Tema 6: Crecimiento microbiano. Cátedra: Microbiología General y de los Alimentos

Transcripción

1 Tema 6: Crecimiento microbiano Cátedra: Microbiología General y de los Alimentos Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales

2 Crecimiento celular: Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva y conduce a un aumento del Nº de células y por lo tanto de la masa celular. Nutrientes Productos de desecho Energía para el desarrollo Anabolismo (biosíntesis) Energía para movto., transp. Nutriente, etc. Componentes celulares Catabolismo Fuente de energía

3 Crecimiento microbiano Factores genéticos Condiciones del cultivo Modalidad del cultivo Temperatura. Comp. del medio de cultivo. * ph C. batch C. continuo C. fed -batch

4 CULTIVO BATCH Es un sistema cerrado, no hay ingreso de nutrientes ni egreso de productos. Los microorganismos unicelulares crecen según la denominada curva de crecimiento microbiano. Esta curva describe el ciclo completo del crecimiento celular y se divide en distintas fases:

5 La curva de crecimiento se divide en las siguientes fases: 1. Fase de retardo o de latencia ( fase lag ): Es el período de tiempo durante el cual el inóculose adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Si el inoculo proviene de un cultivo en crecimiento activo y en el mismo medio, esta será despreciable. Si el inoculo es un cultivo viejo, esta fase será larga. Cuando se transfieren células de un medio rico a uno pobre esta fase será larga. 2. Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica) El incremento por unidad de tiempo de la masa celular, Nº de células, se mantienen en un valor constante. Crecimiento balanceado o equilibrado. La velocidad de crecimiento aumenta exponencialmente y esta influenciada por las características genéticas del microorganismo y por las condiciones ambientales (ph, temperatura, sustrato, etc.)

6 El crecimiento exponencial continúa hasta que un nutriente del medio se agota o se acumulan productos tóxicos del metabolismo. 3. Fase de desaceleración Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase de desaceleración puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).

7 4. Fase estacionaria: En la fase estacionaria no hay aumento del número de células. Pero aún ocurren reacciones metabólicas (ej. metabolismo energético y algunos proceso biosintéticos). 5. Fase de muerte exponencial: Se produce la muerte y en algunos casos lisis celular. Se debe al agotamiento de reservas de energía.

8 Velocidad de crecimiento microbiano Se define como el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo. dx r x = = µ. x dt (g/l.h) o dn/dt = µ. N (ec. 1) Donde: N = número de células (nº cél./ml). x = concentración celular o biomasa seca (g/ml). t = tiempo de incubación (h). µ = velocidad específica de crecimiento (h -1 ) (característico para cada microorganismo en cada medio determinado).

9 Crecimiento en fase exponencial: µ = µ m El microorganismo crecerá a µ m máximo y constante, la ec. 1 se reduce a: r x dx = = µ m x (ec. 2) dt Integrando la ec. 2 y suponiendo que a t = 0, x =x 0 se obtiene: ln x ln x o =µ m.t o Ln N = ln N o + µ m. t (ec. 3) Si se grafica ln x frente al tiempo (ec. 3) se obtiene una línea recta cuya pendiente es µ m Si hubiera fase lag la ec. 3 queda: ln x ln x 0 = µ m. (t - t lag )

10 La ec. 3 puede ser descrita: x f = x o. e µm.t N f = N o. e µm.t (ec. 4) X (o N) varían exponencialmente con el tiempo(crecimiento exponencial o logarítmico). X o N Tiempo Pendiente en cada punto: r x = dx dt Durante el crecimiento exponencial la velocidad de crecimiento (r x ) es inicialmente lenta pero se incrementa con el tiempo.

11 En la fase exponencial el crecimiento microbiano es una progresión geométrica de base 2. Nº de células Nº de células Generación N = N 0. 2 n Siendo: N = nº final de células/ml. No = nº inicial de células/ml. n = nº de generaciones N 2 n n Tomando logaritmos : ln N = ln N 0 + n. ln 2 Por lo tanto: n = (ln N -n N 0 ) / ln 2 Se puede calcular el número de veces que la población se duplica (número de generaciones, n) en el tiempo t. Nº de generaciones a un tiempo t: n = t/ t d

12 Tiempo de generación (tg) o de duplicación (td) Tiempo de generación es el tiempo que transcurre para que la población se duplique (también llamado tiempo de duplicación td). Depende de factores nutricionales y genéticos. Considerandox=2x o y reemplazandoenlaec.3seobtiene: ln 2 x 0 = ln x 0 + µ m. t d t d = ln2 µ m Además: Nº de generaciones a un tiempo t: n = t/ t d

13 Crecimiento en fase desaceleración y estacionaria dx r x = µ. x dt µ<µ = m Fase Lag µ 0 Velocidad de crecimiento específica Aceleración µ<µ max Exponencial µ µ max Declinación µ< µ max Estacionaria µ=0 Muerte µ<0 Curva de Crecimiento en forma batch

14 Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de crecimiento Monod ha propuesto una relación muy simple entre el valor de µy la concentración de sustrato limitante. Sustrato limitante es aquel componente del medio de cultivo que primero se agota (FCE, fuente de N, C, algún aminoácido etc.) µ Ecuación de Monod: µ m = µ s + µ m (ec. 5) ks s Siendo: s = k s s S: concentración de sustrato limitante (g/l). K s : constante de saturación (g/l), representa la concentración de sustrato cuando µ = µ m /2. µ: velocidad específica de crecimiento (tiempo -1 ). µ m la velocidad específica máxima de crecimiento (tiempo -1 ).

15 En la gráfica de la ec. de Monod se observan dos zonas: a) Zona A-B: siendo s>> ks y µ= µ m (cultivo irrestricto). Sustrato saturante b) Zona B-C: S se va agotando y S ~ ks, µ= f (S), en esta zona juega la ecuación completa de Monod. C µ = f (s) B µ µ f (s) A µ m S << k s µ< µ m S >> 10 k S µ= µ m = cte. Zona sustrato saturante Cuando s >> k s, µ= µ m s = k s s r x = µ m.x Figura 2: efecto de la concentración de sustrato limitante en la velocidad específica de crecimiento.

16 En cultivo batch x S 0 µ= f (s) < µ m r x = 0 µ m µ Cultivo irrestricto: Fase logarítmica S >> 10 k S S >> 10 k S µ= µ m = cte. r x = µ m.x µ m = cte. t s = k s Fase de desaceleración s Fase de crecimiento logarítmico En un cultivo batch al comienzo (t = 0) µ= µ m hay exceso de sustrato. No se puede controlar el crecimiento del microorganismo y µ= µ m = cte.

17 Fase de desaceleración: A medida que el cultivo transcurre, S disminuye hasta que llega a ser comparable a ks. La velocidad específica (µ) irá disminuyendo según la ecuación de Monod. k s s +s 1 µ rx = = µ m x µ m dx dt k s s + s Fase estacionaria: Finalmente S = 0 en el cultivo: µ =0 dx r x = = µ. x dt r x dx = dt =0 No se acumulan más células en el reactor y se está en la fase estacionaria.

18 Que tan constante es µ m? La velocidad específica máxima (µ m ) es constante pero depende del: ph, temperatura, medio de cultivo. Para un microorganismo dado, si fijo el ph, la temperatura, y el medio de cultivo, µ m será constante mientras el sustrato limitante esté en exceso.

19 Efecto de la temperatura sobre la velocidad específica del crecimiento microbiano Los microorganismos están divididos en tres clases dependiendo de su temperatura óptima de crecimiento: Psicrófilos (< 20 C), mesófilos (20 37 C), termófilos (>38 C). Un aumento de la T, provoca un aumento de la veloc, de reacción (según ec. de Arrhenius). Pero aumentos posteriores de T inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de µ m disminuye.

20 Efecto del ph sobre la velocidad específica de crecimiento microbiano Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de ph. Cada microorganismo tiene un ph óptimo para el crecimiento: Las bacterias tienen un ph óptimo cercano a 7. Los hongos y levaduras de alrededor de 5.

21 Valores de µ m para diferentes microorganismos: Bacterias a 0,9 h -1 Levaduras 0,45 h -1 Hongos 0,25 h -1

22 CULTIVO CONTINUO El cultivo continuo es un sistema de cultivo abierto, con volumen constante al que se añade continuamente medio fresco y del que se retiran células y productos de desecho (por un dispositivo de rebosadero). Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes. El sistema está en estado estacionario µ = D Los parámetros a tener en cuenta son: * Fujo (F), medido en ml/h. * Volumen de la cámara de cultivo (v, en ml). * Densidad celular en la cámara (x). * Factor de dilución D = F/v (en h -1 ).

23 METODOS PARA MEDIR EL CRECIMIENTO MICROBIANO: Determinación del peso seco: MÉTODOS DIRECTOS: Recuento de células totales(recuento directo): Método del Recuento en Placa MÉTODOS INDIRECTOS: Medida de la turbidez (ópticos):

24 MÉTODOS DIRECTOS: 1. Determinación del peso seco: Suspensión celular, se separan las células por centrifugación, se lavan y secan en estufa hasta peso constante. 2. Recuento de células totales(recuento directo): Cámaras de recuento especiales (Neubauer, Petroff-Hauser). Son portaobjetos excavados de volumen perfectamente conocido cuando se sella herméticamente con cubreobjetos resistentes. Limitaciones: Poco sensible, se requiere una concentración de 10 7 cel/ml, o más para que se pueda observar una célula en el campo microscópico. Se cuentan tanto células vivas como muertas (recuento total). Ventajas: rápido y poco material implicado.

25 3. Método del Recuento en Placa Se basa en la capacidad de una célula viable de formar una colonia en un medio de cultivo adecuado Standard (PCA). Por lo tanto se cuentan colonias, cada una proviene de una sola célula viable. (Célula viable: capaz de dividirse y formar células hijas.) a) Método de extensión en placa(o en superficie): 0,1 ml de la suspensión celular se extiende sobre la superficie de la placa usando una espátula de Drigalski. La placa se incuba y se cuentan las colonias. b) Método de vertido en placa(en volumen). 1 ml de la suspensión en la placa y se agrega el agar fundido a 45 ºC.

26 Nº de colonias: 30 a 300 col./placa. Ventajas: * Elevada sensibilidad, se pueden contar muestras con pocas células. * Determina sólo microorganismos viables. Desventajas: * Las colonias deben provenir de 1 sola célula (problemas con microorganismos que dan grumos o cadenas). * Precisa distintos medios para diferentes microorganismos.

27 MÉTODOS INDIRECTOS: Medida de la turbidez (ópticos): En una suspensión celular, las células difractan ( o dispersan) la luz incidente en forma proporcional a su concentración. Espectrofotómetro (mide la luz transmitida). Ventajas: Precisas, dentro de ciertos límites, rápidas y fáciles de utilizar. Densidad óptica: OD= Log I 0 / I I 0 : luz incidente I: luz transmitida (no dispersada) Requiere la construcción de una curva de calibración.

28 Problemas: 1. Comenzando con 4 células bacterianas/ml en un medio rico, con un t lag de 1 h de adaptación y un tiempo de generación de 20 min. Cuántas células habrá luego de 2 h de incubación? 2. Determine el número de generaciones que han transcurrido durante el crecimiento exponencial de un cultivo microbiano (n) si se partió de una población inicial (N 0 ) de células y se obtuvo una población final (N) de células, luego de 6 h de cultivo. 3. Calcule el tiempo de generación en un experimento de crecimiento en el que el medio se inoculó con células/ml de Escherichiacoliy después de 1 h de fase de adaptación, creció exponencialmente durante 5 h, siendo entonces la población de células/ml. 4. La velocidad específica máxima de un microorganismo desarrollado aeróbicamente en cultivo batches de 0,327 h -1. Suponiendo que el período de latencia es despreciable, calcule la concentración de biomasas (x) que se obtiene a las 12 h de proceso, partiendo de una concentración de 0,2 g/l de células secas (x 0 ).

29 5. La concentración celular en un cultivo puro de bacterias alcanza su valor máximo de 6,67 g/l. Si la velocidad máxima de crecimiento es de 0,432 h -1 y se parte de un inóculo de 0,2 g/l, calcule el tiempo que demandó el proceso (suponga despreciable la fase lag).

30 Cuestionario 1.Represente el crecimiento microbiano de un organismo unicelular en un cultivo batch. Describa las fases del crecimiento microbiano 2.. Qué entiende por crecimiento balanceado o equilibro y en que fase de la curva de crecimiento se lo obtiene?. 3.Represente la velocidad de crecimiento microbiano durante la fase de crecimiento exponencial en su forma aritmética y semilogarítmica. 4. Por que las células entran en fase estacionaria?. 5. Cómo se pueden disminuir los tiempos en la fase de latencia?. 6. Defina tiempo de generación y obtenga la expresión que permita medir el tiempo de generación 7. Qué métodos directos e indirectos utilizaría para medir el crecimiento microbiano?. Describa uno de ellos.