EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS MADRES LIMBARES

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1 CAPÍTULO 48 EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS MADRES LIMBARES Edgar Mauricio España, Mario A Di Pascuale, Martin Grueterich, Scheffer C. G. Tseng 1. INTRODUCCIÓN La integridad de un epitelio corneal autorrenovable reside en la existencia de una subpoblación particular y única de células madre del epitelio corneal localizadas en la región limbar (1,2). Característicamente, esta región limbar proporciona un medio óptimo también llamado nicho donde las células madre epiteliales limbares están físicamente protegidas de los peligros ambientales, mientras son aportados un flujo sanguíneo apropiado, inervación y señalización celular para mantener su condición de células madre (fig. 1). Dentro de la región limbar, las células madre se localizan en la capa basal. Fenotípicamente estas células madre corneales se caracterizan principalmente por la falta de expresión del par de queratina K3/K12 (3,4) y la conexina 43 (5) (fig. 2). Cuando las células madre epiteliales limbares o su medio estromal de soporte nicho se vuelven disfuncionales o son destruidos, se manifiesta un estado patológico conocido como deficiencia de células madre límbicas (6,7) (ver capítulo 4). Clínicamente, el sello del déficit de células madre limbares es la conjuntivalización, es decir, la superficie corneal se cubre de un epitelio conjuntival que crece hacia el interior y que contiene células caliciformes (8). Este proceso de conjuntivalización está invariablemente asociado a la destrucción de la membrana basal, la aparición de neovascularización superficial, inflamación crónica, cicatrización y pobre integridad del epitelio corneal (6,9,10). Conse- Figura 1: Las células madre del epitelio corneal residen en el nicho límbico. Como resultado, estas células madre epiteliales limbares están protegidas de la radiación ultravioleta mediante grandes cantidades de pigmento (A). La microfotografía de contraste de fase muestra la superficie ondulada con un patrón en empalizada que protege las capas basales epiteliales y proporciona un área de superficie mucho mayor para albergar a las células madre (B). La región limbar está de forma característica ricamente vascularizada (C).

2 472 Superficie ocular Figura 2: Fenotipo de epitelio limbar único. El epitelio estratificado de la córnea descansa sobre una gruesa capa de Bowman (puntas de flecha negras), mientras que el epitelio estratificado limbar muestra una capa basal ondulada sobre un estroma poco denso (flechas negras) (A). La queratina K3 está ausente en la capa basal limbar (B) pero presente en la capa basal corneal (las líneas blancas discontinuas delimitan la membrana basal epitelial) (C). La conexina 43 define la membrana celular del epitelio corneal basal y suprabasal (izquierda) pero está ausente en la capa basal limbar (derecha) (D). El receptor de alta afinidad para NGF, el TrkA, es expresado en el epitelio basal y suprabasal del epitelio limbar y corneal (señal indicadora) (E). La integrina β1 es expresada en las capas basales del epitelio corneal en el limbo y córnea central (F). cuentemente, los pacientes con grave conjuntivalización experimentan irritación importante, fotofobia y disminución de la visión y los trasplantes corneales convencionales no funcionan bien. Una vez establecido el diagnóstico de déficit total de células madre límbicas, el trasplante de células madre epiteliales limbares es la solución final para mejorar los síntomas y la visión del paciente. En función de la afección uni o bilateral, de la extensión de la insuficiencia límbica y de la aceptación y expectativas por parte del paciente, se pueden considerar varios procedimientos para transplantar las células madre límbicas (tabla 1). Recientemente, varios estudios in vivo en humanos (11-14) y conejos (15,16) y varios in vitro Figura 3: Expansión ex vivo de epitelio limbar humano en membrana amniótica (AM). Se toma una pequeña biopsia limbar (1-2 mm) de un ojo sano donante. La biopsia se cultiva en membrana amniótica durante 3 a 4 semanas. El injerto semitransparente compuesto de epitelio limbar expandido (HLE) y membrana amniótica es transplantado al ojo receptor donde se vuelve gradualmente más transparente con el tiempo. Área roja: limbo. (15,17,18) han demostrado los beneficios de la expansión corneal ex vivo para la reconstrucción corneal en ojos con una insuficiencia límbica total. Esta última tecnología hace referencia a la expansión ex vivo de células madre limbares autólogas o heterólogas obtenidas mediante una biopsia de un pequeño segmento de limbo sano (11-14,19,20) (fig. 3). 2. INDICACIONES Hasta ahora, el autoinjerto limbar, en el que se retiraban dos injertos lamelares que habitualmente abarcaban 2-3 horas e incluían conjuntiva, limbo y córnea periférica, ha sido considerado el procedimiento de elección para la defiencia unilateral total de células madre limbares. Desgraciadamente, nubécula corneal localizada (21), pseudopterigión (22,23), Tabla 1. Procedimientos quirúrgicos usados para la reposición de células madre limbares en el manejo de pacientes con deficiencia de células madre limbares Procedimiento Abreviatura Donante Trasplante de membrana amniótica TMA Placenta humana Autoinjerto limbar AUTL Limbo contralateral Aloinjerto limbar de familiar vivo ALOTL-fam Limbo de familiar vivo Aloinjerto queratolímbico ALOTL Anillo corneo-escleral de cadáver Expansión ex vivo (autóloga) ExVivo Limbo contralateral

3 Capítulo 48. Expansión ex vivo de células madres limbares 473 queratitis filamentosa (24), depresión corneal y microperforaciones (25) son algunas de las potenciales complicaciones referidas en este procedimiento. Para superar estas complicaciones, la expansión autóloga ex vivo está indicada en pacientes con probado diagnóstico de déficit unilateral total de células madre límbicas en los que la retirada de un gran autoinjerto lamelar del ojo sano puede comprometer la homeostasis del epitelio corneal. En aras de aumentar el éxito del resultado de esta técnica quirúrgica, se formulan las siguientes estrategias: 2.1. La primera estrategia es restablecer las defensas de la superficie ocular Han sido identificados varios factores de riesgo que pueden empeorar el resultado de cualquier procedimiento reconstrutivo de la superficie ocular. Son la sequedad grave, las anomalías del párpado y borde palpebral no corregidas, la queratinización y la inflamación crónica. Dado que estos factores reflejan deficiencias en los mecanismos necesarios para mantener una superficie ocular sana y en buen estado, sin una corrección previa de las mismas se presentan como factores de riesgo que amenazan el buen estado de las células limbares transplantadas. Por consiguiente, es un requisito previo el restablecer una defensa de la superficie ocular en buen estado previamente a realizar la reposición ex vivo (fig. 4). La identificación de dichos indeseables factores de riesgo mediante un examen externo y biomicroscópico y mediante el uso de tests de la función lagrimal, tinción y citología de impresión son pasos cruciales previos al planteamiento de cualquier trasplante. Algunas medidas que pueden tomarse para corregir una queratitis sicca grave incluyen la oclusión del punto lagrimal y la aplicación frecuente de gotas de suero autólogo. Las anomalías del margen palpebral y las pestañas como triquiasis, entropión o metaplasia de los orificios de las glándulas de Meibomio han de ser corregidas Figura 4: Representación esquemática de diferentes medidas que deben ser tomadas en consideración previamente a la reconstrucción quirúrgica. mediante la cirugía plástica apropiada y las lentes de contacto esclerales. El simbléfaron, si causa deficiencias en la protección de la superficie ocular, puede ser corregido antes o en el momento de la reconstrucción ex vivo mediante un injerto de membrana mucosa o amniótica. Los problemas de exposición también pueden corregirse mediante una ptosis inducida con Botox o una tarsorrafia. Si no se restablece una protección de la superficie ocular en buen estado, estas deficiencias representan contraindicaciones mayores para la reconstrucción ex vivo La segunda estrategia es restablecer un medio estromal limbar Un entorno estromal limbar sano es esencial para mantener y promover una función de las células madre limbares adecua- Tabla 2. Características de la membrana amniótica que imitan el nicho de las células madre y promueven la expansión de células madre limbares Estructura de la membrana amniótica EPITELIO AMNIÓTICO Proporciona citoquinas (principales: EGF,KGF, HGF, bfgf, NGF; menores: TGF-α, TGF-β1, TGF-β2). Inhibidores tisulares de metaloproteinasas. Trombospondina-1. MEMBRANA BASAL AMNIÓTICA Colágeno IV (cadena a) y VII. Laminina 1 y 5. Fibronectina. ESTROMA AMNIÓTICO Citoquinas (principales: NGF, HGF, KGF; menores: TGFα, TGF-β1+2, EGF, bfgf). Inhibidores tisulares de metaloproteinasas. Trombospondina-1. Mecanismo potencial de acción para la expansión ex vivo de células madre limbares Previene el contacto temprano con los componentes de la membrana celular epitelial Proporciona citoquinas que afectan al ciclo y la supervivencia celulares. Facilita migración y adhesión de la célula a la membrana celular epitelial. Desencadena las vías de diferenciación a través de las integrinas. Proporciona un microambiente no inflamatorio. Proporciona citoquinas de vías de diferenciación principales que están involucradas en la comunicación entre estroma y epitelio limbar.

4 474 Superficie ocular da, basándose en la premisa de que las células madre residen en un nicho especializado que mantiene su pluripotencialidad y dicta su plasticidad (7,26). El nuevo concepto en desarrollo de la biología de las células madre enfatiza el papel del nicho estromal circundante y, por tanto, el restablecimiento del entorno estromal limbar es una estrategia adyuvante primordial. Con una adecuada obtención y preservación, la membrana amniótica puede utilizarse como un sustrato biológico ideal para conseguir este propósito al proporcionar una membrana basal gruesa y un estroma avascular, que suprime la inflamación, la cicatrización y la vascularización al mismo tiempo que mantiene los fenotipos de epitelio limbar y queratocito (7,27). Varios estudios han demostrado las múltiples ventajas de la membrana amniótica para restablecer un nicho adecuado para la expansión epitelial limbar (tabla 2). Además, datos recientes del laboratorio de Kinoshita también demuestran que la membrana amniótica puede suprimir las respuestas linfocíticas mixtas en la producción de citoquinas de Th1 y Th2, un índice que reafirma su papel inhibidor de las respuestas inmunes (28). In vitro, las células epiteliales expandidas en una membrana amniótica intacta mantienen un fenotipo que asemeja el de las células madre epiteliales limbares in vivo (17,18,29). Las células madre expandidas en una membrana amniótica son pequeñas y compactas y no expresan la queratina K3 ni la conexina 43 en las capas de células basales. Además, las células epiteliales expandidas descansan en una membrana basal gruesa necesaria para una apropiada supervivencia y diferenciación celular (fig. 5). Clínicamente, el beneficio de usar membrana amniótica para la Figura 5: Expansión ex vivo de epitelio limbar humano obtenido de una biopsia limbar. Crecimiento a partir de una biopsia límbica tras tres semanas de cultivo (A). La microscopía de contraste de fase de las células limbares expandidas creciendo sobre la membrana amniótica revela un tamaño celular pequeño y uniforme (B). La membrana amniótica mantiene la transparencia una vez las células se han expandido hasta alcanzar la confluencia (C). Una sección transversal de las células epiteliales limbares expandidas en membrana amniótica muestra células (1) creciendo sobre epitelio amniótico desvitalizado (2) y una membrana basal amniótica gruesa (3) (D). Las células expandidas sobre membrana amniótica demuestran positividad a la tinción para queratinas K3 en las capas superficiales, con expresión negativa en las capas basales (E). Se demuestra una membrana basal gruesa mediante la tinción para colágeno IV (delimitada mediante estrellas blancas) (F).

5 Capítulo 48. Expansión ex vivo de células madres limbares 475 Figura 6: Fenotipo tras trasplante de epitelio limbar expandido ex vivo sobre membrana amniótica. Un paciente varón con una deficiencia limbar total secundaria a una quemadura química se presentó con agudeza visual disminuida, nubécula corneal y fotofobia. Dos meses tras el trasplante de epitelio limbar expandido ex vivo para la deficiencia limbar total, el epitelio estaba intacto y liso (A). Veintiún meses tras la queratoplastia penetrante que fue llevada a cabo 5,5 meses tras el procedimiento previo (B). La muestra corneal evidencia un epitelio estratificado con una capa basal negativa para queratina K3 (fluorescencia verde) (C). La tinción para conexina 43 (fluorescencia verde) es también negativa en la capa basal (D). El color rojo muestra la tinción nuclear con yoduro de propidio. C y D asemejan un fenotipo límbico para ambos marcadores. expansión ex vivo al proporcionar una reconstrucción del nicho está apoyada por nuestro reciente estudio de un caso que muestra que el fenotipo epitelial resultante es limbar, como evidencia la ausencia de expresión basal de queratina K3 y conexina 43, que el sustrato de membrana amniótica que contiene membrana basal es preservado y que las células epiteliales basales expresan integrinas α3β1 y α6β4 para formar hemidesmosomas con laminina 5 (14) (fig. 6). 3. TÉCNICAS DE EXPANSIÓN EX VIVO Se han descrito diferentes técnicas de expansión ex vivo (15,19,20,30-32). Aunque la expansión ex vivo se practica en varios centros en todo el mundo, no ha sido establecida hasta ahora una técnica estandarizada. Aunque estas técnicas se basan en el mismo principio, difieren significativamente en lo que respecta a las condiciones de cultivo siguientes: 3.1. El uso de explante limbar que contiene epitelio y estroma o de células epiteliales solas Cuando se usan explantes limbares para expansión, la pluripotencialidad del epitelio limbar puede mantenerse gracias a su microambiente normal, mientras que la pluripotencialidad del crecimiento epitelial tendrá que ser mantenida bien mediante una membrana amniótica intacta (11,18,32) o bien mediante capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (20). Por otra parte, las células epiteliales limbares

6 476 Superficie ocular Esta maniobra está basada en el trabajo de Rheinwald y Green (33) para expandir células madre de queratinocitos de la piel. Para la expansión ex vivo de células progenitoras de epitelio limbar, este método ha sido modificado por otros (31) mediante el cultivo de células epiteliales limbares en membrana amniótica denudada en un sistema de cocultivo con capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (fig. 7A). Aparte del problema de exponer células epiteliales limbares humanas expandidas a células murinas, permanece sin aclarar si realmente la pluripotencialidad se mantiene en este sistema sin un contacto directo con capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (34) Diferencias en el sustrato usado para la expansión epitelial Figura 7: Diferentes técnicas de expansión ex vivo de epitelio limbar. Las células son cultivadas en membrana amniótica denudada bajo la influencia de medio acondicionado 3T3 (A). Las células epiteliales limbares son cultivadas sobre una capa de fibrina adecuada para el trasplante (B). Las células son cultivadas en membrana amniótica intacta con células madre epiteliales limbares creciendo sobre el epitelio amniótico muerto aún adherido a la membrana amniótica (C). pueden ser aisladas del limbo como una suspensión de células sueltas y sembradas directamente en una membrana amniótica denudada, mantenidas mediante un cocultivo de capas nutrientes fibroblásticas 3T3 (31). Una variante consiste en expandir las células madre epiteliales límbicas primero mediante capas nutrientes fibroblásticas 3T3 antes de cultivar para el trasplante sin el uso de membrana amniótica (19,30). Cuando se usan explantes limbares, permanece sin aclarar si las células madre epiteliales migran realmente de los explantes limbares. Si esto no ocurre, entonces es crucial mantener el estatus progenitor de las células que migran. A este respecto, la membrana amniótica intacta se ha revelado superior a la denudada (18). También se desconoce si las células madre epiteliales limbares expandidas con 3T3 preservan realmente la deseada pluripotencialidad tras ser recultivadas en membrana amniótica. Koizumi et al (31) han sugerido que la suspensión de células epiteliales limbares es más adecuada para la expansión ex vivo. Advirtieron que las suspensiones de células enzimáticamente disociadas producen una capa de células epiteliales sanas con más uniones tipo desmosoma con expresión del par de queratina específica corneal (K3/K12) El uso de una capa nutriente fibroblástica 3T3 Las células progenitoras limbares expandidas ex vivo eran inicialmente colocadas en una gasa (19) y posteriormente en un gel fibrinoso (30) para facilitar la comodidad al transferir las capas epiteliales expandidas a la superficie ocular (fig. 7B). Tras ser colocadas en el ojo receptor, la capa de fibrina es degradada en unas semanas y las células transplantadas forman un nuevo complejo basal sobre el tejido receptor. Sin embargo, otros han usado membrana amniótica como sustrato. Nuestro laboratorio ha notificado que la membrana amniótica intacta con epitelio amniótico desvitalizado ayuda a mantener el fenotipo epitelial limbar, mientras que la membrana amniótica denudada promueve el fenotipo epitelial corneal (18). En pocas palabras, las células epiteliales limbares expandidas en la membrana amniótica intacta no expresan queratina K3 ni conexina 43 en la capa de células basales (fig. 7C). En contraste, las células epiteliales limbares expandidas en la membrana amniótica denudada (es decir, el epitelio amniótico es retirado mediante EDTA y medios mecánicos) expresan queratina K3 y conexina 43 en la capa basal. Estos hallazgos indican que la membrana amniótica no es utilizada simplemente como un sustrato que contiene membrana basal, sino que sirve para mantener la pluripotencialidad proveyendo de un nicho estromal único (7). 4. RESUMEN DE LOS ESTUDIOS CLÍNICOS SOBRE LA EXPANSIÓN EX VIVO DE CÉLULAS EPITELIALES LIMBARES El propósito final de la reconstrucción de la superficie ocular es aliviar los síntomas de fotofobia, mejorar la agudeza visual y restablecer una superficie corneal normal sin vascularización. Esta meta ha sido alcanzada mediante células madre epiteliales limbares expandidas ex vivo en membrana amniótica en varios informes clínicos de pacientes que sufrían una deficiencia uni o bilateral total de células madre limbares (tabla 3). Un ensayo clínico ha sido recientemente aprovado para la FDA en Estados Unidos y será iniciado por el Dr. Tseng en el Centro de Superficie Ocular para determinar la seguridad y eficacia de este nuevo procedimiento quirúrgico. 5. EL USO DE MUCOSA ORAL PARA LA EXPANSIÓN EX VIVO La expansión de células madre limbares autólogas no puede utilizarse para la reconstrucción corneal en pacientes

7 Capítulo 48. Expansión ex vivo de células madres limbares 477 Tabla 3. Resumen de los estudios clínicos sobre uso de la expansión ex vivo de células madre limbares en membrana amniótica Literatura citada Tsai et al. 11 Schwab et al. 20 Koizumi et al. 12 Koizumi et al. 13 Grueterich et al. 14 Shimazaki et al. 36 Número de ojos Indicación - LSCD total: (no especificado) 13 - LSCD parcial: 4 - Otros: 0 Rec. pterigión (3) Pseudopterigión (3) Rec. NIE (1) Sistema de cultivo Cultivo de explante Autólogo (10) y Cultivo de explante Cultivo de explente Cultivo de explante Cultivo de explante autólogo, MA intacta, alogénico (4), alogénico, MA alogénico, MA autólogo, MA alogénico (donante no 3T3, no transporte células limbares denudada, 3T3 en denudada, 3T3 en intacta, no 3T3, no familiar vivo n=5 ' en aire. sueltas expandidas plástico, transporte plástico, transporte transporte en aire. no familiar n=7) directamente en 3T3 en aire. en aire. MA denudada, no y luego sembradas 3T3, no transporte en MA denudada, en aire. transporte en aire. Seguimiento Media: 15 (12-18) Mediana: 11 (6-19) 6 Media: 11,2±1,3 21 Resultados clínicos (meses) a corto plazo (no especificado) Resultados: Auto Alo Superficie estable 100% 71% 71% 100% 77% Sí 46% AV 83% 100% 100% 100% 77% Conjuntivalización No 29% 29% No 23% No 38% (+8% dérmico +8% defecto epit.) Inmunosupresión No CSA sistémica y Esteroides Esteroides No 100% CSA sist. local (4 casos sistémicos, CSA, sistémicos, CSA, 38% CSA tópico alogénicos) Ciclofosfamida Ciclofosfamida adicional Histología Pre-op: Sí (HE y ME) Sí (HE) Sí (HE e IH para Sí (HE e IH para No Sí (HE y ME) K3+K12) K3+K12) Post-op: No No No No Sí (HE e IH para No K3, Cx43, Ln-5, integrinas -α3b1, -α6β4)no LSCD: deficiencia en células madre limbares; MA: membrana amniótica; CSA: ciclosporina A; HE: hematoxilina; IH: inmunohistoquimia; K: keratina; Ln: laminina; ME: microscopía electrónica; NIE: neoplasia intraepitelial córneo-conjuntival. con déficit bilateral de células madre limbares causado por enfermedades como el síndrome de Stevens-Johnson, el penfigoide ocular cicatricial y las quemaduras químicas graves. La expansión de células madre limbares alogénicas deberá ser considerada (12,13). No obstante, en este último caso, deberá instaurarse inmunosupresión sistémica que puede acarrear una toxicidad significativa. Para superar esta dificultad, la expansión ex vivo de epitelio de mucosa oral autólogo se ha propuesto como alternativa prometedora (35). En este nuevo abordaje, el epitelio de mucosa oral es expandido en membrana amniótica de la misma manera que el epitelio limbar y se ha mostrado efectivo en restablecer las superficies corneales dañadas en estas difíciles enfermedades de la superficie ocular. BIBLIOGRAFÍA 1. Schermer A, Galvin S, Sun T-T. Differentiation-related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. J Cell Biol 1986; 103: Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of slowcycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell 1989; 57: Chen WYW, Mui M-M, Kao WW-Y, et al. Conjunctival epithelial cells do not transdifferentiate in organotypic cultures: Expression of K12 keratin is restricted to corneal epithelium. Curr Eye Res 1994; 13:

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