Procesado de muestras de sangre

Transcripción

1 6 6.Prevención de la salud Procesado de muestras de sangre Los análisis de sangre son una herramienta diagnóstica muy útil en la Clínica Veterinaria. La fiabilidad de un análisis y su interpretación dependen en gran medida de la calidad de la muestra que se analiza o que se envía al laboratorio. El manejo adecuado de las muestras desde que se obtienen hasta que realizan los análisis es fundamental para no obtener resultados erróneos. Repasaremos algunas normas de manejo de muestras que son importantes y que nos pueden servir tanto si los análisis de sangre se hacen en la clínica como si se envían fuera, a laboratorios externos.

2 7 Un análisis de sangre fiable empieza con una toma de muestras correcta. Existen muchos factores en la toma de muestras y en su manejo que hay que cuidar y que pueden afectar los resultados de estas pruebas. Es importante: evitar que el animal esté muy estresado no usar agujas de bajo calibre con jeringas de alto volumen realizar una punción venosa limpia no mantener el torniquete más de un minuto no contaminar la muestra con antiséptico (alcohol). En los animales muy estresados se produce un aumento de la glucosa en sangre que hay que tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados. La aguja y la jeringa que emplearemos dependerán de varios factores. El tamaño de la jeringa que usemos va a depender del volumen de sangre que necesitemos y de la vena que hayamos seleccionado. Los volúmenes grandes de sangre no deben ser extraídos con agujas de calibre pequeño. Al utilizar agujas de bajo calibre acopladas a jeringas de alto volumen se puede producir hemólisis de la muestra. La hemólisis es la ruptura de los glóbulos rojos que libera hemoglobina y otras sustancias en el plasma/ suero que le dan un color entre rosa y rojo. Este color afecta a varias determinaciones por el aumento en el suero de la sustancia a medir o también por interferencia óptica o química durante la fase de análisis. Además de evitar que se produzca la hemólisis seleccionando correctamente la jeringa y la aguja, debemos evitar aplicar un torniquete durante más de un minuto ya que también puede producir alteraciones en los análisis y también debemos evitar la contaminación con alcohol. Una extracción de sangre se realiza usando principalmente la vena yugular, cefálica y safena. Normalmente, a no ser que sea un perro muy pequeño, un cachorro o en muchas ocasiones un gato, realizaremos la extracción en la vena cefálica, la que discurre por encima de la extremidad delantera. La vena yugular se usa frecuentemente en cachorros y gatos pero cualquiera de las opciones es correcta. Hemograma El hemograma nos proporciona el recuento de glóbulos rojos, blancos y plaquetas. Para poder realizarlo la sangre tiene que conservar sus características físicas y químicas, es decir no puede coagularse, debe permanecer líquida. La muestra que necesitamos es sangre entera recogida en tubos con anticoagulante EDTA ya que es el anticoagulante que mejor conserva la morfología de las células sanguíneas. La primera regla para poder realizar correctamente el hemograma es que la sangre que vamos a echar al tubo con anticoagulante EDTA no puede tener ningún coágulo. La segunda regla a tener en cuenta es que es muy importante ajustar la cantidad de sangre que se echa al anticoagulante que hay en el tubo (los tubos vienen ya preparados con el anticoagulante). El EDTA es el anticoagulante de elección para hacer el hemograma y el frotis sanguíneo.

3 8 Además de realizar los recuentos celulares, para completar un análisis hematológico debemos realizar también un frotis sanguíneo. Hay que extender una pequeña gota de sangre sobre una lámina de vidrio (portaobjetos) para formar una película delgada (frotis sanguíneo). sangre esté mucho tiempo en el anticoagulante, como el deterioro de las células. Si el frotis, una vez hecho, no puede teñirse inmediatamente, es importante por lo menos fijarlo, sumergiéndolo en metanol durante dos minutos. Las células fijadas se conservan durante mucho tiempo. Normalmente los tubos vienen con una línea que indica la cantidad de sangre que hay que adicionar. Es fundamental respetar la recomendación ya que un defecto o exceso de sangre según la proporción de anticoagulante del tubo va a producir alteraciones hematológicas. El hemograma se puede realizar en muestras recogidas en tubos con otros anticoagulantes como la heparina, pero este anticoagulante conserva peor la morfología celular y favorece que las plaquetas formen grupos (agregación plaquetaria) lo cual altera su contaje. Si no hacemos el hemograma en dos o tres horas la sangre debe ser refrigerada a 4º C (debe estar en nevera). El recuento de glóbulos rojos, la hemoglobina y el hematocrito no sufren modificaciones si la sangre se refrigera durante unas 24 horas. Es fundamental respetar la recomendación ya que un defecto o exceso de sangre según la proporción de anticoagulante del tubo va a producir alteraciones hematológicas. Lo dejamos secar al aire, y luego lo fijamos introduciéndolo en un pocillo que contenga metanol y después se tiñe. Los frotis sanguíneos también deberían ser preparados inmediatamente después de haber obtenido la muestra o como máximo transcurridas dos horas tras la extrac-ción de la sangre. Así se evitan los problemas derivados de que la Pruebas bioquímicas Recordemos que la sangre es un tejido líquido, está formada por dos partes, las células y el líquido en el que nadan, que se denomina plasma. El plasma se obtiene tras centrifugar la sangre que se ha introducido en un tubo con anticoagulante. Contiene factores de la coagulación (fibrinógeno). Si ponemos sangre en un tubo de ensayo sin anticoagulante y dejamos pasar unos minutos se forma un coágulo. Posteriormente, el

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5 10 Conservación suero/plasma Si las determinaciones no se realizan inmediatamente después de haber obtenido el suero o plasma: conservar el suero/plasma a 4ºC: la mayoría de los compuestos se conservan bien a esta temperatura al menos durante tres días. congelar el suero/plasma a -20 ºC: hay muy pocos compuestos que no son estables a esta temperatura durante largo tiempo. coágulo se contrae y se separa de un líquido ambarino y transparente que es el suero sanguíneo. El suero se obtiene dejando que se produzca la coagulación espontáneamente en un tubo, preferentemente de vidrio, en el que no se ha puesto anticoagulante y después centrifugando. El plasma se obtiene tras centrifugar la sangre que se ha introducido en un tubo con anticoagulante. La mayoría de las pruebas bioquímicas que se hacen en el laboratorio de análisis clínicos pueden realizarse en muestras de suero. Muchas de estas determinaciones pueden realizase también en muestras de plasma teniendo en cuenta que el anticoagulante que usemos no interfiera en la prueba. Como hemos dicho para obtener suero para hacer las pruebas bioquímicas la muestra de sangre debe introducirse en un tubo seco sin anticoagulante. Las muestras así obtenidas se dejan a temperatura ambiente en posición vertical hasta que se coagulen y se inicie la retracción del coágulo (30-40 minutos después de obtener la muestra). Posteriormente se centrifugan los tubos a rpm (5-10 min) para separar el suero del coágulo. Esta separación conviene realizarla dentro de las dos horas después de la toma de muestras para evitar el intercambio de compuestos entre las células y el suero y que la muestra se deteriore. Si queremos obtener plasma, las muestras de sangre han de recogerse en tubos que contengan heparina, preferentemente de litio, ya que este anticoagulante interfiere en muy pocas determinaciones bioquímicas. Igual que para hacer el hemograma, es muy importante adicionar al tubo el volumen de sangre indicado en el mismo. El plasma se obtiene centrifugando la muestra a rpm (5-10 min). Al igual que el suero, conviene separar el plasma de las células dentro de las dos horas después de la toma de muestras. Para que las células se adhieran al portaobjetos, y para evitar que se degeneren, hay que fijar la muestra. El método de fijación puede variar según la técnica de tinción que se vaya utilizar. Normalmente en la clínica o para el envío de muestras a otro laboratorio la muestra debe de secarse al aire y luego debe fijarse con metanol. También puede utilizarse el primer reactivo de las técnicas rápidas. Si la muestra se remite a un laboratorio especializado es mejor no teñirlas en la clínica, hay que fijarlas y dejarlas sin teñir. Cuando la preparación se tiñe en la clínica se usa normalmente la Técnica rápida Diff-Quik. Esta técnica de tinción es muy utilizada debido a su sencillez y rapidez, todos sus reactivos son comerciales y están ajustados para realizar la técnica en el menor tiempo posible.

6 prevención de la salud.11 Técnica de Diff-Quik Fijación: Secar al aire. Fijar en metanol durante 3 minutos o en la solución fijadora comercial. Soluciones: a) Solución 1: fijador comercial b) Solución 2: colorante comercial (eosina) c) Solución 3: colorante comercial (mezcla de colorantes azules) Técnica: Según las instrucciones del fabricante 1º Solución 1 (fijador): 5 pases de 20 segundos cada uno. 2º Solución 2 (eosina): 5 pases de 20 segundos cada uno. 3º Solución 3 (azules): 5 pases de 20 segundos cada uno. 4º Lavar en agua corriente. 5º Secar al aire. Cómo hacer un frotis sanguíneo? Utilizaremos dos portas, uno con la gota de muestra en un extremo, y el otro para realizar la extensión de la sangre (Figura 1). El porta de arriba puede ser sustituido por un cubre. 1) Apoyaremos uno de los bordes cortos del porta de extensión (o un cubre), sobre el porta con la muestra, formando un ángulo de 30-40º 2) Deslizaremos el porta de extensión hasta contactar con la gota, con lo que el material se extenderá en forma de línea en el borde corto del porta de extensión 3) Con un movimiento rápido y suave deslizamos el porta de extensión, alejándonos de la gota, formándose una capa uniforme Los tiempos de inmersión en cada solución pueden variar según las preferencias de la persona que va a interpretar la citología y el tiempo que llevan los colorantes abiertos. Recomendaciones: Guardar las soluciones en botes herméticos de boca ancha. Una vez usados por primera vez, controlar la antigüedad (precipitados, contaminación, dilución, concentración) de los colorantes.