ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y TOXICIDAD AGUDA DE FRUTOS DE PROSOPIS ALBA

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1 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y TOXICIDAD AGUDA DE FRUTOS DE PROSOPIS ALBA Aristimuño E., Reynoso M. Instituto de Biología, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Chacabuco 461, (4000), Tucumán, Argentina. Tel: , Tutor: Mg. Daud, Adriana Director: Dra. Sanchez-Riera, Alicia mareynosofbqf@hotmail.com Palabras claves algarrobo, antioxidante, fruto algarrobo, antioxidante, fruto

2 Introducción La generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) es una consecuencia inevitable de la vida en un ambiente aeróbico. La principal característica de dichas especies es su alta reactividad química que incluye tanto radicales libres (especies con uno o más electrones desapareados) y especies no radicales tales como peróxido de hidrógeno. El problema para la salud se evidencia cuando el aumento del contenido intracelular de ERO sobrepasa las defensas antioxidantes de las células, llevando al llamado estrés oxidativo. Pueden inducir efectos en diferentes tejidos produciendo la peroxidación lipídica de las membranas, dañando ácidos nucleicos, lípidos, proteínas y carbohidratos, fenómeno implicado en la fisiopatología de numerosas enfermedades. Para proteger al organismo del efecto oxidativo de los radicales libres se incorporan a la dieta alimentos ricos en sustancias que tienen función antioxidante, tales como los compuestos fenólicos. Dichos compuestos están presentes en verduras y frutos (Vasco y col.,2008). El propósito del presente trabajo fue estudiar los frutos de la especie Prosopis alba de dos localidades rurales del noroeste argentino: Termas de Río Hondo (Santiago del Estero) y Atahona (Tucumán). Dichos frutos constituyen un componente fundamental en la dieta actual de las comunidades de la región. Se consumen en forma directa o preparando productos tales como patay, aloja, arrope, etc. Se usan también con fines medicinales como antidiarreico, diurético, antiinflamatorio (Martínez Crovetto, 1981), etc. La época de recolección (Noviembre-Marzo) se celebra con una fiesta tradicional llamada algarrobeada.

3 Actualmente se usa como ingrediente en la industria para la preparación de productos de panificación (Bernardi, 2006) por su agradable sabor y contenido de azúcares. También se utiliza como sustituto de café y cacao. En fitoterapia se prepara el jarabe natural de algarrobo (Algarrobina) de uso frecuente para distintas patologías, tanto en Latinoamérica como en España. Nuestro objetivo fue determinar el contenido de polifenoles en los extractos para relacionar los mismos con su actividad antioxidante, propiedad no conocida popularmente, pero que resultaría beneficiosa para sus usos en medicina folclórica. Por otra parte se analizó la toxicidad de los extractos mediante experimentos de toxicidad aguda en ratas. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal El material vegetal utilizado en este estudio consistió en frutos (vainas) de Prosopis alba (algarrobo) recogidos durante el período de fructificación y maduración en dos localidades rurales: Termas de Río Hondo (AT) y Atahona (AA). Los especimenes fueron identificados por técnicas morfológicas, anatómicas e histológicas. Preparación de los extractos Se eligió el método de maceración para la obtención de los extractos. Se prepararon extractos de vainas secas en los siguientes solventes: agua (agua destilada estéril), alcohol (etanol 70 %). El secado de las mismas se realizó a temperatura ambiente (22º C) a la sombra, en lugar fresco, seco y en corriente de aire por 15 días. El material seco fue triturado en pequeñas partículas en un mortero. Para preparar el extracto alcohólico, se maceraron 100 g de frutos en 100 ml de solvente, durante 5 días. Para el extracto acuoso, se realizó el mismo procedimiento con 100 ml de agua destilada estéril, durante 2 días. Posteriormente los extractos fueron filtrados a través de papel Whatman Nº 1 y evaporados a sequedad, el extracto alcohólico en un evaporador rotatorio al vacío y el extracto acuoso en liofilizador. Los extractos secos se almacenaron en condiciones estériles a 4 C hasta su uso.

4 Rendimiento El rendimiento de cada extracto se calculó a partir de 100 g de material seco. Determinación del contenido de fenoles totales El contenido de fenoles totales fue determinado por el método de Folin- Ciocalteu (Hua-Bin y col, 2007) con algunas modificaciones. Para la determinación de los resultados se realizó una curva de calibración estándar con ácido gálico (0-10 μg/ml), expresándose los mismos como mg de ácido gálico equivalente (GAE)/100g de material vegetal, y el valor fue calculado como la media ± DE (n = 3). Evaluación de la actividad antioxidante Para evaluar la capacidad antioxidante de los extractos se realizaron dos tipos de ensayos: Actividad depuradora de radicales libres (DPPH): Existen muchos métodos para evaluar la actividad antioxidante en fuentes vegetales tales como plantas medicinales y alimentos. Uno de los más utilizados es el método de neutralización o depuración del radical libre y estable 2,2- difenildipicrilhidracil (DPPH), sustancia que sirve para medir la capacidad de secuestro de cualquier compuesto con actividad antioxidante (Mensor, A., y col, 2001). La solución del reactivo de DPPH es de color violeta y presenta una absorbancia a 517 nm. Los controles positivos de referencia fueron: Quercetina antioxidante natural y butilhidroxitolueno (BHT) antioxidante sintético. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La actividad antioxidante se expresó como porcentaje de depuración del radical DPPH y se determinó mediante la siguiente ecuación (Turkmen, N. 2006): AA %= Abs. Control negativo Abs. Muestra x 100 Abs. Control negativo La concentración efectiva media (CE 50 ), definida como la concentración de la muestra en la que se produce la depuración del 50 % del DPPH, se determina por análisis de regresión lineal (% de actividad vs concentración) de los extractos estudiados.

5 Inhibición de la peroxidación lipídica (Método del β-caroteno-ácido linoleico): La actividad antioxidante de los extractos acuoso y alcohólico se evaluó con el sistema β-caroteno-ácido linoleico, según (Sun y Ho, 2005). La absorbancia fue determinada a 470 nm. La actividad antioxidante (AA) se midió en términos de la capacidad de los extractos de inhibir la decoloración del β-caroteno mediante la siguiente ecuación: AA= [1- (A 0 A t / A 0 0 A t 0 )] x A t valores de absorbancia de los extractos y sustancias de referencia y A 0 control negativo, antes de la incubación. A t valores de absorbancia de los extractos y sustancias de referencia y A 0 control negativo, después de 120 min de incubación. Los resultados se expresaron como % de actividad inhibidora de la oxidación lipídica (Ozsoy y col, 2008). Test de toxicidad aguda Con el fin de estudiar la toxicidad de los extractos de los frutos de Prosopis alba de Termas de Río Hondo se realizó un modelo experimental de toxicidad aguda (Hilaly J, y col, 2004). Para ello se separaron seis grupos de ratas constituidos por 4 animales cada uno. 1- Ratas tratadas con una dosis de 1800 mg por kilo de peso resuspendida en alcohol 70%, administrada por vía oral. 2- Ratas tratadas con una dosis de 3600 mg por kilo de peso resuspendida en alcohol 70%, administrada por vía oral. 3- Ratas tratadas con una dosis de 1800 mg por kilo de peso resuspendida en agua destilada, administrada por vía oral. 4- Ratas tratadas con una dosis de 3600 mg por kilo de peso resuspendida en agua destilada, administrada por vía oral. 5- Ratas tratadas con alcohol 70%, administrado por vía oral (control realizado para descartar el efecto tóxico que podría tener el alcohol). 6- Ratas tratadas con agua destilada, administrada por vía oral (control realizado para obviar el efecto del estrés producido por el manipuleo). Los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento y fueron observados por períodos de 2, 4, 6, 24 y 48 horas hasta 14 días, luego de la administración de los solventes y de los extractos.

6 Para analizar los cambios que podrían experimentar los animales durante este período de intoxicación aguda se realizaron observaciones macroscópicas directas que permiten poner en evidencia modificaciones que se pueden presentar en el pelaje, ojos, mucosas, respiración, comportamiento, peso y sobrevida al final del período experimental. Trascurridos los 14 días, los animales fueron sacrificados para la extracción de los principales órganos como corazón, pulmones, hígado, riñón, bazo, estómago, ciego. Se realizaron determinaciones de peso y observaciones macroscópicas comparativas entre los órganos controles y tratados que podrían mostrar signos de toxicidad aguda debido a efectos deletéreos del extracto. Análisis estadístico El análisis estadístico fue llevado a cabo mediante la prueba t Student. Los resultados fueron expresados como la media ± S.E.M (error estándar de la media) con p< 0,05. RESULTADOS Rendimiento y contenido de fenoles totales Los resultados de la tabla 1 muestran que los porcentajes de rendimiento en material seco de frutos de algarrobo de Atahona es superior para ambos extractos que el de la Termas de Río Hondo. Se evaluó el contenido de fenoles totales en los distintos extractos: acuoso y etanólico preparados de acuerdo a materiales y métodos. Los resultados se expresan como miligramos de equivalente de ácido gálico por gramo de extracto seco (mg GAE /100 g). Extracto de Prosopis alba Rendimiento Extracto total (gr/100gr) Fenoles totales (mg GAE/100 g) AA alcohólico 51,37 16,39 ± 1,11 AA acuoso 44,14 11,14 ± 1,09 AT alcohólico 23,34 45,20 ± 2,03 AT acuoso 25,94 40,90 ± 2,03 Tabla 1: Valores de rendimiento y contenido de fenoles totales de los diferentes extractos.

7 Actividad depuradora (%) Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010 Como se observa en la tabla 1 los extractos acuoso y etanólico de Atahona presentan un contenido menor de fenoles totales a pesar de obtenerse un rendimiento mayor del extracto comparados con los extractos de Termas de Río Hondo. El intervalo asociado a cada valor en esta tabla representa la desviación estándar de los resultados de la medición. Actividad depuradora de radicales libres (DPPH) El radical DPPH es ampliamente utilizado como sistema modelo para investigar la actividad depuradora de radicales libres de los extractos y medir su actividad antioxidante. En el estudio in vitro llevado a cabo en este trabajo se observó que todos los extractos estudiados producen cambios de coloración del radical DPPH. La figura 1 muestra la actividad depuradora de los extractos sobre DPPH en un rango de concentración de 1 a 10 mg/ml. Los resultados indican que los extractos etanólicos de vainas de algarrobo provenientes de ambas zonas, presentaron mayor capacidad depuradora siendo AT 93,15 % y AA 91,00 % a la dosis de 8 mg/ml. Los CE 50 fueron de 1,25 mg/ml y 2,00 mg /ml, respectivamente. Los extractos acuosos muestran una actividad menor a la misma dosis AT 60,25 % y AA 27,25 %. Los CE 50 fueron de 3,22 mg/ml y 13,50 mg/ml, respectivamente. La actividad antioxidante de los controles positivos a una concentración de 1 mg/ml fue para BHT 93,5 % y para Quercetina 93,00 %. Los CE 50 fueron de 84 μg/ml para BHT y 2,90 μg/ml para Quercetina Concentración (mg/ml) E.OL. AT E.AC AT E. OL. AA E. AC. AA Quercetina BHT Figura 1: Capacidad depuradora del radical DPPH

8 Absorbancia Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010 Inhibición de la peroxidación lipídica (Método del β-caroteno-ácido linoleico) Se evaluó el potencial antioxidante de los extractos por el método del β- caroteno. La figura 2 muestra el decrecimiento de la absorbancia de la emulsión de β-caroteno en presencia de 4, 8 y 10 mg/ml de los diferentes extractos. La actividad antioxidante de los extractos de Termas de Río Hondo a la dosis de 8 mg/ml fue mayor siendo para AT etanólico 86,50 % y AT acuoso 77,63 %. La actividad para los extractos de Atahona a la misma dosis fue para AA etanólico 66,15 % y AA acuoso 32,54 %. Los controles de referencia BHT (1 mg/ml) y Quercetina (1 mg/ml) tienen una actividad de 92,50 % y 91,50 % respectivamente. 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 CONTROL BHT 1 mg/ml QUER 1 mg/ml E OL AT 8 mg/ml E AC A T 8 mg/ml E OL AA 8 mg/ml E AC AA 8 mg/ml Tiempo (min) Figura 2: Inhibición de la peroxidación lipídica (método del β-caroteno) Toxicidad aguda Para determinar si los extractos de frutos de algarrobo manifiestan algún efecto tóxico in vivo se desarrolló un modelo experimental de toxicidad aguda en ratas. Los resultados indican que la administración oral en animales de una dosis única de 1800 y 3600 mg de extracto por kilo de peso respectivamente, no produce signos visibles de toxicidad durante 14 días de observación. Es importante destacar que la dosis de 3800 mg/kg es aproximadamente 100 veces superior a la ingesta de frutos consumidas diariamente por los pobladores. No se detectaron variaciones en el consumo de alimentos y agua en los animales tratados. La observación macroscópica de los animales no demostró cambios visibles en el pelaje, ojos y mucosas. El comportamiento y la respiración de los animales

9 tratados fueron normales y no presentaron signos de diarrea o estreñimiento. Al final del período experimental no se evidencia mortalidad en las ratas. Por otro lado al final del ensayo se observó que tanto el peso corporal como el peso de los órganos vitales como hígado, riñón, pulmones, corazón, estómago, ciego, bazo y su apariencia macroscópica son similares al de las ratas controles. Discusión Una terapia antioxidante provee una alternativa para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo ya que se ha demostrado el efecto antioxidante de productos naturales provenientes de diferentes partes de las plantas, entre ellas frutos (Vasco y col, 2008). Un grupo de compuestos naturales, los polifenoles, son potentes antioxidantes presentes en verduras y frutas (Vasco y col, 2008). Los polifenoles pueden proteger la célula contra el daño oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de varias enfermedades causadas por los radicales libres (Cruz Manzano y col, 2004). Los resultados mostraron que el contenido de polifenoles de los extractos de los frutos de algarrobo de Termas de Río Hondo es mayor que el encontrado para el recolectado en Atahona, sugiriendo que esta diferencia se debería a las influencias del habitat donde crece la especie. Por otro lado se observó que los extractos alcohólicos de ambas zonas presentan mayor actividad antioxidante que los extractos acuosos, lo que podría deberse a la distinta polaridad del solvente de extracción. Es bien conocido que en los estudios de intoxicación aguda en animales se considera que un extracto no es tóxico si no se registra tanto mortalidad como alteraciones en signos clínicos durante un período de 48 horas con dosis supraterapéuticas. Los resultados de los experimentos de toxicidad aguda en ratas demuestran que los extractos no producen efectos deletéreos aún a dosis 100 veces superior a la utilizada en la dieta de los pobladores. La actividad antioxidante estudiada sugeriría que las vainas de algarrobo usadas como alimento y en medicina popular podrían proveer de beneficios para la salud, más allá de la nutrición básica.

10 REFERENCIAS - Vasco C.; Ruales J., Kamal-Eldin A., Total phenolic compounds and antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chemistry 111, pp Martinez Crovetto, R, Las plantas utilizadas en medicina popular en el noroeste de Corrientes, República Argentina. Fundación Miguel Lillo, Tucumán, Argentina. - Bernardi C., Drago S., Sabbag N., Sánchez H., Freyre M., Plants Food for Human Nutrition 61, Hua-Bin Li, Ka-Wing C, Chi-Chun W., King-Wai Fan, Feng C, Yue J, Evaluation of antioxidant capacity and total phenolic content of different fractions of selected microalgae. Food Chemistry 102, Mensor, L.; Menezes, F.; Leitao, G.; Reis, A.; Dos Santos, T.; Coube, C.; Leitao, S Screening of Brazilian plants extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. Phytotheraphy Res. 15, Turkmen N., Sari F., Velioglu Y.S., Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin-Ciocalteu methods. Food Chemistry 99, pp Sun T., Ho C., Antioxidant activities of buckwheat extracts. Food Chemistry 90, pp Ozsoy, N., Can, A., Yanardag, R., Akev, N., Antioxidant activity of Smilax excelsa L. leaf extracts. Food Chemistry 110, pp Hilaly J., Israili Z.H., Lyoussi B., Acute and chronic toxicological studies of Ajuga iva in experimental animals. Journal of Ethnopharmacology 91, Cruz Manzano E., Sanfiel Vasseur L., Palacio Omar M., Estrés oxidativo e hipertensión esencial: una realidad clínica. Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas 23, 3.