TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS PROPIEDADES EMULSIONANTES Y ESPUMANTES

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1 1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 Objetivos PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS PROPIEDADES EMULSIONANTES Y ESPUMANTES Evaluar propiedades superficiales de las proteínas mediante el empleo de diferentes métodos. Evaluar propiedades emulsionantes de las proteínas Evaluar propiedades espumantes de las proteínas Introducción PROPIEDADES EMULSIONANTES DE LAS PROTEÍNAS Una emulsión es una dispersión de dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales se encuentra bajo la forma de pequeñas gotitas o glóbulos dispersos y el otro bajo la forma de una fase continua dispersante. La mayor parte de las emulsiones alimenticias son del tipo - aceite en agua - agua en aceite. Por lo general en los alimentos la fase lipídica es la dispersa. Las emulsiones son sistemas termodinámicamente inestables debido al aumento del área interfacial lo que produce un aumento de la energía libre del sistema. Las proteínas por su naturaleza anfifílica, tienen acción tensioactiva pueden estabilizar las emulsiones, por su tendencia a desnaturalizarse y a agregarse en la interfase entre las gotitas de aceite dispersas en la fase continua y aportan propiedades físicas y reológicas (espesamiento, viscosidad, elasticidad, rigidez) que determinan la resistencia de las gotitas a la coalescencia por lo que son buenos agentes emulsificantes y estabilizantes de emulsiones. Para evaluar las propiedades emulsionantes de las proteínas se utilizan métodos estandarizados, debido a la diversidad de factores que afectan tanto la formación como la estabilidad de las emulsiones. Las propiedades emulsionantes de las proteínas se pueden clasificar en dos grupos según sobre que proceso dan información: Poder emulsionante (Proceso de formación de la emulsión). Poder estabilizante (Proceso de desestabilización de la emulsión). Poder emulsionante: Es la actitud que tiene una proteína de lograr la separación de aceite en pequeñas gotas. Puede determinarse a través de la medida de dos parámetros diferentes: la capacidad emulsionante y la actividad emulsionante. Medida de la capacidad emulsionante (CE): Es la cantidad de aceite que puede emulsionar una solución de proteína a una determinada concentración al momento en que se produce la inversión de la emulsión. La inversión de fases ocurre cuando una emulsión agua/aceite se transforma en una aceite/agua, o a la inversa. Esto sucede generalmente en emulsiones en las que la relación fase dispersa/fase continua es elevada o cuando la emulsión es sometida a un trabajo mecánico intenso. Los métodos consisten en adicionar aceite a una dispersión de una proteína con agitación continua hasta que se produce la inversión de fases. La determinación del punto de inversión se puede detectar por cambios en el color o por medidas eléctricas. Medida de la actividad emulsionante (AE): Esta medida da una idea del área interfacial creada. Se pueden emplear métodos turbidimétricos como el de Pearce y Kinsella que relaciona el area interfacial creado con la turbidez de una emulsión. Poder estabilizante: El estudio de la estabilidad de una emulsión consiste en analizar y cuantificar los cambios debidos a los distintos mecanismos de desestabilización, por medio de diferentes técnicas tales como cremado, floculación, coalescencia, etc. 1

2 2 PROPIEDADES ESPUMANTES DE LAS PROTEÍNAS Una espuma es una dispersión de burbujas de gas en un líquido. La medida exacta de las propiedades espumantes de una proteína como ingrediente de un alimento es difícil, debido a que se encuentra influida por el método empleado para formar la espuma como por las características de agente espumante. Las técnicas están usualmente diseñadas para medir capacidad espumante o estabilidad espumante. Estas dos variables pueden a la vez estar afectadas de forma diferente por el mismo factor ambiental. Por ejemplo factores que mejoran la capacidad espumante pueden disminuir la estabilidad de la espuma. Capacidad espumante: La capacidad espumante determina la habilidad para incorporar aire en la solución en forma de una distribución fina de burbujas, la forma más empleada para expresar la capacidad espumante es la expansión de la espuma a tiempo fijo. Capacidad estabilizante: Es independiente del método de espumado empleado. Se puede medir dos procesos diferentes: el drenaje del líquido y el colapso de la espuma. El drenaje del líquido da idea de la retención del liquido en la espuma y consiste en medir el volumen del liquido drenado a un tiempo fijo o bien el tiempo medio de drenado (tiempo en que tarda en drenar el 50 % del líquido incorporado inicialmente en la espuma. El colapso de la espuma se evalúa con una cámara unilínea, por medida del volumen de la espuma en función del tiempo. Los parámetros medidos son el mantenimiento del volumen de la espuma o su disminución a un tiempo fijo o el tiempo medio de colapso que es el tiempo requerido para alcanzar la mitad del volumen de espuma inicial. 2

3 3 DESARROLLO PRÁCTICO Nº 3 Consignas PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS PROPIEDADES EMULSIONANTES Y ESPUMANTES - Determinar el poder emulsionante de las proteínas mediante la medida de la capacidad emulsionante (CE) utilizando el método que determina el punto de inversión de la emulsión por cambio de color. - Determinar el poder estabilizante de las proteínas mediante a) La medida de la estabilidad de la emulsión (IE) a través de la cinética de floculacióncremado de una emulsión utilizando el método de Dagorn-Scaviner (Método volumétrico) b) La medida de la resistencia a la coalescencia de una emulsión por el método de Graham. - Estudiar propiedades espumantes de las proteínas de la clara de huevo evaluando: a) Capacidad espumante mediante la medida de la expansión de la espuma. b) Estabilidad de la espuma mediante la medida del drenaje del líquido y el colapso de la espuma. En ambos casos se evaluarán espumas obtenidas por batido. Poder emulsionante Medida de la capacidad emulsionante (CE) Método de Jiménez-Colmenero y García Matamoros (determina punto de inversión por medidas eléctricas). Este método emplea una licuadora (tipo doble cuchilla) en cuyo vaso hay fijados, en dos orificios a nivel de la base, dos electrodos diametralmente opuestos. Los electrodos se pueden conectar externamente a un óhmetro. - Proteínas del suero de la leche - Aceite - Licuadora conectada a un óhmetro : 1. Colocar en el vaso de la licuadora con el óhmetro desconectado, 100 ml de agua y 300 mg de proteína y pesar. 2. Conectar el óhmetro a los electrodos. 3. Homogenizar a baja velocidad durante 45 seg. 4. Luego llevar a velocidad máxima de licuado. 5. Agregar aceite a velocidad 0,3 gotas/seg. a través de un orificio realizado en la tapa del vaso. Figura 4. Hasta que se produzca la inversión de la emulsión. El colapso de la emulsión (punto de inversión) se detecta por un aumento brusco de la resistencia eléctrica. 6. Detener el agregado de aceite. 7. Desconectar el óhmetro. 8. Pesar el vaso con su contenido. La cantidad de aceite emulsificado (AE) se determina por diferencia entre los pesos del vaso antes y después del agregado de aceite. La capacidad emulsionante se calcula: 3

4 4 CE = AE g / Proteína g Inconvenientes: - El tiempo total de emulsificación y el volumen total de la emulsión no son constantes - El valor de CE depende de la velocidad de agregado de aceite y geometría del homogeneizador. - Incorporación de aire e incremento de la temperatura. - La viscosidad alta dificulta la determinación del punto de inversión. Esquema del procedimiento de determinación de la capacidad emulsionante de una proteína por medida de la resistencia eléctrica (Jiménez-Colmenero y García Matamoros, 1981) Método que determina el punto de inversión de la emulsión por cambio de color: - Proteína de suero lácteo, aislado de proteína de soja nativa y desnaturalizada, leche descremada en polvo (35 % proteína) - Aceite vegetal - Pipetas - Sudán (Colorante liposoluble) - Licuadora 4

5 5 1. Agregar al vaso de la licuadora 50 ml de agua y 150 mg de proteína. 2. Pesar el vaso con el contenido. 3. Llevar a velocidad máxima de licuado unos 45 seg. 4. Agregar aceite, al que se le adiciona previamente un colorante liposoluble (Sudán) a un caudal constante de aproximadamente 3 gotas/segundo, hasta la inversión de la emulsión. La determinación del punto de inversión se realiza visualmente. 5. Detener el agregado de aceite y pesar el vaso nuevamente. La cantidad de aceite emulsificado se determina por diferencia entre los pesos del vaso antes y después del agregado de aceite. La capacidad emulsionante se expresa en g aceite por g proteína. CE = AE g / Proteína g Medida de la actividad emulsionante (AE) Método de Pearce y Kinsella: Determina la actividad emulsionante como una medida turbidimétrica. Se fundamenta en la turbidez producida por una dispersión de partículas es proporcional al área interfacial creada durante el proceso de emulsificación. Pearce y Kinsella definen la actividad emulsionante como el área interfacial creada y estabilizada por una concentración dada de proteína y la expresan por el índice de actividad emulsionante: IAE = (2 x Turbidez) /(f x C) = [m 2 / g] Donde: IAE: índice de actividad emulsionante Turbidez (T) = (2.303 x Abs) / (Camino óptico de la cubeta) C: Concentración de proteína en la fase acuosa f: Fracción de volumen de la fase oleosa f = [W d (E x W 1 ) ] / (W d + W 1 [((1+E) x D o ) / D m )-E]) Donde: W d : Peso seco / peso de emulsión W 1 : Pérdida de peso de la emulsión por secado / peso de emulsión E: Concentración de soluto (masa por unidad de masa del solvente) D m : Densidad de la dispersión proteica D o : Densidad el aceite Estimación del tamaño de partícula medio R: Volumen / área: aporta una idea del radio medio de las partículas R = (3 x f ) / (2 x Turbidez) - Proteína de suero lácteo, aislado de proteína de soja nativa y desnaturalizada, leche descremada en polvo (35 % proteína) - Aceite vegetal - Pipetas - Buffer fosfato 0,1 M ph 7 - SDS - NaCl 0,1 M 5

6 6 - Mezcladora ultraturrax - Espectrofotómetro - Estufa 1. Homogenizar 30 ml de dispersión proteica (1mg / ml en buffer fosfato 0,1 M ph 7) + 10 ml de aceite con ultraturrax a r.p.m. durante 30 seg. 2. Diluir la emulsión 250 veces (1/10 + 1/25) con una solución estabilizadora compuesta por 0,1 % p/v SDS, 0,1 M NaCl, buffer fosfato 0,1 M ph Leer la absorbancia a 500 nm. Para determinar el valor de f pesar exactamente 2 ml de emulsión y secar hasta peso constante. Precauciones: - Evitar la incorporación de aire, la formación de flóculos y el cremado durante la lectura. - Cuidar la forma de la dilución y tiempo entre diluciones sucesivas. Poder estabilizante Medida de la estabilidad de la emulsión Método de Dagorn-Scaviner. Medida de la cinética de floculación-cremado de una emulsión. (Volumétrico). - Proteína de suero lácteo, aislado de proteína de soja nativa y desnaturalizada, leche descremada en polvo (35 % proteína) - Aceite vegetal - Pipetas - Buffer fosfato 0,1 M ph 7 - Mezcladora ultraturrax - Cronómetro 1. Colocar en un vaso de precipitado 10 ml de aceite + 30 ml de dispersión de proteínas (0,3 y 1,5 mg / ml) en un buffer de ph y fuerza iónica determinados. 2. Introducir el vástago del Ultraturrax en la mezcla, encender el equipo y colocar el selector de velocidades en la posición 5 (20000 r.p.m. aproximadamente) durante 30 segundos a 1 min. 3. Luego y en forma inmediata, se vuelca en una probeta graduada de 10 ml. Figura A partir del momento en el que se completan los 10 ml en la probeta (t = 0) iniciar el registro del tiempo con un cronómetro. 5. Observar y medir la interfase (Vt) que aparece como resultado de la separación de una fase inferior y una cremada superior en función del tiempo, al principio cada 10 segundos hasta 1 minuto, luego cada 1 minuto hasta los 5 minutos, cada 10 minutos hasta 30 minutos y una 6

7 7 lectura final a los 180 minutos. La cinética de este proceso es cuantificada por la medida del volumen (V t en ml) de fase acuosa a distintos tiempos (t), hasta no más de 180 min. 6. Medir a las 24 hs el volumen de la fase acuosa en el equilibrio (V e ). 7. Determinar el índice de estabilidad (IE) como: 8. Graficar V t en función de tiempo. IE = h capa inferior / h emulsión x 100 Inconvenientes: - Poca nitidez de la interfase entre la fase acuosa y cremada en los primeros minutos de la desestabilización. Medida de la cinética de floculación cremado de una emulsión (Dagorn Scaviner et al., 1986). Método de Graham. Medida de la resistencia a la coalescencia de una emulsión. - Proteína de suero lácteo, aislado de proteína de soja nativa y desnaturalizada, leche descremada en polvo (35 % proteína) - Aceite vegetal - Pipetas - Tubos ependorff - Pipeta Pasteur - Buffer fosfato 0,1 M ph 7 - Mezcladora ultraturrax - Cronómetro - Centrifuga 7

8 8 1. Tomar 3 ml de la emulsión preparada en el punto anterior para estudiar la estabilidad de las emulsiones y colocarlos en dos tubos ependorf f de 1,5 ml. 2. Pesar 3. Centrifugarlos durante 5 min a 3000 r.p.m. (centrífuga Rolco). 4. Separar la fase grasa con pipeta Pasteur y volver a pesar el tubo y calcular el volumen a partir de la densidad. Figura Calcular el % de coalescencia para las dos concentraciones de proteína. Coalescencia (%) = (V de grasa liberada de la emulsión / V de grasa inicial) X 100 Medida de la resistencia a la coalescencia de una emulsión (Graham, 1976). Propiedades espumantes de las proteínas Medida de las propiedades espumantes de las proteínas por batido Muestra: - Clara de huevo, leche en polvo descremada s de 50 y 100 ml - Espátula y vaso de precipitado - Sacarosa - Batidora - Balanza - Cronómetro 1. Preparar 100 ml de dispersiones de clara de huevo al 10 % p/p con el agregado de sacarosa (0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 % p/p) 2. Batir a máxima velocidad 3 min. 3. volcar la espuma formada en una probeta graduada y luego medir: 8

9 9 a). Volumen total de espuma después del batido (V E ). b). Volumen de líquido incorporado a la espuma c). Volumen de líquido drenado en función del tiempo cada 5 min durante 30 min. d). Volumen de la espuma en función del tiempo cada 5 min durante 30 min. 4. Con los valores obtenidos calcular: a) Expansión de la espuma y graficar en función de la concentración de sacarosa. Expansión = 100 V E / V L También se puede calcular de la siguiente forma Expansión = 100 (V E V LE ) / V L = 100 V A / V L ( Da idea de la capacidad del liquido batido de incorporar y retener un volumen de aire V A ) b) Graficar V LE en función de la concentración de sacarosa. c) Graficar volumen del liquido drenado y volumen de la espuma función del tiempo. d) Analizar las diferencias en la formación y en la estabilidad de las espumas obtenidas. Bibliografía V LE = Líquido incorporado a la espuma Representación esquemática de la formación de una espuma. CHEFTEL J. C., CUQ J. L. Y LOIENT D. Proteínas alimentarias. Bioquímica. Propiedades funcionales. Valor nutritivo. Modificaciones químicas. Editorial Acribia. (1989). Zaragoza, España. FENNEMA, O. R., PARKIN, K. L. DAMORAN, S. Fennema química de los alimentos. 3 a edición, Editorial CRC Press. Edición en la lengua española editorial Acribia S. A. (2010) España. GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE LABORATORIO. Cátedra de química de los alimentos. Licenciatura en ciencia y tecnología de alimentos. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires (2007). GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS: Propiedades funcionales. Cátedra de propiedades físicas y químicas de los alimentos ll. Facultad de Ciencias Exactas. UNLP. (2007). PILOSOF A. M. R. Y BARTHOLOMAI G. B. Caracterización funcional y estructural de proteínas. Editorial Eudeba. (2000). Bs. As. Argentina. SALFIELD J. R. (1977). Prácticas de ciencias de los alimentos. Editorial Acribia, Zaragoza, España. 9