IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli DIARREOGÉNICAS EN MUESTRAS CLÍNICAS (HECES) Y DE ALIMENTOS EN EL ESTADO DE SINALOA

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli DIARREOGÉNICAS EN MUESTRAS CLÍNICAS (HECES) Y DE ALIMENTOS EN EL ESTADO DE SINALOA TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD PRESENTA: Q.F.B. EDGAR RAFAEL GONZÁLEZ NÚÑEZ DIRECTORES DE TESIS: DR. ALDO ARTURO RESÉNDIZ ALBOR DR. VICENTE ADRIÁN CANIZALEZ ROMÁN MÉXICO, D. F. JULIO 2011

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4 AGRADECIMIENTOS Esta tesis fue realizada en la Facultad de Ciencias Químico-Biológicas de la Universidad Autónoma de Sinaloa, bajo la dirección del Dr. Vicente Adrián Canizalez Román (Profesor- Investigador de la Facultad de Medicina). En colaboración con el laboratorio de Inmunología de las Mucosas del Departamento de Bioquímica de la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, en la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, bajo la Dirección del Dr. Aldo Arturo Reséndiz Albor (Profesor- Investigador del IPN). Como parte del proyecto titulado: Identificación de Escherichia coli diarreogénicas en muestras clínicas (heces) y de alimentos en el Estado de Sinaloa. Durante la realización de esta tesis, el autor recibió una beca institucional por un año (No. de Boleta. B091273), beca PIFI por un semestre, beca CONACYT (Núm. de becario ) por un año. Además de contar con apoyo económico de la beca programa de Fomentó y Apoyo a Proyectos de Investigación (PROFAPI- UAS) No. Del proyecto 2008/027 para obtener el grado de Maestría en Ciencias de la Salud, Área Inmunología durante Agosto del 2009 a Julio del 2011.

5 I. ÍNDICE GENERAL I. ÍNDICE GENERAL...i ABREVIATURAS iii ÍNDICE DE CUADROS.v ÍNDICE DE FIGURAS...vii RESUMEN...ix ABSTRACT.xii II. INTRODUCCIÓN 1 A. ANTECEDENTES GENERALES ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS ENFERMEDADES CAUSADAS POR ALIMENTOS CONTAMINADOS A NIVEL MUNDIAL COLIFORME 9 a. ESCHERICHIA COLI 10 1). MORFOLOGÍA DE E. COLI..11 2). METABOLISMO E. COLI..12 3). OTRAS PRUEBAS QUE RESULTAN POSITIVAS..12 4). ESTRUCTURA ANTIGÉNICA DE E. COLI 13 B. ANTECEDENTES DIRECTOS CATEGORÍAS DE E. COLI 14 a. E. COLI ENTEROTOXIGÉNICA (ETEC)..14 b. E. COLI ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC)...15 c. E. COLI ENTEROINVASIVA (EIEC) 18 d. E. COLI ENTEROPATÓGENA (EPEC)...20 e. E. COLI ENTEROAGREGATIVA (EAEC)...21 f. E. COLI DE ADHERENCIA DIFUSA (DAEC) TRATAMIENTO..27 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.28 IV. JUSTIFICACIÓN...30

6 VI. HIPOTESIS.. 32 VI. OBJETIVOS..33 A. OBJETIVO GENERAL.33 B. OBJETIVOS PARTICULARES...33 VII. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL.34 VIII. MATERIALES Y MÉTODOS..35 A. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Y CLÍNICAS POBLACIÓN DE ESTUDIO AISLAMIENTO DE E. COLI IDENTIFICACIÓN DE LAS E. COLI DIARREOGÉNICAS EXTRACCIÓN DE DNA AMPLIFICACIÓN POR PCR AMPLIFICACIÓN POR PCR MÚLTIPLE AMPLIFICACIÓN CON PCR MÚLTIPLE E INDIVIDUAL DETECCIÓN DEL DNA AMPLIFICADO PURIFICACIÓN DNA...46 IX. RESULTADOS...47 X. DISCUSIÓN...77 XI. CONCLUSIONES...85 XII. PERSPECTIVAS...87 XIII. REFERENCIAS...88 ANEXOS...101

7 ABREVIATURAS (A/E): Adherencia y Esfacelación. AH: Aguas y Hielo. BGN: Bacilo Gram Negativo. CH: Colitis Hemorrágica. CAR: Cárnicos. CENAVESE: Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica y Control de Enfermedades. CDC: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. E.coli: Escherichia coli. STEC: E. coli productora de la toxina shiga. (ETEC): Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICA. (EHEC): Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA. (EIEC): Escherichia coli ENTEROINVASIVA. (EPEC): Escherichia coli ENTEROPATÓGENA. (EAEC): Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA. (DAEC): Escherichia coli DE ADHERENCIA DIFUSA. ETA: Enfermedades Transmitidas por los Alimentos. FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. FDA: Administración de Drogas y Alimentos. INSP: Instituto Nacional de Salud pública de México ITU: Infección del Tracto Urinario. LD: Lácteos y Derivados. LIA: Agar Hierro Lisina. LT: Toxina Termolábil. LEPS: Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sinaloa. LPS: Lipopolisacáridos. MDa: Megadaltones. MIO: Movilidad Indol Ornitina.

8 NMP: Numero más Probable. PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa. PM: Pescados y Mariscos. PRE: Alimentos Preparados. SHU: Síndrome Urémico Hemolítico. ST: Toxina Termoestable. STX1: Toxina Shiga. STX2: Toxina Shiga. TSI: Triple Azúcar Hierro. VT: Verotoxina. WHO: Organización Mundial de la Salud RESPYN: Revista Salud Pública y Nutrición

9 ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1 Características de las categorías de E. coli causantes de diarrea. 25 Cuadro 2 Clasificación por grupo de alimentos. 36 Cuadro 3 Cuadro 4 Cuadro 5 Primers utilizados en la PCR para la amplificación del gen 16s RNAr para la identificación de E. coli. Primers utilizados en la PCR múltiple para la amplificación de los genes de las diferentes categorías de E. coli diarreogénicas. Detección y frecuencia de E. coli en los grupos de alimentos analizados Cuadro 6 Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupo de Alimentos en los años 2007 al Cuadro 7 Detección y frecuencia de las categorías de E. coli diarreogénicas en los alimentos analizados por PCR múltiple. 56 Cuadro 8 Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por alimentos. 58 Cuadro 9 Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupo de edad. 70

10 Página Cuadro 10 Detección y frecuencia de las categorías de E. coli diarreogénicas en las muestras clínicas (heces) por grupos de edad. 72

11 ÍNDICE DE FÍGURAS Página Figura 1 Esquema de patogenicidad de E. coli causante de diarrea. 26 Figura 2 Esquema de identificación de E. coli mediante PCR. 34 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Crecimiento de cepas control de E. coli sobre Agar MacConkey. Amplificación DNA de la región del gen 16s RNA (16E1, 16E2, 16E3) por PCR. Amplificación de DNA por PCR múltiple de los genes de las categorías de E. coli causantes de diarrea Figura 6 Amplificación de DNA por PCR de los genes del serotipo STEC O157:H7. 45 Figura 7 Distribución geográfica de los puntos donde se realizó el muestreo de Alimentos en el Estado de Sinaloa. 48 Figura 8 Grupos de Alimentos analizados. 50 Figura 9 Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. 54 Figura 10 Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreo- 61 génicas identificadas por municipio en el Estado de Sinaloa. Figura 11 Distribución por meses de E. coli y cepas diarreogénicas en 63 los años 2007 al Figura 12 Distribución geográfica de los puntos donde se tomaron mue- 65 stras de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el Estado de Sinaloa.

12 Página Figura 13 Grupos de edad de las muestras clínicas analizadas en este estudio. 67 Figura 14 Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. 69 Figura 15 Figura 16 Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por municipio en el Estado de Sinaloa en el año 2008 al En muestras clínicas. Distribución por meses de las cepas de E. coli diarreogénicas en los años 2008 al

13 RESUMEN Hoy en día ha habido un considerable incremento de brotes ocasionados por E. coli diarreogénicas estas categorías son clasificadas en base a sus factores de virulencia (toxinas, plásmidos, fimbrias y factores de señalización) y pueden ser únicamente identificados por estas características. Estas cepas están afectando a miles de personas (morbilidad y mortalidad) en diferentes países, así como también en México. Además, de que el origen principal de este incremento de brotes es la contaminación de los alimentos por estos patógenos, convirtiéndolos en los vehículos ideales de transmisión de infecciones a los humanos (mundo globalizado, tránsito de personas y alimentos). Por lo que el objetivo de este trabajo es determinar la presencia y distribución de los factores genéticos de las categorías de E. coli causantes de diarrea y su prevalecía en diferentes alimentos y muestras clínicas de heces de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el Estado de Sinaloa. El aislamiento de las posibles cepas de E. coli tanto en muestras clínicas (heces) como en alimentos se llevó a cabo mediante el método convencional Agar MacConkey medio selectivo. La identificación de E. coli se realizó mediante PCR individual la región del gen 16s RNAr con los primers u oligonucleotidos (16E1, 16E2, 16E3) y la Identificación de las E. coli diarreogénicas se realizó mediante PCR múltiple: Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virf), ADEC (daae), EAEC (aggr, aafii), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbe O157, flic H7) y la enterohemolisina ( hlya). Al analizar las muestras de alimentos se observó que la frecuencia de identificación de E. coli fue de un 8.0 % (n=412/5162). De estas 412 muestras contaminadas por E. coli, el 13.2% (54/412) correspondieron a E. coli diarreogénicas o potenciales productoras de diarreas y 87% (358/412) no presentaron genes de las categorías buscadas. La categoría de E. coli diarreogénicas identificada más frecuentemente fue EPEC en un 83% (45/54; 9 típicas and 36 atípicas) seguida por STEC (9%;

14 5/54), ETEC (4%; 2/54) y EAEC (4%; 2/54).Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los genes de virulencia que corresponden a DAEC o EIEC. El alimento que presento una mayor proporción de E. coli diarreogénicas fueron los productos lácteos, cárnicos y la comida preparada, aunque no se observó una tendencia de alguna categoría por algún grupo de alimento. Nosotros concluimos que las cepas patógenas de E. coli diarreogénicas (EPEC, STEC, EAEC y ETEC) están presentes en un (1.5%; 54/5162) in los alimentos que se consumen y distribuyen en el norte de México. Al analizar las muestras clínicas (heces), se encontró que la frecuencia de identificación de E. coli diarreogénicas en personas que presentaban un cuadro clínico diarreico fue del 26% (31/117), encontrándose que el 74% (86/117) correspondieron a cepas de E. coli sin genes de virulencia que caracterizan a las cepas no diarreogénicas (no hubo presencia de las categorías de E. coli). De las 31 cepas patógenas, el patógeno más frecuentemente aislado fue EPEC con un 42% (13/31), de las cuales 8 fueron típicas (con el gen eae y bfp) y 5 atípicas (solo con el gen eae). En menor frecuencia se identificó EAEC en un 29% (9/31), ETEC en un 26% (8/31) y DAEC en un 3% (1/31). Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los genes de virulencia que corresponden a EHEC, STEC ó EIEC. Por grupo de edad, se determinó que EPEC (típica y atípica) (19.2%, 11/57) y EAEC (12%, 7/57) fueron más prevalentes entre los grupos de edad de 0-2 años. ETEC fue más prevalente en el grupo de edad de (33%, 2/6) años, seguido 6-10 (30%, 3/10) y años (18%, 2/11). La categoría de DAEC se identificó únicamente en el grupo de edad de 3-5 años (5%, 1/18). Ninguna de las E. coli diarreogénicas fueron identificadas en los grupos de edad de y años. Los resultados muestran que hay una alta proporción de E. coli productoras de diarrea o diarreogénicas en pacientes con diarrea aguda ó persistente, en donde predomina E. coli enteropatógena EPEC (típica). Estos resultados confirman la presencia de estas cepas patógenos de E. coli diarreogénicas (EPEC, ETEC, EAEC y STEC) en alimentos que se consumen,

15 venden y distribuyen en Sinaloa con una frecuencia de 1.1% (54/5162), lo cual correlaciona con la presencia de estos patógenos en humanos (EPEC, ETEC, EAEC y DAEC), pero con una frecuencia mayor 26.4% que en alimentos. La presencia de cepas diarreogénicas de E. coli en los grupos de alimentos, podrían jugar un papel importante como agentes etiológicos causantes de diarrea en Sinaloa y son un indicador directo de la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos que circulan en el Estado de Sinaloa.

16 ABSTRACT Contaminated food is the principal vehicle for transmission of pathogenic strains of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) to humans. This study reports the epidemiological surveillance of Escherichia coli strains in 5162 food service establishment and retail food samples, consisting of Ice and Water (n=1596), restaurant-made food or street food (n=1594), dairy products (n=669), fish and seafood (n=656), meat and meat products (n=647). Samples were collected in 10 municipalities of Sinaloa State located at the NorthWest of Mexico during January- December in 2007 and Materials and Methods. E. coli strains were isolates by conventional methods of food microbiology. To detect DEC strains, multiplex PCR and single PCR reactions were performed that amplified genes of recognized virulence factors of enteroaggregative (EAEC; aggr and aafii genes), enteroinvasive (EIEC; Ipah and VirF), enteropathogenic (EPEC Typical; eae and bfp or EPEC Atypical; eae), enterotoxigenic (ETEC; st y lt), diffusely adherent (DAEC; daae) or shiga toxin-producing (STEC; stx1/stx2 or EHEC; eae, stx1/stx2, or hlya) E. coli strains. For this study were designed primers for the category of EPEC (eae and bfp) and EHEC (stx1/stx2) with oligo software version 7. Results. Bacteriological analysis detected that 8.0% (412/5162) of the food samples were contaminated with E. coli strains, with non-permissive levels for human consumption. Of those, 13.2% corresponded to DEC strains (54/412), as detected by multiplex PCR. The diarrheagenic category most frequently isolated was EPEC with 83% (45/54; 9 typical and 36 atypical) followed by STEC (9%; 5/54), ETEC (4%; 2/54) and EAEC (4%; 2/54) also. None of our E. coli isolates harbored virulence genes corresponding to DAEC and EIEC. The food items most contaminated with DEC strains were dairy products, meat samples and prepared foods, although we did not find a tendency for a specific diarrheagenic category. Conclusion. We conclude that potentially pathogens DEC strains (EPEC, STEC, EAEC and ETEC pathotypes) are present (1.1%; 54/5162) in food products that are consumed, sold or/and distributed at Northwest of Mexico.

17 Diarrheagenic Escherichia coli strains are being recognized as important clinical enteropathogens worldwide. However, it is unclear whether there are differences in age-related susceptibility to specific strains. This study aimed at investigating DEC among patients (from 3 months to 99 year old) with acute/persistent diarrhea at Northwest of Mexico during January- December in 2008 and Materials and Methods. DEC were isolated from stool samples collected from 117 patients with acute/persistent diarrhea. Fecal samples were cultured and identified according to the standard biochemical methods and three oligonucleotide primers 16E1, 16E2 and 16E3 were used to identify specifically all E. coli isolates by PCR. To detect DEC strains, multiplex PCR and single PCR reactions were performed that amplified genes of recognized virulence factors of enteroaggregative (EAEC; aggr and aafii genes), enteroinvasive (EIEC; Ipah and VirF), enteropathogenic (EPEC Typical; eae and bfp or EPEC Atypical; eae), enterotoxigenic (ETEC; st y lt), diffusely adherent (DAEC; daae) or shiga toxinproducing (STEC; stx1/stx2 or EHEC; eae, stx1/stx2, or hlya) E. coli strains. For this study were designed primers for the category of EPEC (eae and bfp) and EHEC (stx1/stx2) with oligo software version 7. Results. Thirty-one patients (26.4%) harbored DEC (from 117). The most frequently isolated pathogen was Enteropathogen (EPEC) Escherichia coli with 42% (13/31; 8 typical and 5 atypical) followed by EAEC with 29% (9/31), ETEC with 26% (8/31) and DAEC with 3% (1/31). None of our E. coli isolates harbored virulence genes corresponding to STEC and EIEC. By the age group; EPEC typical or atypical (19.2%, 11/57) and EAEC (12%, 7/57) were more prevalent among the age group 0-2 years old. ETEC was more prevalent among the age group (33%, 2/6) years old, followed by 6-10 (30%, 3/10) and (18%, 2/11) years old. DAEC only was identified among the age group 3-5 years old (5%, 1/18). None of DEC isolates were identified among the age group and years old. The results show a high proportion of DEC among patients with acute/persistent diarrhea at Northwest of Mexico, with typical EPEC predominating.

18 II. INTRODUCCIÓN La diarrea es una alteración de las heces en cuanto a volumen, fluídez o frecuencia en relación anormal a la fisiológica, lo cual conlleva una baja absorción de líquidos y nutrientes, pudiendo estar acompañada de dolor, fiebre, náuseas, vómito, debilidad o pérdida del apetito. De acuerdo con cifras de la Organización Mundial de la Salud, la diarrea es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, íntimamente asociada a la deshidratación. Además de la gran pérdida de agua que supone las evacuaciones diarréicas, los pacientes, por lo general niños, pierden cantidades peligrosas de sales importantes, electrolitos y otros nutrientes. La diarrea afecta a todas las razas, sexos, edades y regiones geográficas del mundo (Mandell, et al., 1999, WHO, 2009). Las enfermedades diarreicas han constituido un problema importante de salud pública en el mundo; Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea en todo el mundo. Las enfermedades diarreicas son una causa principal de mortalidad y morbilidad en la niñez en el mundo, y por lo general son consecuencia de la exposición a alimentos o agua contaminados. En todo el mundo, alrededor de mil millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua mejoradas y unos 2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento. La diarrea causada por infecciones es frecuente en países en desarrollo (WHO, 2009). En México se ha reportado un incremento en la incidencia de diarreas (Informe de Gobierno, 2002). En realidad, ese incremento en casos reportados solo refleja parcialmente la magnitud del problema, ya que debemos considerar que la mayoría de casos no se informan a las autoridades de salud. La alta incidencia de infecciones gastrointestinales se relaciona con la superficie media del intestino que en el humano alcanza los 340 m 2 (Mandell, et al., 1999), lo que lo hace un blanco importante para los patógenos. En México, en 2005, se produjeron 5.9 millones de casos de enfermedades intestinales, el 13.8% del total de padecimientos registrado al nivel nacional, ocupando el segundo lugar luego de las enfermedades 1

19 respiratorias (DGEPI, 2006). Mientras que en el Estado de Sinaloa, las enfermedades diarreicas son responsables de más del 40% de la morbilidad por causas infecciosas. En el 2006 se presentaron 280,204 de enfermedades infecciosas intestinales (SSA), de las cuales un alto porcentaje (58% infecciones intestinales) aunado a que se desconoce el agente causal (posiblemente un gran numero son E. coli diarreogénicas). Debido a la escasa disponibilidad de pruebas diagnósticas implementadas en el sector de salud. En Sinaloa, el panorama epidemiológico de casos infecciosos está propiciado principalmente por el clima y temperatura habituales en el Estado, donde los microorganismos pueden desarrollarse fácilmente, además de la aparición de patógenos emergentes y reemergentes (SSA.SIN, 2008). Dentro de estos patógenos causantes de enfermedades gástricas importantes, también se encuentra E. coli, la cual puede ser responsable de diarreas y de enfermedades que llegan a ser muy graves, como la colitishemorrágica y síndrome urémico (Banatvala, et al., 2001, Rodríguez-Ángeles, 2002). Sin embargo, existen varias maneras de interaccionar con el epitelio intestinal y de causar de diarrea por E. coli. En diversos estudios han encontrado que las E. coli que causan diarrea (cepas diarreogénicas) son las bacterias más frecuentemente aislada de niños con diarrea (Levine, et al., 1993). Y que son tan prevalentes como otros patógenos, como Salmonella (Nishikawa, et al., 2002). Además, se ha sugerido recientemente (2005) que el 10% de todas las gastroenteritis agudas producidas en niños en los Estados Unidos, son producidas por las E. coli diarreogénicas (Cohen, et al., 2005). Posiblemente este porcentaje es mucho mayor en países en vías de desarrollo como el nuestro. E. coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor Von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de E. coli, en honor a su descubridor (Koneman, et al., 1999, Prescott, 1999, Curret opinión in microbiology 1998). Es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu 2

20 Escherichia, cuyas principales características bioquímicas son producción de indol, rojo de metilo, fermentación de lactosa, movilidad, nitrato a nitrito, ácido de glucosa, gas de glucosa (Sánchez-Veja, 2003, Farmer, 1995), E. coli es una bacteria mesófila, es decir se desarrollan a temperatura de 20 a 45 grados Celsius. Con una temperatura optima del 37c y se desarrollan a un ph de 6-8 (Koneman 1999, Sánchez-Veja, 2003). Esta bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se le considera un microorganismo de la flora normal, permanece en el lumen intestinal sin causar daño, sin embargo en hospederos debilitados o inmunosuprimidos, o cuando las barreras gastrointestinales son violadas hay cepas que pueden ser patógenas y causar daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Boop et al.,1999, Farmer, 1995). Hay diversas clonas de E. coli que han adquirido atributos específicos de virulencia, los cuales le confieren la habilidad de adaptarse a nuevos nichos, permitiéndole causar un amplio espectro de enfermedades. Esta exitosa persistencia de las combinaciones de factores génicos relacionados con virulencia, han llevado a la clasificación de las E. coli en patotipos específicos o categorías que son capaces de causar enfermedades intestinales y extraintestinales (Kaper et al., 2004). Entre los tipos de bacterias más nocivas se encuentra E. coli productora de la toxina Shiga, puede producir síndrome urémico hemolítico, condición que puede llevar a una insuficiencia renal (Who, 2005). Se sabe que los rumiantes (vacas, ovejas, venados) son los principales portadores de E. coli O157-H7 y esparcida por medio de sus defecaciones. Tal es el caso reportado el 12 de octubre del 2006 por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) y el estado de California reportaron un brote de E. coli O157:H7 el cual se detectó en una finca de espinacas, dicho brote era proveniente de la materia fecal de ganado de dicha finca. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), la espinaca contaminada por esta cepa ocasionó que 204 personas enfermaran, entre los cuales se incluyen 31 casos de un tipo de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS),104 3

21 hospitalizaciones y 3 defunciones (FDA, 2006). Uno de los brotes más recientes causado por E. coli O157:H7 fue reportado el 4 de enero del 2010 en 16 estados de los Estados Unidos. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), la carne de vacunos y aves contaminadas por esta cepa ocasionó que 21 personas enfermaran, entre los cuales incluyen 1 caso de un tipo de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS) y 9 hospitalizaciones (CDC, 2010). Y el brote más reciente reportado en el presente año 2011 en el mes de mayo en Alemania y Suecia. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), el posible origen del contagio ha sido atribuido al germinado de soya, donde los últimos datos sobre la epidemia revelan que 3235 personas han contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres. Más de 700 alemanes siguen internados en hospitales al haber desarrollado el síndrome urémico hemolítico y hasta el momento se han reportado 37 muertes, debido a un nuevo serotipo de EHEC O104:H4 (CDC, 2011). Debido a este incremento en los brotes producidos por las categorías de E. coli. En este proyecto nos enfocaremos a cepas de E. coli diarreogénica o comúnmente como E. coli patogénicas, estas categorías son clasificados en base a sus factores de virulencia (toxinas, plásmidos, fimbrias y factores de señalización) y pueden ser únicamente identificados por estas características. Dentro de las infecciones intestinales, las E. coli se han clasificado en seis grupos: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrágica también conocidas como productoras de toxina vero o toxina semejante a shiga (EHEC o VTEC o STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli de adherencia difusa (DAEC) (Eslava et al.1994, Nataro et al., 1998). Una vez que la colonización se establece, las estrategias patogénicas de E. coli diarreogénica muestran una variedad remarcable. Tres paradigmas generales han sido descritos por el cual E. coli puede causar diarrea: i) producción de enterotoxinas (ETEC y EAEC), ii) invasión (EIEC), y/o iii) adherencia con señalizadores de membrana (EPEC, EHEC y 4

22 DAEC). Sin embargo, la interacción del microorganismo con la mucosa intestinal es específica para cada categoría (Eslava et al.,1994, Nataro et al., 1998). 5

23 A. ANTECEDENTES GENERALES 1. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS (ETA) Las ETA son aquellas ocasionadas por el consumo de alimentos contaminados con las cantidades suficientes de microorganismos patógenos o de productos de su metabolismo que sean tóxicos para el ser humano; produciendo una serie síntomas que afectan la salud del consumidor En forma individual o colectiva. Hasta el 2005 se habían descrito más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos (Rosas GA, 2001, González-Flores, 2005). La mayoría ocasionada por bacterias, presentes en los alimentos, en cantidades elevadas. Los alimentos que se utilizaron en este trabajo se encuentran los alimentos preparados (bajo el procesos de picado, molienda, cocción, etc.), productos lácteos, aguas, hielos, pescados y mariscos (crudos), cárnicos (carnes crudas) Enfermedades causadas por alimentos contaminados a nivel mundial Las enfermedades transmitidas por alimentos se han ido expandiendo poco a poco por los países del mundo, tanto desarrollados como en vías de desarrollo. Sin respetar fronteras, han causado cuantiosas pérdidas de vidas humanas, como grandes pérdidas económicas (González-Flores, 2005, Díaz, C. 2003). La falta de higiene y la carencia o el mal funcionamiento de los servicios sanitarios, son algunas de las razones por las que la diarrea continúa representando un importante problema de salud en países en desarrollo (FDA, 2002). En los países industrializados las enfermedades transmitidas por alimentos contaminados microbiológicamente afectan a un 30 % de la población; En países industrializados, como Estados Unidos, el porcentaje de casos de personas que padecen alguna enfermedad asociada a los alimentos ha sido reportado en un 30% (OMS) por ejemplo: de 76 millones de casos 325 mil son hospitalizados y 5 mil defunciones (WHO, 2005). La incidencia global de las enfermedades transmitidas por alimentos es difícil de estimarse. Pero se ha divulgado que solo en el año 2000, 2.1 millones de fallecimientos por enfermedades diarreicas (Vásquez-Arroy and Cabral-Martell, 2001). 6

24 Las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de muerte de niños menores de cinco años, y ocasionan la muerte de 1,5 millones de niños cada año. La diarrea puede durar varios días y puede privar al organismo del agua y las sales necesarias para la supervivencia. La mayoría de las personas que fallecen por enfermedades diarreicas en realidad mueren por una grave deshidratación y pérdida de líquidos. Los niños malnutridos o inmunodeprimidos son los que presentan mayor riesgo de enfermedades diarreicas potencialmente mortales (WHO, 2009). Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea en todo el mundo. Las enfermedades diarreicas son una causa principal de mortalidad y morbilidad en la niñez en el mundo, y por lo general son consecuencia de la exposición a alimentos o agua contaminados. En todo el mundo, alrededor de mil millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua mejoradas y unos 2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento. La diarrea causada por infecciones es frecuente en países en desarrollo (WHO, 2009). En 2004, las enfermedades diarreicas fueron la tercera mayor causa de muerte en países de ingresos bajos, donde ocasionaron el 6,9% de los fallecimientos. Son la segunda mayor causa de muerte de niños menores de cinco años, tras la neumonía. De los 1,5 millones de niños que fallecieron por enfermedades diarreicas en 2004, el 80% tenían menos de dos años (WHO, 2009). En países en desarrollo, los niños menores de tres años sufren, de promedio, tres episodios de diarrea al año. Cada episodio priva al niño de nutrientes necesarios para su crecimiento. En consecuencia, la diarrea es una importante causa de malnutrición, y los niños malnutridos son más propensos a enfermar por enfermedades diarreicas (WHO, 2009). Según Kumate e Isibasi, 1986; Kumate, 1998.En los países desarrollados las enfermedades diarreicas representan uno de los problemas de salud pública más importantes, causando repercusiones en el ámbito laboral, social y económico. 7

25 México es una de las naciones que registraban a nivel mundial las tasas de mortalidad más elevadas por estos padecimientos, siendo muy elevados los costos de vidas humanas tanto de recursos médicos destinados a su atención. Olarte 1986, menciona que esto se relaciona a grandes pérdidas de tiempo laborable, siendo una de las primeras causas de ausentismo laboral. En México, la mayoría de los cuadros diarreicos son de naturaleza infecciosa, y como factores de gran importancia son los de carácter sanitario, socioeconómico y laboral (Vásquez-Arroyo and Cabral-Martell, 2001). En México, durante el periodo de 1980 a 1989, el Laboratorio Nacional de Salud Pública, confirmó 58 brotes de toxiinfecciones alimentarias de origen microbiano y parasitario a nivel nacional (Parrilla-Cerrillo, et al., 1993). En el año 2002, el Sistema Nacional de Información en Salud reportó, 3612 casos de intoxicaciones alimentarias de origen bacteriano, de los cuales 173 se presentaron en el estado de Sinaloa (Díaz, 2003). En el año 2005 en México, se produjeron 5.9 millones de casos de enfermedades intestinales, el 13.8% del total de padecimientos registrado al nivel nacional, ocupando el segundo lugar luego de las respiratorias (DGEPI, 2006). Estas estadísticas deben ser tomadas con reservas, debido a que los datos publicados por los sistemas de salud, sólo representan una parte del número verdadero de casos, sin embargo, aunque los sistemas nacionales de información en salud han mejorado substancialmente, aun no se puede precisar cuántas personas contraen toxiinfecciones alimentarias en una región específica. Las infecciones gastrointestinales ocasionadas por bacterias causan enfermedades que atacan a la población en general afectando a las personas de todas las edades y países, en México las infecciones gastrointestinales son unas de las causas de morbilidad y mortalidad muy altas cada año. Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son uno de los problemas de salud pública que difícilmente se erradican en países en vías de desarrollo a diferencia de países desarrollados que una enfermedad como esta es controlada de manera eficiente, en todo caso se le considera emergente o bien reemergente. 8

26 2. COLIFORMES Durante más de medio siglo se ha empleado el grupo coliformes como un indicador del grado de contaminación y por lo tanto, de la calidad sanitaria. Pertenecen al grupo coliformes los bacilos aerobios o anaerobios facultativos, Gram-Negativo, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de las 48 horas de incubación a 35 C. Incluye los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, y especies lactosa positiva de otros géneros. La determinación de coliformes fecales representa la fracción de coliformes presentes en intestinos y materias fecales del hombre o animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes) (FDA, 2002). La presencia de E. coli en un alimento indica que ha tenido lugar una contaminación de origen fecal. Por lo general, la determinación de coliformes se refiere a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuban a C (Urbaneja, 2004). Básicamente se cuenta con dos tipos de microorganismos indicadores: los coliformes fecales y los mesofílicos aerobios (Vázquez-Arroyo et al., 2001). La presencia de éstos dependerá del tipo de alimento y los criterios cambiarán para el caso de alimentos procesados o fermentados que implican la participación de ellos. Estos indicadores cuentan con características que los hacen especiales y son: Presencia constante en la materia fecal. Exclusividad y abundancia en la materia fecal. Incapacidad para multiplicarse en el agua. Sobrevivencia semejante a las de las bacterias patógenas. Facilidad para demostrar en el laboratorio. Los microorganismos patógenos que proliferan en ambientes acuáticos pueden provocar cólera, fiebre tifoidea, disenterías, poliomielitis, hepatitis, salmonelosis, etc. (FDA, 2002). La Organización Mundial de la Salud (OMS), estimó que la morbilidad y mortalidad derivadas de las enfermedades más graves asociadas 9

27 con el agua se reduciría entre un 20 y 80%, si se garantizara su potabilidad y adecuada canalización (FDA, 2002). El agua y los alimentos contaminados se consideran como los principales vehículos involucrados en la transmisión de bacterias, virus o parásitos. Estos organismos habitualmente crecen en el tracto intestinal y abandonan el cuerpo por las heces. Un organismo puede ocupar un nuevo hospedador cuando se ingiere agua que fue contaminada y no tratada adecuadamente. El agua es utilizada como medio de eliminación de excretas y otros desechos; puede también contener microorganismos patógenos de asiento no intestinales (por ejemplo: flora de la piel). Tales gérmenes son destruidos por los mismos mecanismos y medios que suelen utilizarse cuando se tratan las aguas por el proceso ordinario de potabilización. La bacteria más frecuente asociada con los cuadros diarreicos es E. coli, y afecta a todas las edades y estrato social siendo los más susceptibles niños pequeños, alimentados en forma deficiente o niños desnutridos, los que viven bajo inadecuadas condiciones de higiene y con falta de control de excretas, presencia de aguas contaminadas, niños con problemas inmunológicos o la llamada diarrea del viajero (WHO, 2005). a. Escherichia coli Hasta hace poco la tribu Escherichiaea contenía solo una especie: Escherichia coli. En los últimos años se efectuaron dos modificaciones en dicha tribu. Primero se descubrieron nuevas especies de Escherichia. (Pero como estas casi nunca son patógenas para los seres humanos, no se describirán). E. coli fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de E. coli, en honor a su descubridor (Koneman et al., 1999, Prescott, 1999, Curret opinión in microbiology, 1998). E. coli es una especie que pertenece a la familia de las Enterobactereaceae y cuyo hábitat natural es el suelo, el agua, la materia en descomposición y en el tubo intestinal 10

28 del hombre (principalmente intestino grueso) y los animales; por lo que han recibido el nombre de bacilos género, a esta familia pertenecen algunos de los microorganismos responsables y causantes de enfermedad gastrointestinal (Sánchez-Veja, 2003). Se estima que cada gramo de heces humanas contiene hasta 10 8 microorganismos de E. coli. Esta bacteria crece muy bien en medios de gran simplicidad; tiene movilidad y flagelos perítricos; fermenta la lactosa y forma un brillo verdoso sobre el agar de eosina y azul de metileno y color rosa-rojo en agar MacConkey. Tiene actividad de descarboxilasa de lisina; utiliza el acetato como única fuente de carbono e hidroliza el triptófano para formar indol (Stuart 2000, Rodríguez-Ángeles, 2002). Esta bacteria forma parte de la flora normal intestinal, es decir, es un agente oportunista que por lo regular no causa enfermedad en el hombre (saprobio), a menos de que el huésped se encuentre en condiciones apropiadas para el establecimiento de la infección (individuos inmunosuprimidos, en particular en la infancia o en la vejez); además produce ciertas sustancias que resultan benéficas o útiles para el individuo, como son las bacteriocinas o colicinas que son unas sustancias bactericidas de tipo viral las cuales mantienen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de otra especies potencialmente patógenas, relacionadas con la presencia de un plásmido. Sin embargo, E. coli y otros bacilos entéricos son los responsables de la mayor parte de la infecciones nosocomiales; produciendo infecciones localizadas principalmente en vías urinarias aunque también pueden ir al torrente sanguíneo y causar septicemia (Sánchez-Veja, 2003). 1). Morfología de E. coli Son bacilos Gram negativos, pequeños que no pasan de 2 a 3 micras. Pueden tener o no movilidad, cuando son móviles, su locomoción la realizan por medio de flagelos perítricos. Pueden poseer una cápsula bien definida o una cubierta laxa. 11

29 Tienen fimbrias o pilis, que son responsables de la fijación a otras bacterias. La pared celular se compone de mureína, lipoproteína, fosfolípido, proteínas y lipopolisacáridos (LPS); la porción de la lipoproteína- mureína, es la responsable de la rigidez celular y constituye el 20% aproximadamente de la pared celular, el 80% restante se une a los lípidos de la lipoproteína, para formar la bicapa lipídica. Las cadenas laterales polisacáridas específicas del LPS es la porción responsables de los determinantes antigénicos, que es lo que origina la diversidad de especies (Koneman, 1999). 2). Metabolismo E. coli Son aerobias o anaerobias facultativas, cuando se encuentran en anaerobiosis fermentan a los carbohidratos. Son fermentadoras de glucosa y lactosa. Reducen los nitratos a nitritos (Koneman, 1999, Sánchez-Veja, 2003). 3). Otras pruebas que resultan positivas son: a) La hidrólisis del triptófano a indol (identificada por el reactivo de Kovac, con la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio). b) Descarboxilación de la lisina, con la fermentación inicial de glucosa, por lo que el medio se torna amarillo y por la descarboxilación se torna de color púrpura. c) Cuando se aísla de la orina, se identifica con eficacia en agar sangre por la producción de hemólis beta. Son mesófilas, es decir se desarrollan a temperatura de 20 a 45 grados Celsius. Con una temperatura optima del 37c. Se desarrollan a ph de 6-8 (Koneman, 1999, Sánchez-Veja, 2003). 12

30 4). Estructura antigénica de E. coli Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen en 1944 kauffman desarrolló un esquema de serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene 176 antígenos somáticos (O), 112 flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno O es el responsable del serogrupo; la determinación del antígeno somático y flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se asocia con cuadros clínicos en particular (Eslava et al., 1994, Karmali y Beutin, 1998). E. coli productoras de diarrea se han reportado en los últimos 15 años y la incidencia de la enfermedad que producen ha aumentado en muchos continentes (Nataro and Kaper, 1998). Las investigaciones de los brotes de E. coli diarreogénicas indican que su aparición está relacionada en gran parte con el consumo de alimentos contaminados o mal preparados (Albert et al.1999, Watanabe et al. 1996, Welinder-Olsson, 2004 and Reid et al., 2000). Por otro lado, en diversos estudios han encontrado que las E. coli que causan diarrea (cepas diarreogénicas) son las bacterias más frecuentemente aislada de personas con diarrea (Kaper and Nataro, 2004) y que son tan prevalentes como otros patógenos, como Salmonella (Itoh et al., 1998). Además, se ha sugerido recientemente (2005) que el 10% de todas las gastroenteritis agudas producidas en niños en los Estados Unidos, son producidas por las E. coli diarreogénicas (Itoh et al., 1998). Posiblemente este porcentaje es mucho mayor en países en vías de desarrollo como el nuestro, y posiblemente afecta a una gran proporción de personas adultas. 13

31 B. ANTECEDENTES DIRECTOS 1. CATEGORÍAS DE E. COLI. a. E. coli enterotoxigénica (ETEC) ETEC coloniza la mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas CFA (colonization factor antigens),siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de alguna o ambas enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) la cual es codificada por el gen eltb y toxina termoestable (ST) la cual es codificada por el gen esta. Sus genes están en un plásmido que también puede tener información genética para los CFA s, aunque algunos genes de ST se han encontrado en transposones (Nataro y Karper 1998, Fasano et al., 2000). Las toxinas LT y ST aumentan el nivel intracelular de camp y cgmp respectivamente, que se encuentran en la membrana de las células intestinales, provocando la salida de iones y agua (Sears, 1996). ETEC es importante en lactantes, principalmente en niños menores de dos años, y en particular durante los primeros seis meses de vida. La frecuencia de aislamiento de este grupo patógeno de E. coli en niños con diarrea es de 10 a 30%. En los niños en edad escolar y en adultos puede ser asintomática y poco frecuente o producir la diarrea del viajero. La enfermedad tiene un periodo de incubación de 14 a 50 h. El cuadro clínico se caracteriza por diarrea aguda, generalmente sin sangre, sin moco, sin pus y en pocos casos se presentan fiebre y vómito. La diarrea producida por ETEC puede ser leve, breve y autolimitada pero también puede ser grave (Nataro and Karper 1998, Fasano et al., 2000). La contaminación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección, siendo la dosis infectiva de 10 8 UFC (unidades formadoras de colonias). La contaminación fecal del agua y de la comida es la principal razón de la alta incidencia de infección por ETEC en países en desarrollo. ETEC coloniza la superficie mucosa del intestino delgado y elabora enterotoxinas, las cuales 14

32 producen la secreción intestinal. La colonización es mediada por una o más factores de colonización fimbriales o fimbrias proteicas, las cuales son designadas como CFA (factor antigénico de colonización) (Wood et al., 1983). b. E. coli enterohemorrágica (EHEC) La E. coli enterohemorrágica (EHEC) aparece en la década de los 80 s en casos esporádicos y en brotes epidémicos fundamentalmente en países desarrollados. El serotipo más observado en EE.UU, Europa y Japón ha sido O157:H7. Riley describió y relacionó a EHEC con brotes caracterizados por dolor abdominal, diarrea acuosa con sangre y poco o nada de fiebre, cuadro al que se le llamó colitis hemorrágica (CH) y que era debido a la ingestión de carne cruda o mal cocida (Riley et al., 1983). La bacteria aislada de todos los casos fue E. coli del serotipo O157:H7. Karmali en 1983 (Karmali et al., 1983), en donde afecto a 47 personas las cuales consumieron hamburguesas poco cocidas en Estados Unidos. La asoció con casos aislados de síndrome urémico hemolítico (SUH) caracterizado por daño renal agudo, trombocitopenia y anemia hemolítica microangiopática, precedida por diarrea con sangre, con la presencia de heces con E. coli productora de una citotoxina con actividad sobre células Vero, por lo que se le llama verotoxina (VT), y a las cepas capaces de producirla se les denominó E. coli verotoxigénicas (VTEC) (Konowalchuk et al., 1977). Además, se observó que la citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella dysenteriae tipo 1, por lo que también se le llamó shiga-like toxin a las E. coli capaces de producirla se les da el nombre de STEC (Nataro and Kaper, 1998). La determinación de la capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina STX es el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su síntesis está relacionada con la presencia de material genético de un bacteriófago STX, que está insertado en el genoma. La STX actúa a nivel de síntesis de proteínas ya que se une a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales del hospedero. En las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes 15

33 STX1 y STX2 que son inmunológicamente diferentes, de tal manera que se pueden aislar bacterias que sinteticen alguna de las toxinas o ambas.(karmali 1998, Nataro y Kaper, 1998). Además de la toxina, las EHEC tienen otros mecanismos de patogenicidad como el fenómeno de adherencia y esfacelación (A/E), y presentan el gene cromosomal eae que codifica para la proteína de membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kda), llamada intimina, cuya expresión es regulada por genes plasmídicos; el gene eae también se encuentra en cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad es el plásmido po157, de 60 megadaltones (MDa), que codifica para la enterohemolisina (Donnenberg et al.,1993). Actualmente, hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una es en función de la presencia de sus factores de patogenicidad: a) cepas típicas cuando tienen el fago, el plásmido de 60 MDa y presentan el fenómeno de A/E, y b) cepas atípicas, cuando no producen lesiones de A/E (adherencia y esfacelamiento) y pueden presentar o no el plásmido de 60 MDa. La otra clasificación es en función del serotipo: a) cepas E. coli O157:H7. Este serotipo no fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce B-glocuronidasa; esta bacteria puede producir principalmente SUH y CH. E. coli O157:H7 se puede encontrar en bovinos, cabras, borregos y con menos frecuencia en cerdos y pollos; su principal reservorio es el intestino de ganado bovino (Karmali, 1998). También se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como lechuga, rábanos (Bernard et al., 1996). Además de productos industrializados como mayonesa y jugos de naranja y manzana no pasteurizados, aun cuando estos alimentos tengan ph de 3.4, condición en la que puede sobrevivir varios días. La transmisión de E. coli O157:H7 puede darse por la ingesta de carne cruda o mal cocida, leche bronca, agua contaminada; también puede ser de persona a persona o debida a los manipuladores de alimentos (Rodríguez-Ángeles, 2002). Hay estudios que sugieren la importancia de la mosca doméstica como vector en la transmisión de E. coli O157:H7 (Rodríguez-Ángeles, 2002). Y b) cepas no-o157:h7 cuya 16

34 frecuencia de aislamientos es cuatro veces mayor que las O157:H7. Estas cepas pueden ser sorbitol positivo y sus serotipos son diferentes del O157:H7. Actualmente hay más de 200 serotipos. El cuadro clínico causado por las cepas que son no-o157 se caracteriza por diarrea acuosa con dolor abdominal y colitis hemorrágica. Las cepas no-o157 son capaces de causar brotes o casos aislados de diarrea y en ocasiones no se logra establecer la fuente de contaminación, aunque se sabe que se pueden aislar de los mismos alimentos que las cepas de serotipo O157:H7 y también de carne de guajolote, ternera, pescado y mariscos (Rodríguez-Ángeles, 2002). El principal mecanismo de patogenicidad de las cepas EHEC no-o157:h7 es la toxina STX; también produce el fenómeno de A/E y la presencia de po157. El periodo de incubación de EHEC es de 1 a 8 días; inicialmente produce diarrea sin sangre, con o sin vómito, dolor abdominal, fiebre y después de 1 a 2 días la diarrea se torna sanguinolenta y se intensifica el dolor abdominal, de una duración de 4 a 10 días, con heces abundantemente sanguinolentas. Se cura o bien llega hasta SUH (Fasano et al., 2000). En 1996, hubo un brote de E. coli O157:H7 en Japón, que afecto a más de 6,300 niños y produjo 2 muertes. Éste es el brote más grande registrado para este patógeno (WHO, 1996). Los casos más resientes son uno reportado el 12 de octubre del 2006 por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) y el Estado de California reportaron un brote de E. coli O157:H7 el cual se detectó en una finca de espinacas, dicho brote era proveniente de la materia fecal de ganado de dicha finca. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), la espinaca contaminada por esta cepa ocasionó que 204 personas enfermaran, entre los cuales se incluyen 31 casos de un tipo de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS), 104 hospitalizaciones y 3 defunciones (FDA, 2006). Las cepas de EHEC del serotipo O157:H7, es el más importante patógeno de EHEC en Estados Unidos, el Reino Unido y Japón. En Estado Unidos se presentan al año, 73,000 casos diarreicos y 17

35 40 muertes causados por EHEC O157:H7. Uno de los brotes más recientes causado por E. coli O157:H7 fue reportado el 4 de enero del 2010 en 16 estados de los Estados Unidos. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), la carne de vacunos y aves contaminadas por esta cepa ocasionó que 21 personas enfermaran, entre los cuales incluyen 1 caso de un tipo de insuficiencia renal denominado Síndrome Urémico Hemolítico (HUS) y 9 hospitalizaciones (CDC, 2010). Y el brote más reciente reportado en el presente año 2011 en el mes de mayo en Alemania y Suecia. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), el posible origen del contagio ha sido atribuido al germinado de soya, donde los últimos datos sobre la epidemia revelan que 3235 personas han contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres. Más de 700 alemanes siguen internados en hospitales al haber desarrollado el síndrome urémico hemolítico y hasta el momento se han reportado 37 muertes, debido a un nuevo serotipo de EHEC O104:H4 (CDC, 2011). En la identificación de EHEC es importante el trabajo en conjunto del laboratorio y los epidemiólogos para la vigilancia y detección oportuna de E. coli O157:H7 para prevenir posibles brotes en México, principalmente en zonas turísticas y fronterizas (Rodríguez-Ángeles 2002, Fasano et al., 2000). Aunado a esto hay otros serotipos, particularmente los serogrupos O26 y O111, pueden además causar enfermedad y son más preponderantes que la O157:H7 en varios países. Por otro lado, la infección por EHEC es facilitada por la dosis de infección, que es extremadamente baja para producir la enfermedad (se estima que son menos de 100 células de EHEC) (Karmali and Beutin, 1998). c. E. coli enteroinvasiva (EIEC) El grupo EIEC y Shigella spp están relacionados genética y bioquímicamente, son descarboxilasa negativas, no móviles y lactosa negativas. El mecanismo de patogenicidad de ETEC es la invasión del epitelio del colon; para ello el primer paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo 18

36 de mucinasa y adhesinas, para después entrar por endocitosis a la célula, y posterior multiplicación de la EIEC dentro de la célula y diseminación a células sanas adyacentes (Nataro and Kaper 1998, Rodríguez-Ángeles, 2002). La información genética para este mecanismo está en el loci del cromosoma y del plásmido, además de tener la capacidad de elaborar una o más enterotoxinas que pudieran ser importantes en la producción de diarrea. Los genes necesarios para la invasión se encuentran en el plásmido de invasividad de 140 MDa llamado pinv, que codifica para las proteínas, como por ejemplo las Ipah y Vir-F. Entre otras que están involucradas en el proceso de patogénesis (Eslava et al., 1994). Los síntomas característicos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa, con sangre y moco, pero algunos casos sólo presentan diarrea. Las cepas EIEC se asocian más con brotes que con casos aislados, en los cuales la transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de alimentos y agua contaminada, convirtiéndose en un patógeno importante principalmente en niños mayores de seis meses (Eslava et al., 1994). El diagnóstico de EIEC se hace por prueba in vivo como la de Sereny, que es la inoculación de un cultivo puro de la bacteria en un ojo de un cobayo en el cual después de 24 a 96 h se produce una ulceración en el ojo, pero también hay métodos inmunológicos y moleculares como se indica en el diagnóstico (Rodríguez-Ángeles, 2002). En dos brotes producidos por EIEC, se observó que del 0 al 7% de las personas infectadas presentaban sangrado (Snyder et al., 1984). En estudios epidemiológicos se identificó a EIEC como uno de los agentes etiológicos productores de diarrea en niños en países en vías de desarrollo como en Brasil (Regua-Mangia et al., 2004), Tailandia (Ratchtrachenchai et al., 2004), Jordania (Youssef et al., 2000), Nigeria (Agbonlahor et al., 1982) y en México (Larrosa-Haro et al., 2002). En diversos casos esporádicos, gran parte de las infecciones debido a cepas de EIEC son probablemente mal identificadas como Shigella spp. o E. coli no patogénicas. 19

37 d. E. coli enteropatógena (EPEC) EPEC fue la primera categoría que se identificó serológicamente y se asoció con casos de diarrea en infantes, siendo la adherencia su principal factor de patogenecidad. El proceso de adherencia íntima entre la bacteria y la membrana de las células del epitelio intestinal, seguida de la destrucción de la microvellosidad, con polimerización de actina, que lleva a la alteración del citoesqueleto en el sitio de la unión de la bacteria, debido al aumento de los niveles de calcio intracelular y de proteína cinasa C, lo cual ha sido denominado adherencia y esfacelamiento (A/E) (Eslava et al., 1994). La adherencia está medida por pilis o fimbrias rizadas que se llaman Bfp (bundle-forming pilus), cuya información genética está codificada en un plásmido de MDa denominado EAF (EPEC adherence factor) y de algunos genes cromosomales (Rodríguez- Ángeles, 2002). En ensayos in vitro las cepas EPEC se caracterizan por formar microcolonias en el citoplasma de las células HEp-2 y su estudio incluye factores de patogenecidad como el efecto A/E, presencia de plásmidos y fimbrias. Las cepas EPEC se consideran típicas cuando tienen los genes eae para la intimina, que participa en A/E, y el plásmido EAF que codifica para el Bfp; se dice que son atípicas cuando sólo presentan los genes eae pero no el plásmido EAF (Nataro and Kaper, 1998, Rodríguez-Ángeles, 2002). EPEC puede ocasionar brotes o casos aislados de diarrea. Este grupo afecta principalmente a niños menores de seis meses y a los de dos años. También puede aislarse en adultos enfermos y sanos, principalmente cuando hay un factor predisponente como diabetes. La forma de transmisión de la enfermedad es fecaloral por manos contaminadas de manipuladores de alimentos. Los reservorios de EPEC pueden ser niños y adultos con o sin síntomas (Rodríguez-Ángeles, 2002). El cuadro clínico que produce EPEC se manifiesta con diarrea aguda, la cual puede ser leve o grave, con vómito, fiebre baja y mala absorción. El diagnóstico de 20

38 EPEC incluye ensayos in Vitro en cultivos celulares y métodos moleculares como se observa en el cuadro1, de diagnóstico (Rodríguez-Ángeles, 2002). En un estudio realizado en Bangladesh, de 814 pacientes (menores de 5 años) que presentaron enfermedad gastrointestinal, se encontró a EPEC como uno de los agentes etiológicos más importantes, aún por encima de patógenos clásicos como Shigella spp. Aeromonas spp. y Vibrio cholerae (Albert et al., 1999). También, se ha determinado que EPEC es el patógeno más frecuente identificado en casos de pacientes con gastroenteritis en Australia (Robins-Browne et al., 2004) y en Japón (Nishikawa et al., 2002). En Latinoamérica (incluyendo a México) (Vidal et al., 2007), se logró reconocer a EPEC como el principal patógeno involucrado con diarrea infantil, los resultados además revelaron que la bacteria tiene mayor prevalencia que Campylobacter spp y Rotavirus (Vidal et al., 2007), por lo que EPEC permanece como una causa importante de diarrea infantil potencialmente fatal en países en desarrollo (Rodríguez-Ángeles, 2002). Puesto que los rangos de mortalidad van desde el 20 al 50%, hace a la infección por EPEC una entidad clínica de inmediata respuesta (Kuhnert et al., 2000). e. E. coli enteroagregativa (EAEC) Scaletsky y Nataro encontraron cepas aisladas de pacientes con diarrea, las cuales por serología no correspondían el grupo EPEC pero si presentaban un patrón característico de adherencia diferente a EPEC y que además eran negativas a la prueba de EAF. En estudios posteriores se encontró el fenotipo de adherencia agregativa, caracterizada por autoaglutinación de las bacterias entre sí y por ser inespecífica, porque las bacterias se adhieren a la superficie de las células HEp-2 y a la superficie del cubreobjetos libre de células HEp-2 (Eslava et al., 1994, Rodríguez-Ángeles, 2002). La adherencia a células HEp-2 y la hemaglutinación de eritrocitos humanos se debe a la presencia de la fimbria de adherencia agregativa (AAF/I), codificada por el gene agga que se encuentra en un plásmido de 60 MDa. También se ha 21

39 descrito la fimbria AAF/II inmunológicamente diferente a AAF/I y que está codificada por el gene aafa; sin embargo, no todas las EAEC presentan estas fimbrias (Rodríguez-Ángeles, 2002). En el mecanismo de patogenicidad de EAEC están implicados la bacteria y los productos que ella produce; también se sabe que las cepas EAEC tienen la capacidad de incrementar en la mucosa la producción y secreción de moco que atrapa a las bacterias que se autoaglutinan en una fina película en el epitelio intestinal. La producción de moco puede estar relacionada con la capacidad de EAEC para colonizar persistentemente el intestino y causar diarrea. En el plásmido de 60 MDa de EAEC también se encuentran los genes que codifican para la toxina EAST1 (Rodríguez-Ángeles, 2002). Eslava y colaboradores identificaron dos proteínas de alto peso molecular de cepas EAEC, aisladas de niños que murieron de diarrea persistente. Estas proteínas fueron probadas en ratas observándose en ellas vellosidades cortas, hemorragia y necrosis. El gene para una de estas proteínas se encontró en un plásmido de 65 MDa y a la proteína se le dio el nombre de Pet (plasmid-encoged toxin) la cual tiene la capacidad de producir efecto citopático en células HEp-2, caracterizado por arredondamiento y desprendimiento de las células así como contracción del citoesqueleto y pérdida de fibras de actina. En EAEC se ha descrito también la proteína Pic que está codificada en el genoma y que tiene actividad de proteasa (Rodríguez-Ángeles, 2002). El sitio blanco de daño de EAEC puede ser la mucosa del intestino grueso y delgado, con un periodo de incubación de menos de ocho horas y puede durar hasta 18 a 20 días. Esta bacteria puede causar brotes o casos aislados de diarrea persistente. En niños puede manifestarse con diarrea líquida, de color verde, con moco, sin sangre, y que en ocasiones puede llegar a ser severa y requerir rehidratación intravenosa. Algunas veces, el cuadro clínico se presenta como diarrea con moco, con o sin sangre, vómito y sin o con poca fiebre (Sainz et al., 22

40 2001, Itoh et al., 1998). La prueba de referencia para el diagnóstico de EAEC es la observación de la adherencia agregativa en células HEp-2 de cultivos bacterianos, previamente inoculados en medio Luria e incubados en condiciones estacionarias y a 37 C. EAEC Produce diarrea principalmente en niños de países en vías de desarrollo como México (Cravioto., 1988), Brasil, India, Mongolia, Gabón y en países desarrollados como Japón, Inglaterra y Alemania (Nishikawa et al., 2002). El brote más grande registrado se presentó en Japón en donde implicó a 16 diferentes escuelas, con un total de 2,697 niños que se enfermaron con diarrea después de consumir en la escuela alimentos contaminados con EAEC (Eslava et al., 1994). En particular en México, estas bacterias han causado dos brotes infecciosos, que incluyeron la muerte de niños en el Hospital Infantil de México (Eslava et al., 1994). Posiblemente aquí en México esta bacteria infecta y produce diarrea en niños. Por lo que esta categoría en particular es de gran importancia en nuestro proyecto, ya que se ha determinado que se presenta con una alta incidencia en varios países. Pero sin pruebas firmes de esta hipótesis no podemos asegurarnos de esta prevalencia. f. E. coli de adherencia difusa (DAEC) Las cepas de E. coli de adherencia difusa, no forman microcolonias cuando se adhieren a células HEp-2. Se sabe poco de su mecanismo de patogenicidad pero se ha caracterizado una fimbria de superficie, conocida como FI845, involucrada en el fenómeno de adherencia difusa (Rodríguez-Ángeles 2002, Itoh et al., 1998). Los genes que codifican para esta fimbria se pueden encontrar en el cromosoma o en un plásmido. El fenómeno de adherencia difusa también se ha asociado con una proteína de membrana externa de 100 kda, en una cepa del serotipo 0126:H27, cuyos genes se han secuenciado pero sólo se han encontrado en una minoría de las cepas aisladas (Rodríguez-Ángeles 2002, Itoh et al., 1998). Al realizar ensayos in vitro en células CaCo y HEp-2, las cepas DAEC tienen la capacidad de inducir la formación de estructuras protuberantes, semejantes a 23

41 dedos, las cuales confieren protección a las bacterias, pero la presencia de dichas estructuras no se ha demostrado in vivo. El grupo DAEC se puede aislar tanto de personas sanas como en personas con diarrea, siendo más importante en niños de 4 a 5 años. Los principales síntomas que se presentan son diarrea acuosa sin sangre y sin leucocitos. En el cuadro de E. coli se indican los métodos de diagnóstico. La hibridación con sondas derivadas de un fragmento del gen daac, que codifica para la fimbria F-1845, también se ha empleado para el diagnóstico pero puede presentar falsos positivos, y el diagnóstico empleado PCR aún se ha desarrollado para la identificación de la fimbria F-1845 (Rodríguez-Ángeles 2002, Itoh et al., 1998). Existen muy pocos estudios clínicos que permitan adecuar una descripción del síndrome clínico asociado con la infección por DAEC. En un estudio en Francia, observaron que la mayoría de los pacientes infectados con DAEC tuvieron diarrea acuosa sin sangre o leucocitos fecales (Poitrineau et al., 1995). En diversos estudios se ha implicado a cepas de DAEC como agentes causantes de diarrea, Esto sugiere que E. coli adherente difusa, quizás sea un patógeno importante causante de diarrea en niños, sin embargo, la prevalencia de DAEC no se conoce. Como resumen el (Cuadro1), muestra las características más comunes de las categorías de E. coli como síntomas, epidemiología y factores de virulencia participantes de cada categoría. Mientras que en la (Figura 1) se muestra un esquema de patogenicidad de las seis categorías de E. coli causantes de diarrea (Rodríguez-Ángeles, 2002). 24

42 Cuadro 1. Características de las categorías de E. coli causantes de diarrea. Categorías Síntomas Clínicos Edad de Incidencia Factores de Virulencia ETEC Diarrea aguda acuosa Niños menores de 2 años y diarrea del viajero adultos ST y LT (Toxina Termoestable y Termolábil). EHEC SUH, CH, diarrea con sangre ó sin sangre Niños y Adultos Citotoxina stx1y stx2 (Toxina semejante a shiga), gen cromosomal eae (intimina), Enterohemolisina Hlya, serotipo O157:H7. EIEC Diarrea con moco o Diarrea acuosa Niños mayores de 1 año Enterotoxina ipah y VirF (Necesarias para el fenotipo de invasividad y movimiento a través del citoplasma). EPEC Diarrea aguda Niños menores de 6 meses hasta 2 años Gen cromosomal eae y bfp (Fimbrias formadoras de penachos). EAEC Diarrea líquida, diarrea persistente hasta 20 días Recién nacidos y niños menores de 2 años aafii (Adherencia agregativa fimbria), Gen regulador AggR. DAEC Diarrea acuosa sin sangre Niños de 5 años, preescolares Gen cromosomal daae (fimbria de F-1845). 25

43 Figura 1. Esquema de patogenicidad de E. coli causantes de diarrea (Rodríguez- Ángeles, 2002). 26

44 2. Tratamiento El uso de diferentes métodos diagnósticos para una identificación precisa nos permitirá establecer un determinado tratamiento, en el caso de E. coli. Se recomienda rehidratación, reposo, lavarse las manos, ya como medida preventiva. Así mismo, el uso de antimicrobianos puede resultar contraindicativo, aunque el tratamiento profiláctico para la diarrea del viajero es trimetropinsulfametoxasol, en caso de infección extraintestinal se recomienda el uso de aminoglucósidos, cloranfenicol, cefalosporina de tercera generación y tetraciclina (Stuart, 2000). No se recomienda el uso de los agentes contra la motilidad intestinal por que incrementan la duración y la gravedad de la diarrea por E. coli (Stuart, 2000). Ciertas cepas han desarrollado resistencia a múltiples fármacos y se encuentran bajo el control de plásmidos transmisibles; por lo que en situaciones que predisponen la infección por estos microorganismos se recomienda la corrección quirúrgica, como por ejemplo la obstrucción de vías urinarias (Sánchez et al., 1998, Stuart, 2000). 27

45 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Escherichia coli (E. coli) es una de las especies predominantes en el intestino humano y usualmente coexiste sin causar daño al hospedero; sin embargo han emergido categorías de E. coli patogénicas que producen diarrea en humanos. Referidas como E. coli diarreogénicas o comúnmente como E. coli patogénicas, estas categorías son clasificados en base a sus factores de virulencia (toxinas, plásmidos, fimbrias y factores de señalización) y pueden ser únicamente identificados por estas características. Hoy en día existe un considerable incremento de brotes ocasionados por E. coli diarreogénicas, afectando a miles de personas (morbilidad y mortalidad) en diferentes países (Vugia et al., 2006, Jonathan et al., 2006), así como también en México (Cortes-Ortiz et al., 2002). El origen principal de este incremento de brotes es la contaminación de los alimentos por estos patógenos, convirtiéndolos en los vehículos ideales de transmisión de infecciones a los humanos (Vugia et al., 2006, Sainz et al., 2001). El mundo comienza a familiarizarse con los microorganismos y con las enfermedades transportadas por alimentos (Koneman et al.,1999, Prescott et al., 1999). Particularmente en la última década, y especialmente desde el ya desgraciadamente famoso brote epidémico de 1993, en Estados Unidos, en los estados de Washington, Idaho, California y Nevada, la mayor de las epidemias por envenenamiento alimentario causada por E. coli O157:H7. En este brote se comunicaron en total 582 casos confirmados por cultivo que causaron 171 hospitalizaciones, 41 casos de HUS y 4 muertes. Las hamburguesas de una única cadena de restaurantes de comida rápida estuvieron involucradas (Koneman et al.,1999, Prescott et al., 1999). Uno de los brotes más reciente causado por una de las seis categorías de E. coli (EHEC O157:H7) se presentó en Septiembre de 2006 en Estados Unidos afectando a 199 personas y causando la muerte de 3 personas, por el consumo de espinacas contaminadas por este patógeno (Shannon et al. 2006). Unos de los brote más recientes en el 2010 en Estados Unidos afectando a 21 personas enfermaron, 9 hospitalizados, 1 caso de SUH, y 28

46 ninguna muerte, por el consumo de espinacas, carne de vacuno y aves. Y el brote más reciente reportado en el presente año 2011 en el mes de mayo en Alemania y Suecia. Según los casos reportados por el Centro de Control de Enfermedades (CDC), el posible origen del contagio ha sido atribuido al germinado de soya, donde los últimos datos sobre la epidemia revelan que 3235 personas han contraído la enfermedad, el 69% de ellas mujeres. Más de 700 alemanes siguen internados en hospitales al haber desarrollado el síndrome urémico hemolítico y hasta el momento se han reportado 37 muertes, debido a un nuevo serotipo de EHEC O104:H4 (CDC, 2011). Además EPEC se ha determinado en agua (Curret opinión in microbiology 1998), EAEC en agua y otros alimentos (Harada et al., 2007, Pai et al. 1997, Nakajima et al., 2005). ETEC en agua y comida contaminada (Black 1990, Wood et al., 1983). EIEC en alimentos o agua contaminada (Lanyi et al., 1959, Tulloch et al., 1996) y en DAEC las fuentes de infección no se conocen. 29

47 IV. JUSTIFICACIÓN En el Estado de Sinaloa, las enfermedades diarreicas son responsables de más del 40% de la morbilidad por causas infecciosas. En el 2006 se presentaron 280,204 de enfermedades infecciosas intestinales (SSA), de las cuales un alto porcentaje (58% infecciones intestinales) aunado a que se desconoce el agente causal (posiblemente un gran numero son E. coli diarreogénicas). Debido a la escasa disponibilidad de pruebas diagnósticas implementadas en el sector de salud (SSA.SIN, 2008) y puesto que en Sinaloa se presentan diversos brotes diarreicos, en los cuales (la mayoría) se desconoce el agente causal, aunado a que las E. coli diarreogénicas son agentes emergentes que no son identificadas por técnicas comunes en los laboratorios clínicos, ni de referencia en Sinaloa y en gran parte de México, nos proponemos a valorar la presencia, así como sus factores de virulencia de las seis categorías de las E. coli diarreogénicas en alimentos, con lo cual, generaremos información de la problemática actual de E. coli diarreogénicas, que permita desarrollar estrategias para evitar la diseminación y contagio por estos patógenos, al identificar la fuente de contaminación y establecer las acciones de control. La información aportada en esta tesis es de suma importancia, ya que a pesar de tener información sobre las enfermedades causadas por alimentos contaminados, en Sinaloa se conoce muy poco acerca de E. coli, esto debido a la faltan de estudios sobre el tema que nos permita saber la problemática actual de E. coli diarreogénicas (Presencia de estas cepas patógenas, que grupo de alimentos y alimento están siendo utilizados como vehículos de transporte por las diferentes categorías de E. coli diarreogénicas). Actualmente La Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que la vigilancia de enfermedades transmitidas por alimentos se está volviendo, cada vez más, una alta prioridad en la agenda de salud pública en muchos países. 30

48 Por esta razón surgió la necesidad de realizar este estudio, ya que el conocimiento de estos dos aspectos presencia y frecuencia de los factores de virulencia de las E. coli diarreogénicas, permitirán avanzar en el mejor entendimiento de la importancia de estos organismos como agentes etiológicos de diarreas en infantes y adultos, particularmente en Sinaloa y esto repercutirá positivamente en el monitoreo, vigilancia, y detección oportuna de estas categorías para prevenir posibles brotes. 31

49 V. HIPOTESIS Las categorías de E. coli y los genes relacionados con su patogenicidad están presentes en los diferentes alimentos que se consumen en el Estado de Sinaloa y en personas con un cuadro diarreico. Por lo tanto, los alimentos son vehículos ideales de transmisión de infecciones a los humanos. 32

50 VI. OBJETIVOS A. OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia y distribución de las categorías de E. coli causantes de diarrea en muestras clínicas (heces) y de alimentos en el Estado de Sinaloa. B. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Analizar la distribución de los puntos donde se obtuvieron muestras de alimentos y muestras clínicas (heces) en el Estado de Sinaloa. Y organizar las muestras por grupos de alimentos y grupos de edad. 2. Aislar las posibles cepas de E. coli de las muestras de alimentos y muestras clínicas (heces) provenientes de Sinaloa a través de medios selectivos (Agar MacConkey), e Identificar las cepas de E. coli con la ayuda de PCR individual. 3. Identificar las diferentes categorías de E. coli causantes de diarrea EHEC, EPEC, ETEC, ADEC, EIEC, EAEC y el serotipo de EHEC O157:H7, con la ayuda de PCR múltiple e individual. En aislados de personas con un cuadro diarreico y en diversos alimentos. 4. Determinar la Frecuencia de las E. coli diarreogénicas en aislados de personas con un cuadro diarreico y en los diversos alimentos. Y correlacionar las categorías de E. coli encontradas en personas con un cuadro diarreico y en alimentos. 5. Analizar la distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupo de alimentos, por alimento, por grupos de edad, por meses y por municipios del Estado de Sinaloa. 33

51 VII. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Figura 2. Esquema de identificación de E. coli por PCR. Utilizando los primers (16E1, 16E2, 16E3) y PCR múltiple utilizada para la identificación de las categorías de E. coli diarreogénicas. 34

52 VIII. MATERIALES Y MÉTODOS A. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS Y CLÍNICAS (HECES) 1. Población de Estudio: El estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación de la Facultad de Medicina en colaboración con el Sector Salud, por lo que se analizaron muestras clínicas y de Alimentos. Se contaron con 117 muestras clínicas durante los años 2008 al 2009 de 8 municipios (Culiacán, Elota, El Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato). En donde la población de los 8 municipios involucrados en el análisis de muestras clínicas representan el 70% (1, 940,476/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI, 2010). Las muestras clínicas correspondieron a heces recolectadas de personas con un cuadro diarreico, las cuales tienen las características de ser mayores de 5 años con 5 evacuaciones en menos de 5 días. Las muestras se analizaron por grupos de edad (0-2 años, 3-5 años, 6-10 años, años, años, años y años). Con respecto al estudio en alimentos, se obtuvieron 5162 muestras de alimentos (todo tipo de alimentos) recolectadas durante los años 2007 y 2008 en 10 Municipios (Culiacán, Elota, El Rosario, Guasave, El Fuerte, Ahome, Navolato, Mazatlán, Salvador Alvarado. En donde la población de los 10 municipios involucrados en el análisis de alimentos representan el 87.8% (2, 431,453/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI, 2010). A todas las muestras de alimentos, provenientes de los diferentes municipios del estado de Sinaloa, se les realizaron determinaciones tales como: coliformes fecales y coliformes totales, que son pruebas de indicadores de contaminación fecal. Estas determinaciones se realizaron con el objetivo de buscar E. coli. Los alimentos se clasificaron en grupos como: alimentos preparados (PRE), aguas y hielo (AH), lácteos y derivados (LD), pescados y mariscos (PM) y cárnicos (CAR) (Cuadro 2). 35

53 Cuadro 2. Clasificación por grupo de alimentos analizados en este estudio. 36

54 2. Aislamiento de E. coli: Para el aislamiento de las posibles cepas de E. coli tanto en muestras clínicas (heces) como en alimentos, se utilizó el medio selectivo de Agar MacConkey, en donde se estriaron directamente las muestras clínicas (heces) y las muestras de alimentos positivas a coliformes Fecales o totales en tubos de lauryl sulfato o EC-MUC se estriaron en este medio, con un periodo de incubación de horas a 35-37C (Figura 3). Para identificar a E. coli, del medio MacConkey, se recolectaron cepas color rosa o incoloras, se extrajo el DNA bacteriano y se utilizó la metodología de PCR (Reacción En cadena de la Polimerasa) identificando la región del gen 16s RNAr con los primers u oligonucleotidos (16E1, 16E2, 16E3) de acuerdo a H.Y. Tsen,

55 Escherichia coli Agar MacConkey E.coli 1-EAEC 2-ETEC 3-EHEC Figura 3. Crecimiento de cepas control de bacterias de E. coli sobre Agar MacConkey. En placa con agar MacConkey las colonias de las categorías de E. coli diarreogénicas muestran una morfología similar EAEC (1), ETEC (2), EHEC (3), DAEC (4) Y EPEC (5), y poseen diferentes tonos de rojos debido al proceso de fermentación. Con excepción de la categoría de EIEC (6) que es lactosa negativa. 38

56 3. Identificación de las E. coli diarreogénicas: Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virf), ADEC (daae), EAEC (aggr, aafii), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbe O157, flic H7) y la enterohemolisina ( hlya) (Maricel Vidal, 2005, Gehua Wang, 2002, Claudia Toma, 2003). 4. Extracción de DNA Previamente a la extracción de DNA las cepas se sembraron en agar MAcConkey y se incubaron de horas a 35-37C. Posteriormente se resuspendieron 5 colonias en 150 µl de buffer para lisis (KCl 50mM, Tris-HCl 10mM ph 8.5, MgCl2 1.5mM, Tween %). La lisis del DNA para PCR se llevó a cabo hirviendo la suspensión durante 5 min a 95 C. El DNA extraído se tomó directamente de la parte del sobrenadante y se empleó como templado en la reacción de PCR. 5. Amplificación por PCR Una vez obtenido el DNA de las cepas bacterianas se procedió a realizar la amplificación del gen 16s RNAr para la identificación de E. coli y para ello se utilizó la PCR individual empleando los oligonucleotidos (iniciadores) descritos en el cuadro 3. Se realizó la PCR para la amplificación DNA de la región del gen 16s RNAr, para identificar E. coli. Se utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA con las condiciones: desnaturalización inicial de 94C por 20 seg, 35 ciclos de 94 C por 20 seg, 60 C por 20 seg, 72 C por 30 seg, extensión final a 72 C por 2 min, y se mantuvo a 4 C, de acuerdo a H.Y. Tsen, (1998). La reacción de PCR consistió en 12.5 µl del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1 µl de cada iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µm (invitrogen) 39

57 y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado biología molecular) para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1 muestra) figura 4. Cuadro 3. Primers utilizados en la PCR para la amplificación del gen 16s RNAr para la identificación de E. coli. 40

58 Figura 4. Amplificación DNA de la región del gen 16s RNAr (16E1, 16E2, 16E3) por PCR. Productos de amplificación con los primers 16E1/16E2/ 16E3. La línea 1 representa un marcador de 50 pb, la línea 2 al 7 muestra los productos de amplificación de DNA de las categorías de Escherichia coli como controles positivos (ETEC, EIEC, EPEC, EHEC, EAEC, DAEC). La línea 8 el producto de amplificación corresponde a una muestra problema de alimentos cárnicos, la línea 9 y 10 son controles negativos. La línea 9 klebsiella pneumoniae, la línea 10 Vibrio parahaemolyticus. La línea 11 muestra un producto de amplificación de una muestra problema de clínicos (heces) y la línea 12 representa un marcador de 1kbp en escalera de DNA. 41

59 6. Amplificación por PCR múltiple Se realizó PCR múltiple para amplificar los genes de las categorías de E. coli diarreogénicas; las cuales fueron para EHEC (stx1, stx2, eae), EPEC (eae, bfp), ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, vir), ADEC (daae), EAEC (aggr, aafii) (Cuadro 4). Se utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA y 1kbp en escalera de DNA con las condiciones: desnaturalización inicial de 94C por 3 min, 35 ciclos de 94 C por 1.5 min, 55 C por 1.5 min, 72 C por 1.5 min, extensión final a 72 C por 5 min, y se mantuvo a 4 C. De acuerdo a Maricel Vidal, (2005) (Figura 5). La reacción de PCR consistió en 12.5 µl del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1 µl de cada iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µm (invitrogen) y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado biología molecular) para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1 muestra). 7. Amplificación con PCR múltiple e individual Se realizó PCR múltiple e individual para el serotipo de EHEC O157:H7 (Cuadro 4). Se utilizó un marcador de 50 pb en escalera DNA y 1kbp en escalera de DNA con las condiciones: desnaturalización inicial de 98 C por 8 min, 35 ciclos de 95 C por 30 seg, 58 C por 30 seg, 72 C por 30 seg, extensión final a 72 C por 7 min, y se mantuvo a 4 C. De acuerdo a Gehua Wang, (2002). La reacción de PCR consistió en 12.5 µl del reactivo Go Taq Green Master Mix 2X (promega), 1 µl de cada iniciador (F-sentido y R-antisentido) con una concentración de 0.5 µm (invitrogen) y 1 µl de DNA templado y se ajustó el volumen de agua (grado biología molecular) para un volumen final de 25 µl, para cada reacción (1 muestra) (Figura 6). Todas las amplificaciones por PCR individual y PCR múltiple se desarrollaron en un Termociclador (Labnet, Modelo multigen Gradiente). 42

60 Cuadro 4. Primers utilizados en la PCR múltiple para la amplificación de los genes de las diferentes categorías de E. coli diarreogénicas. 43

61 Figura 5. Amplificación de DNA por PCR múltiple de los genes de las categorías de E. coli causantes de diarrea. (stx1, stx2, eae, bfp, stii, lt, ipah, vir, daae, aggr, aafii). PCR múltiple. La línea 1 representa 50 pb en escalera de DNA. De la línea 2-7 corresponde a las bandas de los productos de amplificación de DNA de las categorías de E. coli causantes de diarrea (stx1, stx2, eae, bfp, stii, lt, ipah, vir, daae, aggr, aafii). La línea 2, EHEC (stx1, stx2, eae); la línea 3, EPEC (eae, bfp); la línea 4, ETEC (Lt); la línea 5, DAEC (daae); la línea 6, EIEC (ipah); la línea 7, EAEC (aggr, aafii). La línea 8 representa 1kbp en escalera de DNA. 44

62 Figura 6. Amplificación de DNA por PCR de los genes del serotipo STEC O157:H7 (rfbeo157, flich7). PCR individual. La línea 1, 2 y 3 muestra los productos de amplificación de controles positivos de rfbeo157. La línea 4 y 6 son muestras control positivo de flich7. La línea 5 corresponde a una muestra problema de alimento lácteo, y la línea 7 representa un marcador de 1kpb en escalera de DNA. 45

63 8. Detección del DNA amplificado Los productos de amplificación por PCR fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa (promega) al 2% durante 50 min a 90 voltios, las bandas de ADN fueron teñidas con bromuro de etidio y visualizadas a través de un transluminador ultravioleta (Ultra violet products, Modelo UV-Translluminators) y analizado con un sistema de fotodocumentación (Kodak, Modelo Gel Logic 100 imaging system). 9. Purificación DNA Para la extracción y purificación del DNA de las bacterias gram (-) como E. coli diarreogénicas, se utilizó el medio enriquecido de LB al 3 % de NaCl. Después por medio del Kit comercial DNA purification Kit (Wizard Plus SV, promega A1125) se purificó el DNA bacteriano siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. 46

64 IX. RESULTADOS El presente estudio se llevó a cabo en la Unidad de Investigación de la Facultad de Medicina en colaboración con el Sector Salud, por lo que se analizaron muestras de Alimentos y muestras clínicas. Por consiguiente primero se describirán los resultados obtenidos de alimentos y después los resultados obtenidos de clínicos. Este estudio se realizó para determinar la presencia, frecuencia y distribución de E. coli diarreogénicas en alimentos que se consumen en el Estado de Sinaloa. Se recolectaron muestras de alimentos que provenían de los diferentes municipios del Estado de Sinaloa durante los años 2007 al El total de muestras de alimentos recolectadas para ser analizadas fueron de 5162, y provenían de los diferentes municipios del estado de Sinaloa. Los municipios involucrados de norte a sur fueron; Ahome, El Fuerte, Guasave, Salvador Alvarado, Navolato, Culiacán, Cosalá, Mazatlán, El Rosario y Escuinapa (Figura 7), en donde la población de los 10 municipios involucrados en el análisis de alimentos representan el 87.8% (2, 431,453/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI). De 10 municipios involucrados en el envío de muestras de alimentos para su análisis, se encontró que del municipio de Culiacán se obtuvieron el mayor número de muestras con un 27.6% (n=1429/5162), seguido de Ahome con un 24.1% (n=1245/5162), Mazatlán con un 18.5% (n=960/5162), Escuinapa con el 12.1% (627/5162), y Salvador Alvarado con 8.5% (n=439/5162), mientras que de los cinco municipios que menos muestras de alimentos se obtuvieron fueron Guasave con un 7.1% (371/5162), Navolato con el 0.5% (n=26/5162), El Fuerte con el 0.48% (n=25/5162), y por último los municipios de Cosalá con el 0.38% (n=20/5162) y El Rosario con el 0.38% (n=20/5162) respectivamente. 47

65 Figura 7. Distribución geográfica de los puntos donde se realizó el muestreo de Alimentos en el Estado de Sinaloa. Municipios involucrados en el análisis de alimentos, el cual se llevó acabo en los años 2007 al

66 Se analizaron un total de 5162 muestras de alimentos que se separaron por grupo de alimentos de los cuales 1597 (30.9%) fueron de aguas y hielos, 1594 (30.8%) de alimentos preparados, 669 (12.9%) lácteos y derivados, 656 (12.7%) pescados y mariscos, el menor número de muestras recibidas correspondió a productos cárnicos con 646 (12.5%) (Figura 8A). A estas muestras se les realizarón las determinaciones de coliformes fecales (y/o) totales (se analizarón de dos maneras, por el método de placa, y por el método de Número más Probable (NMP), y coliformes totales Número más Probable (NMP). Estas determinaciones se realizarón con el objetivo de buscar E. coli. De las 5162 muestras de alimentos analizadas el 13.4% (692/5162) dieron positivo a las determinaciones de coliformes fecales (y/o) coliformes totales (Figura 8B). De las 692 muestras de alimentos contaminadas por coliformes fecales (y/o) coliformes totales, el 28% (190/669) correspondió a lácteos y derivados, el 24% (156/646) de productos cárnicos, el 17% (117/656) de pescados y mariscos, el 10% (175/1594) de alimentos preparados y el menor número de muestras correspondió al grupo de aguas y hielos con el 3.3% (54/1597) (Figura 8B). De las muestras de alimentos positivas a coliformes fecales o totales, se aislaron las probables bacterias de E. coli, utilizando el medio selectivo de Agar MacConkey. La identificación de las cepas de E. coli aisladas del medio de Agar MacConkey se realizó mediante PCR utilizando primers descritos por H.Y. Tsen, 1998 (Figura 4). De 692 muestras, el 59.53% (412/692) de alimentos que habían dado positivas a coliformes fecales (y/o) coliformes totales, presentaron E. coli. Los grupos de alimentos más contaminados fueron los lácteos y derivados (LD) con un 21.3% (143/669), el grupo de productos cárnicos (CAR) con un 17% (110/646), y el grupo de alimentos de pescados y mariscos (PM) con un 10.8 % (71/656) (Cuadro 5). 49

67 Figura 8. Grupos de Alimentos analizados en este estudio. (A) Proporción por grupos de alimentos analizados n=5162, (B) Proporción durante el año 2007 al 2008 de muestras de alimentos que dieron positivo al análisis de coliformes fecales (y/ó) coliformes totales n=

68 Cuadro 5. Detección y Frecuencia de E. coli en los grupos de alimentos analizados. De las n=5162 muestras de alimentos analizadas del Estado de Sinaloa. Se identificó E. coli con una frecuencia del 8.0 % (n=412/5162) por PCR. 51

69 La frecuencia de identificación de E. coli en las muestras de alimentos estudiados en el presente estudio fue del 8.0 % (n=412/5162). De las 412 muestras de alimentos que dieron positivas a E. coli por PCR. Se les realizó la amplificación de los genes relacionados con las categorías de E. coli (Cuadro 4.) Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virf), ADEC (daae), EAEC (aggr, aafii), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbe O157, flic H7) y la enterohemolisina ( hlya) (Figura 5). De los primers diseñados en este estudio para EHEC (stx1, stx2) y para EPEC (eae, bfp). Se observó la amplificación esperada en las cepas control. De estas 412 muestras contaminadas por E. coli, el 13.2% (54/412) correspondieron a E. coli diarreogénicas o potenciales productoras de diarreas y el 87% (358/412) no presentaron genes de las categorías buscadas (Figura 9A). La categoría de E. coli diarreogénicas identificada más frecuentemente fue EPEC en un 83% (45/54; 9 típicas y 36 atípicas) seguida por STEC con un 9% (5/54), ETEC con un 4% (2/54) y EAEC 4% (2/54) como se muestra en la figura 9B. Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los genes de virulencia que corresponden a DAEC o EIEC. El alimento que presento una mayor proporción de E. coli diarreogénicas fueron los productos lácteos, cárnicos y la comida preparada, aunque no se observó una tendencia de alguna categoría por algún grupo de alimento. La categoría EPEC se encontró en todos los grupos de alimentos analizados en este estudio (45/412) siendo solo la excepción el grupo de aguas y hielos, observándose en mayor presencia de esta categoría en el grupo de alimentos de lácteos y derivados (13/143), seguido de productos cárnicos (11/110), pescados y 52

70 mariscos (11/71), y por último en alimentos preparados (10/78). Mientras que la categoría de STEC tuvo presencia en 2 de los 5 grupos de alimentos analizados (5/412) y en menor cantidad que la categoría de EPEC, observándose una mayor presencia en lácteos y derivados (3/143) y alimentos preparados con (2/78). La categoría de ETEC tuvo presencia en 2 de los 5 grupos de alimentos analizados (2/412) observándose una mayor presencia en lácteos y derivados (1/143) y en aguas y hielos (1/10). Finalmente la categoría de EAEC sólo se presentó en 1 de los 5 grupos de alimentos analizados (2/412), teniendo presencia sólo en el grupo de pescados y mariscos (2/71). Observándose que solo el grupo de lácteos y derivados presentó tres (EPEC, STEC, ETEC) de las cuatro categorías de E. coli diarreogénicas que fueron identificadas en este estudio (Cuadro 6). La frecuencia de los patotipos o categorías de E. coli fue del 8.0% (412/5162), encontrándose una frecuencia de identificación del 1.1% (54/5162) de cepas diarreogénicas con relación a la población general de alimentos estudiada durante los años 2007 al 2008; identificándose principalmente la categoría de EPEC con un 0.87% (45/5162) y STEC con un 0.09% (5/5162), mientras que la categoría de ETEC con un 0.03% (2/5162) y EAEC con un 0.03% (2/5162) respectivamente. La frecuencia de EPEC, STEC y ETEC fue mayor en lácteos y derivados con un 2.54% (17/669), seguido de pescados y mariscos con un 1.98% (13/656) con EPEC, EAEC, mientras que el grupo de alimentos cárnicos con un 1.70% (11/646) con las categorías de EPEC, el grupo de alimentos preparados con un 0.75% (n=12/1594) con la categoría de EPEC y STEC, y finalmente el grupo menos contaminado fue el de aguas y hielos con un 0.62% (1/1597) con ETEC (Cuadro 7). 53

71 Figura 9. Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. A) Proporción de las cepas no diarreogénicas y diarreogénicas de E. coli detectadas y aisladas de muestra de Alimentos. B) Proporción por categorías de E. coli diarreogénicas detectadas y aisladas de muestra de Alimentos. Indicando las categorías identificadas, DAEC, EAEC, ETEC y EPEC típicas (gen eae y bfp) y atípicas (gen eae). 54

72 Cuadro 6. Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupo de Alimentos en los años 2007 al Análisis de las 412 muestras de alimentos donde se identificó E. coli por PCR múltiple. Los resultados muestran, la presencia de las categorías de E. coli diarreogénicas (EPEC, EAEC, ETEC y STEC). 55

73 Cuadro 7. Detección y Frecuencia de las categorías E. coli diarreogénicas en los alimentos analizados por PCR múltiple en los años 2007 al

74 Alimentos contaminados con las categorías de E. coli diarreogénicas. Del grupo de lácteos y derivados, el queso fue el alimento más contaminado por las categoría de E. coli diarreogénicas con el 31.48% (17/54), teniendo mayor presencia la categoría de STEC con un 60% (3/5), seguida de ETEC con el 50% (1/2) y por último EPEC con el 28.8% (13/45). En el grupo de cárnicos, la carne de mamífero y aves y chorizo y longaniza ambos fueron los alimentos más contaminados con un 9.25% (5/54), encontrándose a EPEC principalmente con un 11.11% (5/45) en ambos alimentos. En el grupo de Preparados, las ensaladas de verduras fue el alimento más contaminado con un 11.1% (6/54), siendo la categoría de STEC la que más se identificó con un 20% (1/5) seguida de EPEC con un 11.11% (5/45). En el grupo de pescados y mariscos, el pescado fue el alimento más contaminado con un 18.5% (10/54), identificándose a EAEC con un 50% (1/2), seguida de EPEC con un 20% (9/45). En el grupo de aguas y hielos solo hubo presencia de ETEC con un 50% (1/2). Estos datos indican que el alimento más contaminado por estas categorías (EPEC, STEC y ETEC) fue el queso fresco (Cuadro 8). 57

75 Cuadro 8. Distribución de las categorías E. coli diarreogénicas por alimentos. 58

76 Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en los años 2007 al Las muestras de alimentos analizadas en este estudio, provenían de diez de los 18 municipios del estado de Sinaloa. Los municipios involucrados en el análisis de alimentos fueron: Culiacán, Ahome, Mazatlán, Escuinapa, Salvador Alvarado, Guasave, Navolato, El Fuerte, Cósala y El Rosario. En donde la población de los 10 municipios involucrados en el análisis de alimentos representan el 87.8% (2, 431,453/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI). De estos diez municipios de donde se recolectaron muestras de alimentos los municipios de Mazatlán, Escuinapa, Navolato, El Fuerte, Cósala y El Rosario no se detectaron las categorías de E. coli diarreogénicas (Figura 10). Los municipios en donde se aislaron E. coli en una proporción mayor de las 412 muestras de alimentos que dieron positivas a E. coli, los municipios donde se identificó E. coli en mayor proporción fueron Guasave con un 15.3% (57/371), Salvador Alvarado con un 12.7% (56/439), Ahome con un 10% (125/1245) y Culiacán con un 7.7% (111/1429). Se aislaron en una proporción menor en Escuinapa con un 4.7% (30/627) y Mazatlán con un 3.4% (33/960), en estos dos municipios no se identificaron las categorías de E. coli patógenas pero la presencia de esta bacteria nos habla de que hay contaminación fecal en los alimentos que se consumen en estos municipios (Figura 10). Se identificaron 54 E. coli de las categorías diarreogénicas, EPEC, ETEC, EAEC y STEC, las cuales fueron detectadas solamente de la parte centro y norte del Estado de Sinaloa, identificándose en mayor proporción en Guasave con un 2.6% (10/20) siendo la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con un 2.4 % (9/371), seguido del municipio de Salvador Alvarado donde se identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en un 1.82% (8/439) siendo la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con el 1.59% (7/439). En el municipio de Ahome se identificaron con el 1.76% (22/1245) siendo la categorías EPEC la que se identificó en mayor proporción con el 1.44% 59

77 (18/1245). Por último en el municipio de Culiacán se identificaron a las categorías de E. coli diarreogénicas en un 0.97% (14/1429) siendo este el municipio en donde se identificaron las categorías de E. coli en menor proporción, pero que fue el municipio que presento las cuatro categorías de E. coli identificadas en este estudio EPEC, STEC, EAEC y ETEC (Figura 10). 60

78 Figura 10. Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa. En muestras de alimentos durante los años 2007 al 2008 en muestras de alimentos. 61

79 Para conocer la frecuencia de E. coli y de cepas diarreogénicas por meses en el periodo de estudio de los años 2007 al 2008 del presente trabajo, se analizó la distribución de estas cepas. Cabe mencionar que es importante conocer la distribución de estas cepas por meses en el estado de Sinaloa, ya que estudios realizados sugieren que en los meses húmedos y calurosos la presencia de patógenos en alimentos es mayor. Dado que Sinaloa presenta estas dos condiciones óptimas de crecimiento. Al observar la distribución de las cepas E. coli y de cepas diarreogénicas identificadas en este estudio, se encontró que no hubo una tendencia de incremento por cada mes, sino más bien un comportamiento similar en cuanto a la presencia de estas cepas durante los meses del periodo del presente estudio. (Figura 11). 62

80 Figura 11. Distribución por meses de E. coli y cepas diarreogénicas en los años 2007 al

81 Para determinar la presencia, frecuencia y distribución de E. coli diarreogénicas en personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el estado de Sinaloa. Se recolectaron muestras clínicas (heces) de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico de los diferentes municipios del estado de Sinaloa durante los años 2008 al Se recolectaron 117 muestras clínicas de los municipios de Culiacán, Elota, El Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato (Figura 12). Los 8 municipios involucrados en el análisis de muestras clínicas representan el 70% (1, 940,476/2, 767,552) de la población total del Estado de Sinaloa (INEGI). El mayor número de muestras clínicas recolectadas se obtuvo de Culiacán con un 26.4% (31/117), seguido de Elota con un 17.09% (20/117). El Rosario con un 17.09% (20/117), Guasave con un 12.8% (15/117), El fuerte con un 8.5% (10/117), mientras que de los municipios de Escuinapa y Ahome se obtuvieron la misma cantidad de muestras con un 7.6% (9/117) en ambos municipios, siendo el municipio de Navolato donde se obtuvieron el menor número de muestras con un 2.5% (3/117), respectivamente. 64

82 Figura 12. Distribución geográfica de los puntos donde se tomaron muestras de personas que presentaban un cuadro clínico diarreico en el Estado de Sinaloa. 8 municipios involucrados de norte a sur en el análisis de muestras clínicas de heces, el cual se llevó a cabo en el año 2008 al

83 Las categorías de E. coli diarreogénicas son los agentes etiológicos más importante causante de diarrea en los seres humanos, afectan a todas las edades y estrato social. Se obtuvieron 57 muestras de 0-2 años, 18 muestras de 3-5 años, 11 muestras de años, 10 muestras de 6-10 años, 8 muestras de años, 7 muestras de años, el grupo de edad de menor muestras clínicas de heces recibidas correspondió al grupo de años con 6 muestras (Figura 13). Del 100% (117) de las muestras clínicas se aislaron las posibles cepas de E. coli mediante el medio selectivo de Agar MacConkey (Figura 3). Y se identificaron por PCR individual (Figura 4). Una vez identificada E. coli, para determinar que cepas de esta corresponden a las categorías de E. coli diarreogénicas es decir patógenas y que no son solo parte de la flora normal, se les realizó PCR múltiple con primers previamente descritos en el Cuadro 4. Los genes a amplificar de las categorías de E. coli diarreogénicas fueron para EHEC (stx1, stx2, eae, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), EPEC (eae, bfp, primers diseñados con el software oligo versión 7 para el presente estudio), y se usaron primers diseñados por otros investigadores para las categorías de ETEC (STII, Lt), EIEC (ipah, virf), ADEC (daae), EAEC (aggr, aafii), el serotipo de EHEC O157:H7 (rfbe O157, flic H7) y la enterohemolisina ( hlya) (Figura 5). 66

84 n=117 Figura 13. Grupos de edad de las muestras clínicas analizadas en este estudio. Proporción por grupos de edad de muestras clínicas (heces) analizadas, durante los años 2008 al

85 Identificación de las categorías de E. coli diarreogénicas. El 26% (31/117) de las muestras clínicas se les identifico E. coli diarreogénicas en personas que presentaban un cuadro clínico diarreico, encontrándose que el 74% (86/117) correspondieron a cepas de E. coli sin genes de virulencia que caracterizan a las cepas no diarreogénicas es decir no hubo presencia de las categorías de E. coli (Figura 14A). De las 31 cepas patógenas, el patógeno más frecuentemente aislado fue EPEC con un 42% (13/31), de las cuales 8 fueron típicas (con el gen eae y bfp) y 5 atípicas (solo con el gen eae). En menor frecuencia se identificó EAEC en un 29% (9/31), ETEC en un 26% (8/31) y DAEC en un 3% (1/31) como se muestra en la figura 14B. Ninguno de los aislados de E. coli presentaron los genes de virulencia que corresponden a EHEC, STEC ó EIEC. Distribución y prevalencia por grupo de edad de E. coli diarreogénicas. Por grupo de edad, se determinó que EPEC (típica y atípica) (19.2%, 11/57) y EAEC (12%, 7/57) fueron más prevalentes entre los grupos de edad de 0-2 años. ETEC fue más prevalente en el grupo de edad de (33%, 2/6) años, seguido 6-10 (30%, 3/10) y años (18%, 2/11). La categoría de DAEC se identificó únicamente en el grupo de edad de 3-5 años (5%, 1/18). Ninguna de las E. coli diarreogénicas fueron identificadas en los grupos de edad de y años. Los resultados muestran que hay una alta proporción de E. coli productoras de diarrea o diarreogénicas en pacientes con diarrea aguda ó persistente, en donde predomina E. coli enteropatógena EPEC (típica) (Cuadro 9). No hubo presencia de las categorías de EIEC, EHEC ó STEC en las muestras clínicas (heces) que se analizaron para este estudio. 68

86 Figura 14. Proporción de las categorías de E. coli diarreogénicas. A) Proporción de las cepas no diarreogénicas y diarreogénicas de E. coli detectadas y aisladas de muestra Clínicas (heces). B) Proporción por categorías de E. coli diarreogénicas detectadas y aisladas de muestra clínicas, indicando las categorías identificadas, DAEC, EAEC, ETEC y EPEC típicas (gen eae y bfp) y atípicas (gen eae). 69

87 Cuadro 9. Distribución de las categorías de E. coli diarreogénicas por grupos de edad. 70

88 La prevalencia de EPEC, ETEC, EAEC y DAEC fue mayor en el grupo de edad de años con un 50% (3/6), seguido del grupo de edad de 6-10 años con una prevalencia del 40% (4/10) y grupo de edad de 0-2 años con un 33.3% (19/57), siendo estos tres grupos de edad los que presentaron una mayor frecuencia por estos patógenos. El grupo de edad de años presento la menor incidencia de E. coli diarreogénicas con un 27.2% (3/11), siendo este el cuarto grupo de edad, que presento una mayor frecuencia por estos. No se identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en los grupos de edad de años y años (Cuadro 10). 71

89 Cuadro 10. Detección y Frecuencia de las categorías E. coli diarreogénicas en las muestras clínicas (heces) analizadas por grupos de edad. De las 117 muestras de alimentos recibidas se identificaron las categorías de E. coli con una frecuencia del 26.4 % (n=31/117) por PCR. 72

90 Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en el año 2008 al 2009 en personas con un cuadro diarreico. Las muestras clínicas (heces) analizadas en este estudio, provenían de ocho de los 18 municipios del estado de Sinaloa. Los municipios involucrados en el análisis de alimentos fueron: Culiacán, Elota, El Rosario, Guasave, El Fuerte, Escuinapa, Ahome y Navolato. De estos ocho municipios de donde se recolectaron muestras clínicas (heces), solo en el municipio de Navolato no se detectaron las categorías de E. coli diarreogénicas (Figura 15). De las 31 categorías detectadas de E. coli diarreogénicas en este estudio, las categorías de EPEC, ETEC y EAEC fueron detectadas a lo largo del Estado de Sinaloa. Por municipio se identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en mayor proporción en Elota con un 40% (8/20) y Guasave con un 40% (6/15). En el municipio de Elota se identificó en mayor proporción la categorías de EPEC con un 20% (4/20). En Guasave se identificó en mayor proporción la categorías de EAEC con un 26.6% (4/15) y fue en el único municipio donde se identificó la categoría de DAEC. En el municipio de El Fuerte se identificaron las categorías de E. coli diarreogénicas en un 30% (3/10), donde se identificó en mayor proporción la categoría de EPEC con un 20% (2/10). En Culiacán se identificaron con un 22.5%, siendo la categorías de EPEC la que se identificó en mayor proporción con un 12.9% (4/31). En Ahome se identificaron con un 22.2% (2/9) siendo las categorías de EAEC y ETEC las que se identificaron en mayor proporción con un 11.1% (1/9) cada una. En El Rosario se identificaron con un 20% (4/20) siendo las categorías de EPEC Y ETEC las que se identificaron en mayor proporción con un 10% (2/20) cada una. Y por último el municipio de Escuinapa con el 11.1 % (1/9) con la categoría de ETEC (Figura 15). 73

91 Figura 15. Distribución geográfica de las categorías de E. coli diarreogénicas identificadas por Municipio en el Estado de Sinaloa en el año 2008 al 2009 en personas con un cuadro diarreico 74