (Dimilin) against Simulium larvae. Mosquito News 39: Pérez P., R., A. Santamarina M., y S. Martínez T Control biológico de larvas de mosquitos transmisores del paludismo con nematodos parásitos en Oaxaca, Méx. Rev. Inv. Hoy. Instituto Politécnico Nacional. Nov.-Dic. pp: Pérez P., R., A. Santamarina M., S. H. Martínez, y G. Flores A Susceptibilidad de las larvas de Anopheles pseudopunctipennis al parasitismo del nematodo Romanomermis iyengari, estado de Oaxaca, México. Rev. Cub. Med. Trop. 50: Petersen, J. J Penetration and development of the mermithid nematode Reesimermis nielseni in eighteen species of mosquitoes. J. Nematol. 17: Petersen, J. J., and O. R. Willis Procedures for the mass rearing of a mermithid parasite of mosquitoes. Mosquito News, 32(2): Poinar, G. O. Jr Nematodes for Biological Control and Insects. CRC Press. Boca Ratón, Florida, USA. 227 p. Pridantseva, E. A., N. I. Lebedeca, Z. P. Sheherban, and M. K. Kadyrova An evaluation of the possibility for mosquito control in Vzbekistan. Med. Parazitol. (Mosk) 1: Ross, J. F., and S. M. Smith A review of the mermithid parasites (Nematode: Mermithid) described from North America mosquitoes (Diptera: Culicidae) with description of three new species. Can. J. Zool. 54: Santamarina M., A Actividad parasitaria de Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermithidae) en criaderos naturales de larvas de mosquitos. Miscelánea Zool. 17: mosquitoes Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis and Cx. quinquefasciatus. The third instar larvae are the most susceptible. The larvae of An. pseudopunctipennis are more susceptible than those of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus. The nematode drastically reduces the larvae populations of An. pseudopunctipennis in natural conditions. The development of the parasitic phase of the nematode normally occurs through the pupal and adult phases of the mosquito, without interrupting its biological process, but the adult mosquitoes which emerge from the parasitized larvae die from three to six days after emergence. End of the English version Santamarina M., A., I. García A., y R. González B Capacidad infestiva del nematodo parásito Romanomermis iyengari en larvas de mosquitos en condiciones naturales. Rev. Cub. Med. Trop. 44: Santamarina M., A., I. García A., y R. González B Valoración de la capacidad infectiva del nematodo parásito Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermitidae) en criaderos naturales de larvas de mosquitos. Rev. Cub. Med. Trop. 45: Santamarina M., A., G. Ruiz M., A. Rodríguez E., A. Bustamante H., and R. Pérez P Efectiveness of Romanomermis culicivorax in Anopheles pseudopunctipennis and Culex quinquefasciatus in México. Miscelánea Zool. 19: SAS Institute The SAS system for Windows. Release SAS Institute. Cary, N. C. Savage, K. E., and J. J. Petersen Observations of mermithid nematodes in Florida mosquitoes. Mosquito News 31: Secretaría de Salud Situación epidemiológica del paludismo en la República Mexicana. Boletín de paludismo y otras enfermedades transmitidas por vector. Dirección General de Epidemiología, Secretaría de Salud México 8: Vladimirova, V. V., E. A. Pridantseva, A. K. Gafurov, and M. E. Muratova A trial of Romanomermis iyengari and R. culicivorax mermithids as a means for controlling blood-sucking mosquitoes in the Tadznik. Med. Parazitol. (Mosk) 3: 42-5.