Unidad 3. El estrés oxidante DRA. PAULINA DEL VALLE PÉREZ

Transcripción

1 Unidad 3. El estrés oxidante DRA. PAULINA DEL VALLE PÉREZ

2 Qué es el estrés oxidante? Oxígeno Vida Metabolismo Especies reactivas (O, N) CYP450 (CYP2E1), FMO, NADPH oxidasa, COX, NO-sintetasa. Mecanismos celulares de homeostasis Perturbación de este balance: Aumento en la producción de especies oxidantes (diquat): O 2 -, H 2 O 2 Inhibición de los mecanismos antioxidantes celulares (butionina sulfoximina: GHS) Liberación de complejos iónicos

3 Trastornos donde se involucra el estrés oxidante Enfermedad Enfermedades cardiovasculares Cáncer Diabetes Enfermedades neurodegenerativas Enfermedades psiquiátricas Abuso de alcohol y drogas Cataratas Menopausia Enfermedades de la piel Infertilidad Enfermedad Inflamación y artritis reumatoide EPOC Hepatitis y enfermedades hepáticas Enfermedades del riñón Convulsión Fibrosis quística Fibromialgia Obesidad y síndrome metabólico Asma Apnea del sueño

4 Principales fuentes de estrés oxidante Superóxido Activación incrementada de leucocitos Producción incrementada de ROS Metabolismo alterado del AA Mitocondria Estrés oxidante Liberación de complejos iónicos Hb, Mioglobina, Ferritina, Transferrina Modificación de las defensas celulares Inactivación o pérdida de antioxidantes

5 Factores exógenos que favorecen el estrés oxidante Alimentos: Fármacos: Dieta rica en proteínas y lípidos Anticancerígenos Xenobióticos pro-oxidantes Psoralenos (furanocumarinas) Dietas pobres en antioxidantes Radiaciones: Alcohol y café Ionizantes: rayos X, rayos g Contaminantes ambientales: UV Humo de cigarro Microondas Hidrocarburos Absorbentes dérmicos: Pesticidas Derivados de psoralenos Metales y asbestos

6 Factores endógenos que favorecen el estrés oxidante Sedentarismo Ejercicio físico excesivo Procesos inflamatorios crónicos Cáncer Isquemia Muerte celular Estrés psicológico

7 Especies reactivas oxidantes Intermediarios reactivos de naturaleza electrofílica Especies reactivas: O o N Especies reactivas con O (ROS) Especies reactivas con N (RNS) Radicales: Radicales: Anión superóxido O - 2 Radical óxido nítrico NO Radical hidroxilo OH Radical dióxido de nitrógeno NO 2 Radical peroxilo ROO No radicales: Radical perhidroxilo HOO Ácido nitroso HNO 2 Radical alcoxilo RO Catión nitronio NO + 2 No radicales: Catión nitrosilo NO + Peróxido de hidrógeno H 2 O 2 Anión nitroxilo NO - Ácido hipocloroso HOCl Tetróxido de dinitrogeno N 2 O 4 Ozono O 3 Trióxido de nitrógeno N 2 O 3 Oxígeno singulete 1 O 2 Peroxinitrito ONOO -

8 Especies reactivas de oxígeno Son generadas in vivo por el metabolismo aerobio Vía de reducción del oxígeno: O 2 -, H 2 O 2, OH El oxígeno molecular es el radical más abundante en los sistemas biológicos Se pueden producir a partir de metales de transición (Fe, Cu)

9 Tiempo de vida media Va a determinar la estabilidad de la ROS reactividad Procesos de reducción espontáneos (DG negativo), excepto la reducción de O 2 a O 2 - Potencial estándar de reducción (DE positivo) ROS Tiempo de vida media OH 10-9 s O s 1 O s RO 10-6 s ROO 10-2 s O 3 H 2 O 2 segundos minutos

10 Oxigeno singulete 1 O 2 1 O O 2 O 2

11 El anión superóxido Se forma en todas las células aeróbicas (mitocondrias) O 2 + e - O - 2 (DE = -0.33). Proceso no espontáneo CYP, complejo NADPH oxidasa (macrófagos) y la xantina oxidasa Se pueden formar otras ROS a partir O - 2 Reacción de Haber-Weiss: O H 2 O 2 O 2 + OH + H 2 O Puede difundir hacia otros lugares de la célula Ataca a ADN, fosfolípidos de membrana, polisacáridos, tioles y aminas.

12 El peróxido de hidrógeno Puede formarse espontáneamente O 2 + 2H + +2e - H 2 O 2 (DE = 0.31) Superóxido dismutasa (SOD) Citosol: Cu 2+ o Zn 2+ Mitocondria: Mn 2+ Células epiteliales y en plaquetas Se descompone en agua por: Catalasa (selectividad) Glutatión peroxidasa (GSH-Px) Puede generar radical hidroxilo: Reacción de Fenton: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH - +Fe 3+ Reacción de Haber-Weiss: O H 2 O 2 O 2 + OH + H 2 O

13 El radical hidroxilo Oxidante más potente de sistemas biológicos H 2 O 2 OH (DE = V). Proceso espontáneo Actúa en sitios cercanos a su producción (reacciona in situ) Favorece reacciones en cadena: peroxidación de lípidos Se forma a partir de radiación ionizante, la reacción de Fenton y Haber-Weiss O bien se puede producir por peroxinitrito: O NO ONOO - ONOO - + H + ONOOH ONOOH OH + NO 2 Fe 2+ + HOCl OH + Cl - + Fe 3+ Daño a ADN, enzimas y membranas

14 Otras especies oxidantes Radical peroxilo (ROO ) Se forma a partir de ácidos grasos poliinsaturados (RH) RH + OH R + H 2 O ROO Baja capacidad oxidante Puede captar un H de un lípido (ruptura heterolítica) y producir reacciones en cadena (ROOH) Acido hipocloroso Mecanismo de defensa de neutrófilos Mieloperoxidasa: H 2 O 2 + Cl - + H + HOCl + H 2 O Alto poder oxidante: daña proteínas de membrana provocando lisis Aminas, tioles, nucleótidos, hemoproteínas

15 Daño oxidante al ADN Daño en las bases nitrogenadas 8-hidrodeoxiguanina 8-OH-G (biomarcador de daño a ADN) Alteración de bases (deleciones), sitios apúricos y ruptura de hebras Activación de la poli-adp-ribosa polimerasa (PARP) Enzimas encargadas de la reparación de ADN: Se activa al haber daño al ADN Polimerización de NAD + para formar ADP-ribosa Sobreexpresión: NAD, agotamiento de ATP Elevación intracelular de Ca 2+ Muerte celular por necrosis Excitotoxicidad Activación de proto-oncogenes

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17 Peroxidación de lípidos Componentes lipídicos de las membranas ac. grasos poliinsaturados Susceptibles al ataque de radicales libres Formación de lípidos hidroperóxidos (LOOH) Cambios en la permeabilidad Disminución de la fluidez Alteración de las proteínas de membrana Transporte iónico alterado Generación de metabolitos tóxicos (aldehídos y alcanos) Liberación de material compartamentalizado

18 Iniciación Lípido poliinsaturado LH Radical libre lipídico L RADICAL LIBRE OH Abstracción de H Deslocalización del radical Propagación Radical peroxilo LOO + LH Lípido hidroperóxido LOOH + L + O 2 Abstracción de H de otro LH (reacción en cadena) Terminación Radicales peroxilos y alcoxilos (LO ) Aldehídos y alcanos tóxicos Metales de transición

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20 Peroxidación del ácido araquidónico

21 Generación de metabolitos tóxicos Peróxidos liposolubles Estimulan la síntesis de PG (activación de COX) Alteran el crecimiento celular Aldehídos a,b-insaturados (4-hidroxinonenal) Aductos con glutatión (GSH) Afecta a la adenilatociclasa y fosfolipasa Reducen el crecimiento y promueven la diferenciación celular Inhiben la agregación de plaquetas Bloquean la acción de macrófagos Proliferación de peroxisomas: aumento de ROS

22 Generación de aductos

23 Daño oxidante a proteínas Los aminoácidos son susceptibles a ser atacados por radicales libres Formación de aductos con aldehídos (de la peroxidación de lípidos) Bases de Schiff Modificación de su estructura secundaria y/o terciaria Cambios en la actividad enzimática Alteración en las membranas Enlaces cruzados entre receptores proteicos Alteración de la homeostasis de calcio

24 Inactivación de la a-1-antitripsina a-1-antitripsina inhibe a la elastasa protegiendo a los tejidos de daño Elastasa es una proteasa importante en procesos inflamatorios: neutrófilos HOCl inactiva a la a-1-antitripsina Proteólisis descontrolada de la elastina Daño epitelial Pulmón Hígado

25 Aterosclerosis Oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL) Unión del malondialdehído (MDA) a la lisina de la apo-proteína B Imposibilita su reconocimiento por receptores de células endoteliales Son fagocitadas por macrófagos Se convierten en células espumosas

26 Daño oxidante a carbohidratos Los monosacáridos (aldosas) pueden oxidarse en presencia de metales, generando radicales libres, H 2 O 2 o compuestos dicarbonílicos (MDA) La glucosa (aldehído) puede formar bases de Schiff con proteínas (glicosilación) Reacción de Maillard Productos de Amadori Alteración vascular en Diabetes T2 Glucosa Proteína Rearreglo Producto de Amadori

27 Biomarcadores de estrés oxidante Peroxidación de lípidos Oxidación de proteínas Oxidación de CHOS Malondialdehído (MDA) Isoprostanos Acroleína 4-hidroxinonenal Oxidación de ADN Oxidación de tioles Aldehídos reactivos 8-hidroxiguanosina (8-OH-G) Formación de 3-nitrotirosina LDL oxidada (LDL-Ox) Anticuerpos vs LDL-Ox Productos de Amadori

28 Malondiadehído y TBA Acido tiobarbitúrico -H 2 O -H 2 O

29 Métodos de detección de ROS Presencia de ROS a nivel intracelular Se transforma en un producto fluorescente DCFH-DA Amplex RED

30 Antioxidantes Sustancias que a concentraciones menores que el sustrato oxidable, detienen o previenen la oxidación del mismo Sustrato oxidable = cualquier molécula endógena Por su origen: Naturales: SOD, a-tocoferol, vitamina C, GSH, flavonoides, carotenoides Sintéticos: BHT, N-acetilcisteína, hidroxipiridonas, inhibidores de XO Por su modo de acción: Antioxidantes primarios: GSH, vitamina C y E, Ubiquinonas, b- caroteno Enzimas de detoxificación: SOD, catalasa, peroxidasas, GHS-Px Secuestradores de metales: Transferrina, albúmina, ferritina, metalotioneninas Regeneradores de antioxidantes: glutatión-reductasa, G-6-Pdeshidrogenasa Exportadores: acarreador de GSH oxidado, acarreador de conjugados con GSH

31 Distribución de los antioxidantes

32 Antioxidantes y la peroxidación de lípidos Inhibidores preventivos: Retardan la fase de iniciación Inducir la descomposición de hidroperóxidos Catalasa Glutatión peroxidasa (GSH-Px) Glutatión-S-transferasa, b-caroteno, a-tocoferol (vit E) Inhibidores de la propagación: Interrumpen las reacciones en cadena al reaccionar con los radicales libres Vitamina C, b-caroteno, ácido úrico, polifenoles, furfurales, furanonas, etc.

33 El glutatión (GSH) como antioxidante Agente reductor en el metabolismo de H 2 O 2 e hidroperóxidos (LOOH) Considerado como el amortiguador redox Enzima: Glutatión-peroxidasa (GSH-Px) Nucleófilo para conjugación con electrófilos (Fase II) HNE Enzima: Glutatión-S-tranferasa La GSH-Px es el removedor más importante de H 2 O 2 Cofactor Selenio Al oxidase se forma un enlace disulfuro (GS-SG) entre dos moléculas de GSH Se puede volver a reducir para formar GSH por la glutatión-reductasa En condiciones de estrés oxidante GS-SG La proporción GSH/GSSG es un indicador de EO Se excreta activamente, GSH

34 Enzimas que utilizan GSH como sustrato Enzima Reacciones Glutatión peroxidasa 2 GSH + H 2 O 2 GSSG + H 2 O 2 GSH + LOOH GSSG + LOH + H 2 O Glutatión transferasa (endoperoxidasa) Fosfolípido peróxido- GSH-peroxidasa 2 GSH + LOOH GSSG + L(OH) 2 + H 2 O GSH + aldehídos GS-alcanal 2 GSH + ROOH GSSG + ROH + H 2 O ROOH= fosfolípido, colesterol Glutatión reductasa GSSG + NADPH + H+ 2 GSH +NADP +

35 Antioxidantes enzimáticos Enzima Reacción Cofactor SOD O H + H 2 O 2 Zn (II), Cu (I), Mn (II) Catalasa H 2 O 2 H 2 O + O 2 Fe (II) Citocromo C peroxidasa ROOH ROH + H 2 O Fe (II) La SOD protege a la célula de las reacciones dañinas del superóxido SOD 1 (Cu, Zn, citoplasma), SOD 2 (Mn, mitocondrias), SOD 3 (Cu, Zn, extracelular) Catalasa (oxidoreductasa) utiliza grupo hemo (Fe II). Se encuentran en los peroxisomas. Citocromo C peroxidasa reacciona con hidroperóxidos. Utiliza grupo hemo

36 Vitamina E a-tocoferol o VitE-OH Liposoluble membranas Inhibidor preventivo de la peroxidación lipídica Control de la fluidez de la membrana Incremento de ciertas respuestas inmunes Reducción del daño isquémico Agregación plaquetaria Dona un electrón al LOO para formar LOOH (más estable) VitE-OH + LOO VitE-O + LOOH

37 Vitamina E El radical VitE-O puede reaccionar con un LOO y oxidarse hasta una quinona estable Se lleva a cabo un equilibrio quinonahidroquinona

38 Vitamina E como pro-oxidante El exceso de radical VitE-O puede iniciar la propia peroxidación de lípidos Co-oxidantes

39 Vitamina C Ácido ascórbico VitC-(OH) 2 hidrosoluble Semi-dehidroascorbato O-VitC-OH (radical ascorbato) Dehidroascorbato O=VitC=O (estable) Reduce a la vitamina E VitE-O + VitC-(OH) 2 VitE-OH + O-VitC-OH VitE-O + O-VitC-OH VitE-OH

40 Vitamina C como pro-oxidante Pro-oxidante en presencia de metales de transición VitC-(OH) 2 + Fe(III) Fe(II) + H + + O-VitC-OH Reacción de Fenton

41 Vit E y C como antioxidantes

42 Compuestos polifenólicos

43 Compuestos polifenólicos

44 Ensayo DPPH Radical estable difenil-picril-hidrazilo DPPH (MORADO) DPPH (AMARILLO) Ensayo que permite determinar la actividad antioxidante de diversos compuestos CI 50 Scavengers

45 Trolox Análogo de la Vit E Sirve como referencia de capacidad antioxidante (capacidad antioxidante equivalente de Trolox) Suplementos alimenticios Alimentos Bebidas