XVIII. Simposio Anual Avedila LIBRO DE. Madrid, 14 y 15 de noviembre de es

Transcripción

1 XVIII Simposio Anual Avedila Madrid, 14 y 15 de noviembre de LIBRO DE RESÚMENES

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3 LIBRO DE RESUMENES Madrid, noviembre de 2013

4 MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE Edita: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Secretaría General Técnica Centro de Publicaciones Maquetación, impresión y encuadernación: Talleres del Centro de Publicaciones del MAGRAMA NIPO: (Papel) NIPO: (Línea) ISBN: Depósito Legal: M Catálogo de Publicaciones de la Administración General del Estado: Distribución y venta: Paseo de la Infanta Isabel, Madrid Teléfono: Fax: Plaza de San Juan de la Cruz s/n Madrid Teléfono: Fax: Tienda virtual: centropublicaciones@magrama.es Datos técnicos: Formato; 17x24 cm. Caja de texto: 12,5x21,5 cm. Composición: una columna. Tipografía: Calibrí a cuerpo y Perpetua a cuerpo 50. Encuadernación: Rústica fresado. Papel: interior cyclus de 90g. Cubierta en cartulina mate de 150g. Tintas: 1. En esta publicación se ha utilizado papel libre de cloro de acuerdo con los criterios medioambientales de la contratación pública. 2

5 Índice: Bienvenida 5 Comité Organizador 7 Comité Científico 8 Patrocinadores 9 Fecha de celebración, Sede 10 Programa 13 Resúmenes Conferencias 19 Resúmenes pósters 81 Autores 123 3

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7 Bienvenida: Estimado amigo: En nombre del comité organizador y el comité científico te damos la bienvenida al XVIII Simposio Anual de AVEDILA que se celebra en Madrid los días 14 y 15 de noviembre de La presente cita, es sin duda, un foro excepcional en que compartir experiencias en el ámbito del diagnóstico laboratorial veterinario. Esperamos que esta reunión, sirva a todos como un nexo común para establecer nuevas y fructíferas colaboraciones con otros profesionales de esta área de trabajo y permitir el intercambio de conocimientos que nos lleve a una mejora constante en el campo del diagnóstico. Agradecer en especial al Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente y a la Asociación de Veterinarios Especialistas en Diagnóstico de Laboratorio (AVEDILA) el apoyo mostrado en la consecución de este evento, así como a los patrocinadores sin cuya ayuda no hubiese tenido lugar este simposio. Espero que disfrutes de estos días tanto a nivel personal como profesional. Concepción Gómez Tejedor y Tomás Mayoral 5

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9 Comité Organizador: Concepción Gómez Tejedor Ortiz. Coordinadora General de Laboratorios. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA). Tomás Mayoral Ortega. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Enrique Anadón Navarro. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Montserrat Agüero García. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Manuel Durán Ferrer. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Lucia Belén Pitarch Mampel. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. 7

10 Comité Científico: Concepción Gómez Tejedor Ortiz. Coordinadora General de Laboratorios. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA). Tomás Mayoral Ortega. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Montserrat Agüero García. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Ramón Juste Jordán. NEIKER Tecnalia. Concha Caballero Galván. Unidad de Análisis de Sanidad Animal (UASA). Generalitat Valenciana. Carmina Nogareda Burch. ETSEA, Universidad de Lérida. Josep Carrera Mauri. Laboratorio de Sanidad Ganadera de Vic. Generalitat de Cataluña. Marta Eulalia García Sánchez. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. José Marín Sánchez Murillo. Laboratorio Regional de Sanidad Animal. Junta de Extremadura. Lourdes Porquet Garanto. Laboratorios HIPRA, S.A. Virginia Vigo López. Laboratorio de Sanidad Animal de Canarias. Gobierno de Canarias. Eva Monleón Moscardó. Facultad de Medicina. Universidad de Zaragoza. Mariano Morales Amella. Laboratorios ALBEITAR. 8

11 Patrocinadores: 9

12 Fecha de celebración: 14 y 15 de noviembre de Sede: Fundación Carlos de Amberes. C/ Claudio Coello, nº Madrid. 10

13 Programa 11

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15 Programa: Jueves, 14 noviembre, :30 9:15 Entrega de documentación 9:15 9:45 Inauguración oficial del simposio. Dª. Carmen Vela. Secretaria de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación. Ministerio de Economía y Competitividad. Sesión 1 Moderadora: Concepción Gómez Tejedor. (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente). 9:45 11:00 Biodiversidad y enfermedades emergentes: un concepto ecológico complejo para un mundo cambiante. Ramón Soriguer. Estación Biológica de Doñana. CSIC. Complejidad del mundo vírico y evolución. Miguel Ángel Jiménez Centro de Investigación en Sanidad Animal INIA. 11:00 11:30 Pausa Café Sesión 2 Moderadora: Isabel Simarro (Universidad Complutense de Madrid). 11:30 12:10 Diagnóstico de patógenos en fauna silvestre. Christian Gortázar. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos. UCLM. 12:10 12:50 Técnicas de diagnostico de patógenos de moluscos bivalvos. Raquel Aranguren. I Instituto de Investigaciones Marinas, IIM CSIC. 13

16 12:50 13:00 Diagnóstico serológico del virus Schmallenberg y otros patógenos reproductivos en pequeños rumiantes de régimen extensivo del sur de España Lucía Reguillo Granados Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba/Centro de Investigación Agroalimentaria del Valle de los Pedroches 13:00 13:10 Enfermedad de Schmallenberg: lesiones e identificación del virus JF. García Marín Dpto. Sanidad Animal, Anatomía Patológica. Facultad de Veterinaria. Universidad de León. 13:10 13:20 Estudio de la sensibilidad antifúngica de Malassezia pachydermatis S. Álvarez Pérez Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid 13:20 13:30 Diagnóstico serológico de la neosporosis bovina: estudio comparativo de pruebas ELISA comerciales Daniel Gutiérrez Expósito SALUVET. Facultad de Veterinaria, UCM 13:30 14:30 Comida 14:30 15:10 Visita Pósters 15:10 15:50 Diagnóstico de ehrlichiosis canina. Alejandra Villaescusa. Dpto. de Medicina y Cirugía Animal UCM Sesión 3 Moderadora: Montserrat Agüero (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente). 15:50 16:30 Detección e identificación de especies en muestras de origen animal por PCR. Tomás Mayoral. Laboratorio de Genética Molecular LCV. MAGRAMA. 16:30 17:00 Pausa Café 17:00 17:40 Control de identidad en animales de explotación ganadera técnicas de genética molecular. José Antonio Bouzada. Laboratorio de Genética. Molecular LCV. MAGRAMA. 18:00 Asamblea General Avedila. 14

17 Viernes, 15 noviembre, 2013 Sesión 4 Moderadora: Concepción Caballero (Unidad de Análisis en Sanidad Animal. Valencia) 8:30 8:40 Monitorización de la seroconversión posinfección de PRRS mediante fluido oral Alba Martos Raich HIPRA 8:40 8:50 Validation of the ID Screen Peste des Petits Ruminants Antigen Capture ELISA L. Comtet IDvet, Montpellier, France 8:50 9:00 Comparación de la técnica de inmunoperoxidasa en monocapa de cultivo (IPMA) con tres ELISA comerciales para la detección de circovirus porcino tipo 2 (PCV2) Joaquim Segales Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB IRTA 9:00 9:40 Bioseguridad en laboratorios de sanidad animal: Niveles de biocontención 2, 3 y 4. Gonzalo Pascual. Centro de Investigación en Sanidad Animal INIA. 9:40 10:20 Red de Laboratorios de Alerta Biológica, RE LAB. Carmen Cañavate. Unidad de Gestión de la RE LAB. Instituto de Salud Carlos III. 10:20 10:30 Una estrategia para aplicar la serología en el diagnóstico de la tuberculosis bovina Alicia Aranaz Universidad Complutense de Madrid 10:30 10:40 Prevalencia de Clostridium difficile en aves. Cristina Orden Grupo de Investigación COVEMI. Universidad Complutense de Madrid 10:40 10:50 Investigación sobre la presencia de Coxiella burnetii en quesos elaborados con leche cruda de oveja. Álvaro Piñero Neiker Tecnalia 15

18 10:50 11:00 Brote de intoxicación botulínica en una granja de vacuno lechero Mariano Domingo Centre de Recerca en Sanitat Animal (UAB IRTA) 11:05 11:35 Pausa Café Sesión 5 Moderador: Tomás Mayoral (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente). 11:35 12:15 Claves para el diagnóstico de tricomonosis bovina. Luis Ortega. SALUVET UCM 12:15 12:55 Diagnóstico de botulismo. Francisco Javier García Peña. Laboratorio Central de Veterinaria MAGRAMA. 12:55 14:15 Mesa Redonda: Gestión de calidad y acreditación en laboratorios. Aplicación de alcances de acreditación flexibles en los laboratorios de control oficial Henny Hooghuis. Laboratorio Arbitral Agroalimentario. MAGRAMA. Aplicación del Reglamento (CE) 882/2004 para el control oficial: líneas de actuación para facilitar el cumplimiento de la acreditación obligatoria de procedimientos analíticos. Lucia Belén Pitarch. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Experiencia práctica en la acreditación mediante categorías de ensayos. Joaquín Berenguer. Centro Nacional de Alimentación. AESAN. Gestión de Calidad y Acreditación de laboratorios. Elisa Gredilla. Entidad Nacional de Acreditación (ENAC). 14:15 Clausura del Simposio D. Valentín Almansa. Director General de Sanidad de la Producción Agraria. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. 16

19 Resúmenes Conferencias 17

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21 Resúmenes conferencias: O 01 BIODIVERSIDAD Y ENFERMEDADES EMERGENTES: UN CONCEPTO ECOLOGÍCO COMPLEJO PARA UN MUNDO CAMBIANTE. Ramón Soriguer Estación Biológica de Doñana. CSIC. El aumento de enfermedades emergentes y re emergentes (es decir, enfermedades nuevas que proceden de otras áreas geográficas, y enfermedades antiguas que incrementan su rango de distribución) se considera el resultado del cambio global debido, entre otros factores, a la alteración de los hábitat naturales, el cambio climático, los movimientos migratorios y la expansión de la población humana, la pérdida de biodiversidad, la intensificación de la agricultura y ganadería, la introducción de especies exóticas, la fragmentación del hábitat y el incremento de los transportes de mercancías, personas y animales. Muchas de estas enfermedades, con un ciclo zoonótico en su mayoría, resultan una importante amenaza para la conservación de la biodiversidad, pero también pueden afectar de manera directa o indirecta a la salud humana. Recientemente se ha sugerido que la biodiversidad podría jugar un papel importante en reducir la frecuencia de epidemias al reducir la amplificación y transmisión de virus, protozoos y otros patógenos. Es por tanto importante conocer si esta menor transmisión se trata de una propiedad emergente de la biodiversidad en sí misma, o si por el contrario esta asociada a la presencia/ausencia de determinadas especies de vertebrados y, por lo tanto, los resultados obtenidos hasta ahora en las áreas estudiadas no pueden ser generalizados a otras áreas o sistemas de estudio. 19

22 O 02 COMPLEJIDAD DEL MUNDO VÍRICO Y EVOLUCIÓN. Miguel Ángel Jiménez Clavero Centro de Investigación en Sanidad Animal INIA. En el siglo XVII, Leeuwenhoek, con su microscopio, abrió una ventana nueva que permitió descubrir un mundo hasta entonces desconocido, el de los microorganismos. De modo similar los recientes avances en técnicas de secuenciación masiva han dado lugar a una nueva disciplina, la metagenómica, que nos han abierto otra nueva ventana que revela la verdadera complejidad que existe en ese mundo microbiano, del cual solo conocíamos una pequeña fracción. Dentro de los microorganismos, la diversidad mayor correspondiente a los virus. Éstos no solo son las entidades biológicas más abundantes de la tierra, sino también las más variables y diversas. Existe una pléyade de virus capaces de infectar a cada una de las demás especies de seres vivos que existen en nuestro Planeta, sean éstas animales, plantas, hongos, bacterias o arqueas. La mayoría conviven pacíficamente con sus hospedadores, pero una pequeña parte causan enfermedades, es decir, son patógenos. Por razones obvias, de entre toda esa diversidad de virus conocida como virosfera, son los virus patógenos los que más nos interesan, y por ello los más estudiados y mejor conocidos. Sin embargo, la condición de patógeno no es un atributo estable, sino que puede fluctuar. Los virus pueden ganar patogenicidad o perderla dependiendo de cambios muy sutiles: a veces unas pocas mutaciones en su genoma son suficientes para convertir a un virus pacífico en patógeno. Entender los factores que desencadenan estos cambios es fundamental para comprender cómo emergen nuevas enfermedades infecciosas, un empeño nada fácil, pues la complejidad nos sale al paso en cualquiera de los niveles que intentemos abordar este fenómeno, ya sea desde el prisma de la interacción entre el virus y el hospedador (y en su caso, de la relación de ambos con los vectores), o desde perspectivas más ecológicas y evolutivas. 20

23 O 03 DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS EN FAUNA SILVESTRE. Christian Gortázar SaBio IREC (CSIC UCLM) Ronda de Toledo s.n Ciudad Real La mayor parte de los agentes infecciosos y parasitarios conocidos son compartidos entre animales domésticos y fauna silvestre. Este hecho complica el control de muchos patógenos de importancia médica o veterinaria. España, por su situación geográfica próxima al continente Africano y por su clima, pero también por la variedad y riqueza de sus recursos faunísticos, constituye un laboratorio natural de especial interés en relación con la sanidad de la fauna silvestre. Por ello, resulta necesario contar con herramientas para la detección temprana de problemas sanitarios y desarrollar sistemas de monitorización poblacional y sanitaria que, a su vez, requieren de métodos diagnósticos adecuados. Sin embargo, el diagnóstico en fauna silvestre tiene diversas peculiaridades y dificultades especiales. En primer lugar, se trabaja con una enorme diversidad de especies, a diferencia del número comparativamente limitado de especies domésticas. En segundo lugar, la calidad y cantidad de las muestras no siempre resulta apropiada para la aplicación de determinadas analíticas. Finalmente, algunas técnicas no son aplicables a especies no tradicionales, o simplemente no se han validado. En la presentación se analizan varios ejemplos prácticos relacionados con el diagnóstico en fauna silvestre, desde infecciones por coronavirus y virus de la lengua azul, pasando por la tuberculosis y las cepas patógenas de E. coli, a algunos problemas parasitarios de importancia creciente. El mensaje final es que el diagnóstico de calidad en fauna silvestre es posible y cuenta con una demanda creciente y un importante liderazgo español, si bien requiere un continuo esfuerzo en innovación y desarrollo. 21

24 O 04 TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO DE PATÓGENOS DE MOLUSCOS BIVALVOS. R. Aranguren y A. Figueras Laboratorio Nacional de Referencia de enfermedades de Moluscos Bivalvos. Instituto de Investigaciones Marinas, IIM CSIC. El cultivo de moluscos bivalvos es una actividad acuícola bien implantada en muchos países del mundo. Su rentabilidad es alta y sus costes de producción son bajos dentro de las tecnologías de producción de cultivos acuícolas ya que la fase de preengorde y engorde se realiza íntegramente en sistemas abiertos (bateas, playas o esteros). Uno de los principales retos a los que se enfrenta la producción de moluscos bivalvos es la prevención y el control de las enfermedades. Además la posibilidad de lucha contra estas enfermedades es muy limitada. Los moluscos bivalvos solo cuentan con el sistema inmune innato, por lo tanto no es específico y no tiene memoria, ésto significa que no podemos emplear las vacunas como herramienta de control. El hecho de que su cultivo se lleve a cabo en mar abierto también repercute negativamente en la posibilidad de lucha y control de las enfermedades. La identificación y estudio del desarrollo de la enfermedad puede ayudar a controlar la dispersión de la misma, limitando las pérdidas debidas a mortalidad o morbilidad puesto que en determinadas situaciones, el desarrollo de una enfermedad que no mata al hospedador puede originar la pérdida de valor comercial del mismo como consecuencia de las malformaciones producidas. La mayoría de las enfermedades de moluscos de declaración obligatoria para la Unión Europea son enfermedades causadas por protozoos. En muchos casos, los protozoos presentan un ciclo de vida complejo con múltiples hospedadores intermediarios. en el caso de que el parásito necesite tal hospedador para completar su ciclo de vida, o reservorio, si simplemente se mantiene en dicho organismo sin desarrollarse. Hasta el momento solo la prevención y un correcto y rápido diagnóstico pueden ayudarnos a combatir las enfermedades. En el caso de las enfermedades causadas por virus, cabe resaltar la falta de líneas celulares de moluscos lo que hace que el diagnóstico y caracterización de virus que afectan a los moluscos bivalvos sea más difícil y a veces no se lleguen a un buen diagnóstico del agente patógeno. Las perspectivas de investigación sobre las técnicas de diagnóstico para las enfermedades de moluscos bivalvos se orientan hacia la optimización, tanto en lo que respecta a la sensibilidad como a la especificidad, de las técnicas que ya están en uso y, al desarrollo de nuevas técnicas de Biología Molecular más rápidas y fáciles de aplicar 22

25 (PCR cuantitativas). Estas técnicas permiten un diagnóstico temprano del patógeno incluso en etapas muy tempranas de la infección. Resulta interesante los intentos de diagnóstico múltiples de varios patógenos en un mismo hospedador mediante una única técnica (PCR) como ya se ha descrito para H. nelsoni, H. costale y P.marinus, aunque no se ha validado. 23

26 O 05 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DEL VIRUS SCHMALLENBERG Y OTROS PATÓGENOS REPRODUCTIVOS EN PEQUEÑOS RUMIANTES DE RÉGIMEN EXTENSIVO DEL SUR DE ESPAÑA Reguillo, L; Gómez Laguna, J; Hernández, M; Cardoso Toset, F; Tarradas, C; Maldonado, A; Astorga, RJ. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba/Centro de Investigación Agroalimentaria del Valle de los Pedroches (CICAP) Tras un primer caso de Virus Schmallemberg (VSB) confirmado en el sur de España en marzo de 2012, se llevó a cabo un estudio serológico retrospectivo en rebaños de ovino en régimen extensivo de áreas cercanas con el fin de determinar la prevalencia de VSB y de otros patógenos reproductivos (Chlamydophila abortus, Coxiella burnetii, Border Disease virus BDV, Toxoplasma gondii y Neospora caninum). Paralelamente se investigó la presencia de anticuerpos en muestras de jugo de carne con el fin de validar su uso en estudios de seroprevalencia. Un total de 209 ovejas de desvieje de raza Merina, o sus cruces, procedentes de 12 explotaciones fueron muestreadas. Las muestras de suero y jugo de carne se tomaron en el matadero y fueron analizadas mediante kits comerciales de ELISA. Los patógenos con mayor prevalencia fueron C. abortus (62.68%, CI ) y T. gondii (57.42%, CI ). La seroprevalencia frente a BDV (16.27%, CI ) y C. burnetii (13.88%, CI ) fue moderada, y sólo 4 de 209 animales (2.39%, CI ) presentaron anticuerpos específicos frente N. caninum y VSB. Todos los rebaños de ovino examinados fueron positivos a tres o más patógenos. El 25.36% de los rebaños fueron simultáneamente positivos frente a T. gondii y C. abortus. La concordancia entre muestras de suero y jugo de carne fue moderada para T. gondii (72.73%) y BDV (82.86%), y ajustada para C. abortus (65.71%). Nuestros resultados ponen de manifiesto la circulación de VSB en el verano de 2011 en el sur de España. En cualquier caso, C. abortus y T. gondii fueron los patógenos con mayor prevalencia detectada en ovino extensivo. Nuestros resultados preliminares señalan a la muestra de jugo de carne como una muestra biológica de potencial interés para los estudios de seroprevalencia en ovino. Palabras clave: VSB; seroprevalencia; suero; jugo de carne; ovino extensivo. 24

27 O 06 ENFERMEDAD DE SCHMALLENBERG: LESIONES E IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS García Marín, J.F. 1 ; Royo, L.J. 2 ; Gómez, A. 3 ; Polledo, L. 4 y Balseiro, A. 2 1 Dpto. Sanidad Animal, Anatomía Patológica. Facultad de Veterinaria. Universidad de León. 2 SERIDA, Asturias; 3 Veterinario, Salamanca. 4 Micros Veterinaria. León En 2011 se diagnóstico por primera vez en Europa la Enfermedad de Smallenberg, causada por un Orthobunyavirus, familia Bunyaviridae (SBV) afectando a ganado vacuno y ovino de Alemania y Holanda y extendiéndose rápidamente a otros países. Hasta la marzo de este año se han comunicado 8,730 casos (Informe European Food Safe Authority (EFSA), marzo 2013) en diversos países Europeos. En España fue diagnosticada en ganado ovino en la provincia de Córdoba en Entre finales de enero y abril de 2013 se atendieron nueve partos distócicos de fetos de terneros nacidos muertos a término, de otros tantos rebaños localizados en la misma zona y en régimen extensivo observándose en los mismos malformaciones del aparato locomotor y esquelético. En dos de los animales se llevó a cabo una necropsia completa y toma de muestras sistemática para estudios anatomopatológicos. Las lesiones observadas fueron artrogriposis, tórticolis, escoliosis, cifosis, braquignatia e hipoplasia grave del SNC asociada a microcefalia, micromielia e hipoplasia de cerebelo muy manifiestas, junto con lisencefalia e hidranencefalia en el ternero 1 e hidrocefalia y porencefalia en el 2. En los músculos esqueléticos se apreció una intensa hipoplasia/atrofia de lo mismos. En muestras de sangre, SNC, líquido cefalorraquídeo, músculo esquelético, bazo, timo, cordón umbilical, moco de placenta y líquido ascítico se realizaron estudios de detección de ARN vírico mediante RT qpcr, siendo todas ellas positivas a excepción del líquido ascítico en el 1 y el líquido cefaloraquideo y placenta en el 2. Se llevaron a cabo estudios serológicos en 11 vacas, siendo 5 positivas, incluidas las madres de los 2 terneros necropsiados. Estos resultados confirman de la enfermedad de Schmallenberg en ganado vacuno en la región estudiada. Dado el extenso periodo de tiempo en que aparecieron los casos y los tipos de lesiones, así como las características epidemiológicas de esta enfermedad, indicarían una persistencia del vector infectante durante largos periodos de tiempo del verano e inicio del otoño de Asimismo, debido a la similitud de varias de las lesiones observadas con las ocasionadas por otros virus teratógenos, principalmente por BVD en ganado vacuno, se recomienda incluir esta enfermedad en los protocolos de diagnóstico diferencial. 25

28 O 07 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA DE Malassezia pachydermatis Álvarez Pérez, S. 1,2 ; Blanco, J.L. 1 ; Peláez, T. 2 ; Cutuli, M. 1 ; García, M.E. 1 1 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid; 2 Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas, Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid Malassezia pachydermatis es una levadura considerada como el principal agente fúngico causante de otitis canina, si bien también puede estar implicada en diversos procesos dermatológicos y, ocasionalmente, en infecciones sistémicas. A pesar de la importancia de M. pachydermatis en medicina veterinaria, aún se sabe poco sobre su sensibilidad a los distintos compuestos antifúngicos disponibles para el tratamiento de las micosis animales. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de sensibilidad antifúngica in vitro de una colección de 60 aislamientos de M. pachydermatis procedentes de casos de otitis canina mediante un método comercial (Etest) y un método de referencia internacional (CLSI modificado para Malassezia), así como hacer una evaluación crítica de las posibilidades, dificultades y limitaciones de dichos métodos. Los resultados obtenidos muestran la sensibilidad de la mayoría de los aislamientos analizados frente a anfotericina B (CMI90 1 mg/l), itraconazol (CMI mg/l), posaconazol (CMI90 1 mg/l) y voriconazol (CMI mg/l). Por el contrario, todos los aislamientos mostraron limitada sensibilidad a caspofungina (CMI90 16 mg/l), y una gran proporción (25 36%, según el método empleado) presentaron moderada o reducida sensibilidad a fluconazol. En general, el método del Etest es más rápido y sencillo de realizar e interpretar que el método de referencia, si bien supone un notable coste económico. La concordancia entre ambos métodos es aceptable, aunque depende en gran medida del antifúngico analizado y el tiempo de incubación (48 ó 72 h). Otro factor que resulta crítico a la hora de evaluar y comparar los diferentes métodos de estudio in vitro de la sensibilidad antifúngica es el establecimiento de puntos de corte que permitan diferenciar entre aislamientos sensibles y resistentes de la levadura para cada compuesto y tengan además una significación clínica. Tales valores no han sido todavía determinados en el caso de Malassezia spp. 26

29 O 08 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA NEOSPOROSIS BOVINA: ESTUDIO COMPARATIVO DE PRUEBAS ELISA COMERCIALES Álvarez García, G., García Culebras, A., Gutiérrez Expósito, D., Navarro Lozano, V., Pastor Fernández, I. y Ortega Mora, L.M. SALUVET, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. Actualmente, los programas de control frente a la neosporosis bovina se basan en un diagnóstico serológico previo y en medidas de manejo ya que no existen vacunas ni tratamientos eficaces. A pesar de la gran variedad de técnicas serológicas disponibles, la prueba más utilizada y comercializada a nivel mundial es el ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Diversos estudios comparativos realizados en el pasado han quedado obsoletos debido al cambio de pruebas diagnósticas disponibles en el mercado. Por tanto no existen datos actualizados de las características diagnósticas de éstos nuevos ELISAs, de gran utilidad para los laboratorios de diagnóstico. Por ésta razón, el objetivo del presente estudio fue comparar la mayor parte de ELISAs comerciales que hay disponibles en la actualidad (n=10) evaluando su sensibilidad (Se) y espeficidad (Esp) y reajustando los puntos de corte cuando fuera necesario mediante análisis TG ROC. Se utilizó un panel de sueros de referencia de ganado bovino con infección natural y experimental, así como no infectado (n=458). Para el cálculo de la Se y Esp se consideraron 2 criterios gold standard : (i) el resultado mayoritario de todos los ELISAs y (ii) la información previa basada en datos epidemiológicos, clínicos y serológicos. En ambos casos la mayoría de los ELISAs mostraron niveles de Se y Esp elevados. Además, todas las pruebas mostraron una concordancia (valores kappa) casi perfecta a excepción de las comparaciones que incluían los ELISAs VMRD y SVANOVIR. Los ELISAs que mostraron los valores más elevados de Se y Esp fueron HIPRA CIVTEST, IDVET, BIOVET e IDEXX Rum (Se y Sp >95%). No obstante, tras los ajustes realizados mediante TG ROC, los ELISAs BIO X, LSI Bov, LSI Rum e IDEXX Bov también mostraron valores elevados de Se y Esp, siendo la mejora más significativa para los ELISAs SVANOVIR y VMRD. Los valores kappa mejoraron notablemente con el punto de corte corregido. Este es el primer estudio que ofrece una actualización de las características diagnósticas de los ELISAs comerciales actuales. Estos resultados son importantes y necesarios no solo para los laboratorios de diagnóstico sino también para las empresas que fabrican y distribuyen éstas pruebas. 27

30 O 09 INTRODUCCIÓN DIAGNÓSTICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA. Alejandra Villaescusa Fernández Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. Las ehrlichiosis caninas son enfermedades de transmisión vectorial causadas por bacterias gramnegativas intracelulares obligadas del género Ehrlichia, familia Anaplasmataceae. 1 En nuestro país hasta el momento solo se ha diagnosticado infección en perros por una de las especies del género, Ehrlichia canis, agente etiológico primario de la ehrlichiosis monocítica canina (EMC). La transmisión de E. canis es llevada a cabo por Rhipicephalus sanguineus, la garrapata más ubicua y frecuente en perros de nuestro país. El diagnóstico de la EMC puede ser en ocasiones complicado, debido a que la enfermedad se caracterizada por la existencia de signos clínicos inespecíficos y alteraciones de la analítica sanguínea comunes con otras enfermedades. Esta inespecificidad de las manifestaciones clínicas hace que para el diagnóstico de la EMC sea necesario recurrir a pruebas analíticas específicas que determinen de forma directa o indirecta la infección por E. canis. DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LA EHRLICHIOSIS MONOCÍTICA CANINA La EMC es una enfermedad multisistémica caracterizada por manifestaciones clínicas variables. Tras un período de incubación de 8 20 días se describe en las infecciones experimentales el desarrollo de tres fases en la enfermedad: aguda, subclínica y crónica. Las fases aguda y crónica son las fases sintomáticas, mientras que durante la fase subclínica, que puede llegar a durar hasta 5 años en condiciones naturales, los perros parecen clínicamente sanos, mostrando únicamente alteraciones en la analítica sanguínea. 1 Las fases aguda y crónica son en la infección natural difíciles de distinguir entre sí, ya que ambas se caracterizan por la presencia de signos clínicos inespecíficos. Concretamente destaca la aparición de fiebre, apatía, anorexia y pérdida de peso, que pueden acompañarse de linfadenomegalia, esplenomegalia, hepatomegalia y palidez de mucosas. Asimismo, es frecuente el hallazgo de signos hemorrágicos, principalmente epistaxis, petequias y equimosis. En ocasiones pueden observarse signos oftalmológicas, respiratorios, neurológicos, locomotores o, incluso, alteraciones 28

31 reproductivas. 1 3 En la fase crónica grave de la EMC pueden aparecer signos clínicos asociados con el desarrollo de glomerulonefritis y/o hipoplasia o aplasia de médula ósea. 3 Debido a la inespecificidad de los signos clínicos o a la ausencia de los mismos durante largos períodos de tiempo, no es infrecuente que sean los hallazgos de la analítica sanguínea los que nos hagan sospechar de esta enfermedad. Entre los cambios que con mayor frecuencia se describen en la hematología destacan la trombocitopenia y/o alteraciones en la funcionalidad plaquetaria, que pueden mantenerse durante todas las fases de la enfermedad. 1 3 También es frecuente observar en el curso de la EMC la existencia de anemia, que puede ser regenerativa o no regenerativa. 2,3 Se puede producir tanto leucopenia como leucocitosis, aunque esta última es menos frecuente. Dentro de la serie blanca pueden encontrarse alteraciones muy variables, como neutropenia, linfocitosis o linfopenia y monocitosis. 1 La hiperproteinemia por hiperglobulinemia generalmente debida a una gammapatía policlonal parece ser el hallazgo más frecuente en la bioquímica sanguínea en los perros con ehrlichiosis. 2 5 También se han descrito en la bioquímica sanguínea la existencia de hipoalbuminemia y elevaciones de algunas enzimas hepáticas, así como de la creatinina. 1,2 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO Los métodos directos de diagnóstico de EMC se basan en la detección u observación del agente etiológico a partir de muestras obtenidas del animal sospechoso. La identificación visual del agente, mediante la observación de mórulas de Ehrlichia spp. en el interior de los leucocitos a partir de frotis sanguíneos o aspirados de tejidos (como bazo, médula ósea, nódulo linfático, líquido cefalorraquídeo o líquido sinovial) permite un diagnóstico definitivo de la enfermedad. 1 Sin embargo, y a pesar del desarrollo de técnicas destinadas a incrementar la posibilidad de identificar mórulas a partir de estas muestras, esta técnica resulta poco sensible, ya que las mórulas aparecen con mayor frecuencia en la fase aguda de la enfermedad y de forma transitoria. Además, para el empleo de esta técnica se requiere mucho tiempo y experiencia para la detección de las mórulas sin confundirlas con artefactos, tinciones mal realizadas u otras inclusiones. 6 Otro posible método de diagnóstico directo de la infección por E. canis sería el cultivo y aislamiento de este agente a partir de muestras del animal sospechoso en líneas celulares susceptibles de ser infectadas por este agente. Sin embargo, este método es laborioso y requiere mucho tiempo y equipamiento laboratorial específico, por lo que queda prácticamente relegado a labores de investigación. 5 Las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la posterior secuenciación del material amplificado, son métodos sensibles y específicos para la detección y caracterización de estas infecciones. Esta técnica puede ser especialmente útil para confirmar la eliminación del microorganismo tras el 29

32 tratamiento, ya que detecta el ADN del mismo y, por tanto, la existencia de infección activa. 5 Se han empleado técnicas de PCR convencionales, anidadas y en tiempo real para la detección de ADN de este agente. El gen 16S rrna ha sido el más ampliamente empleado en estas técnicas moleculares, si bien recientes estudios han empleado cebadores frente a otros genes, como p30, groesl, dsb, o glta, entre otros. 7 9 En la actualidad, algunos autores parecen preferir la PCR cuantitativa frente a la anidada o la convencional debido a su mayor sensibilidad y menor riesgo de contaminación. 5 Con el fin de discriminar entre diferentes especies y cepas ehrlichiales se han empleado PCRs múltiples. 8, 10 A pesar de la buena sensibilidad y especificidad general de estas técnicas moleculares, la falta de estandarización entre laboratorios y la posible existencia de resultados falsos negativos o falsos positivos, han llevado al Grupo de Estudio de Enfermedades Infecciosas del American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) a recomendar el empleo de la PCR en combinación con la serología para el diagnóstico de la EMC. 4 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO Una alternativa a los métodos diagnósticos que permiten una detección directa de E. canis son los métodos indirectos, que permiten determinar la exposición al agente mediante la valoración de la respuesta inmunitaria desarrollada por el hospedador. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la detección de anticuerpos IgG anti E. canis presenta una alta sensibilidad y especificidad y es considerada la técnica serológica de referencia para el diagnóstico de la EMC. 4, 5, 11 Para realizarla, por lo general se emplean como antígeno cultivos celulares infectados por E. canis, que se fijan a un porta especial para inmunofluorescencia al que se enfrentarán diluciones seriadas de la muestra sérica del perro sospechoso. Se ha observado que la sensibilidad de la IFI puede ser mayor empleando cepas de E. canis autóctonas. 12 A pesar de los buenos resultados de esta técnica se debe tener en cuenta que posee algunos inconvenientes, como la necesidad de aparataje específico y personal entrenado para reducir la subjetividad en la lectura de los resultados. Además de la IFI, se han desarrollado otras técnicas serológicas para el diagnóstico de la EMC. De hecho, en la actualidad existen kits inmunocromatográficos o de ELISA comercialmente disponibles que detectan anticuerpos IgG frente a este agente y que han permitido poner al alcance de los clínicos veterinarios métodos diagnósticos que pueden realizarse sin necesidad de equipo especial. 5 En función de los tests empleados, la sensibilidad y especificidad puede variar, considerándose en general estas técnicas muy sensibles, especialmente para títulos por IFI superiores a 1: Es importante tener en cuenta que el diagnóstico serológico de la EMC se complica por la existencia de reacciones cruzadas entre E. canis y otras especies de la familia Anaplasmataceae. E. canis no presenta reacción cruzada con Anaplasma platys, 30

33 pero sí con E. chaffeensis, E. ruminatium, E. ewingii, Neorickettsia helminthoeca, N. risticii y, en menor medida que con las anteriores, con A. phagocytophilum. 1, 4, 5 Por tanto, ante un resultado serológico positivo se debería valorar la posible exposición a estas especies bacterianas teniendo en cuenta el área geográfica de residencia del perro y su historial de viajes, ya que de las especies mencionadas, solamente se ha descrito la presencia en nuestro país de E. canis, A. phagocytophilum y A. platys. Algunos métodos serológicos han tratado de solventar este problema de especificidad mediante el empleo como antígeno de proteínas recombinantes inmunoreactivas específicas (como p28, p30, gp19, gp36, gp140, gp200 o MAP2, entre otras), en vez del organismo completo. 13, 14 El uso de estas proteínas recombinantes podría permitir no solo mejorar la especificidad, sino también incrementar la calidad del antígeno y eliminar la subjetividad, así como mejorar en algunos casos la sensibilidad en 14, 15 comparación con la IFI. Por otra parte, el Western immunoblot es una técnica serológica más específica que puede servir de ayuda a la hora de caracterizar el agente implicado en la infección, sobre todo si existen dudas derivadas de las posibles reacciones cruzadas ya descritas, 5, 16 aunque su laboriosidad hace que se emplee principalmente en laboratorios de investigación. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL La inespecificidad de los signos clínicos y alteraciones laboratoriales de la EMC hace que sea necesario contar con numerosas patologías al establecer el diagnóstico diferencial. En nuestro país probablemente la enfermedad con la que más frecuentemente se confunde la ehrlichiosis es la leishmaniosis, debido a la similitud de su sintomatología, si bien ambas enfermedades son fácilmente distinguibles con técnicas serológicas o moleculares. Otras enfermedades de transmisión vectorial, como por ejemplo babesiosis o hepatozoonosis, también deben ser tenidas en cuenta en el diagnóstico diferencial. La ehrlichiosis también debe diferenciarse de otras patologías, como el lupus eritematoso sistémico, el mieloma múltiple, la leucemia linfocítica crónica o la leptospirosis. Por otra parte, es importante destacar el hecho de que los perros con EMC frecuentemente presentan enfermedades concurrentes. BIBLIOGRAFÍA 1. Neer, T.M. & Harrus, S. Canine Monocytotrophic Ehrlichiosis (E. canis, E. chaffeensis, E. ruminantium, and N. risticii Infections). Ehrlichiosis, Neorickettsiosis, Anaplasmosis, and Wolbachia Infection. In: Infectious Diseases of the dog and cat, ed. C.E. Greene, Third edn, Saunders Elsevier

34 2. Harrus, S., Kass, P.H., Klement, E., Waner, T. Canine monocytic ehrlichiosis: a retrospective study of 100 cases, and an epidemiological investigation of prognostic indicators for the disease. Vet Rec, 1997; 141: Frank, J.R., Breitschwerdt, E.B. A retrospective study of ehrlichiosis in 62 dogs from North Carolina and Virginia. J Vet Intern Med, 1999; 13: Neer, T.M., Breitschwerdt, E.B., Greene, R.T., Lappin, M.R. Consensus statement on ehrlichial disease of small animals from the infectious disease study group of the ACVIM. American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med, 2002; 16: Harrus, S., Waner, T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): An overview. Vet J, 2011; 187: Mylonakis, M.E., Koutinas, A.F., Billinis, C., Leontides, L.S., Kontos, V., Papadopoulos, O., Rallis, T., Fytianou, A. Evaluation of cytology in the diagnosis of acute canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a comparison between five methods. Vet Microbiol, 2003; 91: Stich RW, Rikihisa Y, Ewing SA, Needham GR, Grover DL, Jittapalapong S. Detection of Ehrlichia canis in canine carrier blood and in individual experimentally infected ticks with a p30 based PCR assay. J Clin Microbiol, 2002; 40: Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, Bloch KC, Li P, Walker DH, McBride JW. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real time polymerase chain reaction of the dsb gene. J Mol Diagn, 2005; 7: Aguirre E, Tesouro MA, Amusategui I, Rodríguez Franco F, Sainz A. Comparison between different polymerase chain reaction methods for the diagnosis of Ehrlichia canis infection. Ann N Y Acad Sci, 2008; 1149: Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species pathogens in peripheral blood by real time reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Mol Diagn, 2005; 7: Waner, T., Harrus, S., Jongejan, F., Bark, H., Keysary, A., Cornelissen, A.W. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis", Vet Parasitol, 2001; 95: Aguirre E, Ayllón T, Sainz A, Amusategui I, Villaescusa A, Rodríguez Franco F, Tesouro MA. Results from an indirect fluorescent antibody test using three different strains of Ehrlichia canis. Vet J, 2009; 182: Knowles TT, Alleman AR, Sorenson HL, Marciano DC, Breitschwerdt EB, Harrus S, Barbet AF, Bélanger M. Characterization of the major antigenic protein 2 of Ehrlichia canis and Ehrlichia chaffeensis and its application for serodiagnosis of ehrlichiosis. Clin Diagn Lab Immunol, 2003; 10: Cárdenas, A.M., Doyle, C.K., Zhang, X., Nethery, K., Corttvet, R.E., Walker, D.H., McBride, J.W. Enzyme linked immunoabsorbent assay with conserved immunoreactive glycoproteins gp36 and gp19 has enhanced sensitivity and 32

35 provides species specific immunodiagnosis of Ehrlichia canis infection. Clin Vaccine Immunol, 2007; 14: McBride JW, Corstvet RE, Breitschwerdt EB, Walker DH. Immunodiagnosis of Ehrlichia canis infection with recombinant proteins. J Clin Microbiol, 2001; 39: Rikihisa, Y., Ewing, S.A., Fox, J.C. Western immunoblot analysis of Ehrlichia chaffeensis, E. canis, or E. ewingii infections in dogs and humans. J Clin Microbiol, 1994; 32:

36 O 10 DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES EN MUESTRAS DE ORIGEN ANIMAL POR PCR. Tomás Mayoral. Laboratorio de Genética Molecular LCV. MAGRAMA. La identificación de especies ha ido en las últimas décadas tomando importancia a medida que se han incrementado los controles en los procesos de producción. Más aun tras la aparición de diferentes crisis en el área de la salud pública como la encefalopatía espongiforme bovina o la aparición de ADN de caballo en productos cárnicos. De forma general, la identificación de especies se hace necesaria en múltiples aspectos de la vida cotidiana como pueden ser: El fraude resultante de la suplantación de especies por otras de menor valor. El control sobre la captura de animales, ya estén en peligro de extinción, con cuotas de caza/pesca establecidas o prohibiciones de captura hasta alcanzar una talla mínima. La protección del consumidor por salud o el respeto a determinados estilos de vida o religión. Identificación de muestras forenses y discriminación de la especie proveniente. Para muchos de estos casos, han existido hasta la actualidad, métodos de análisis bioquímicos e inmunológicos que han permitido estas tareas. No obstante, algunos de estos métodos pueden presentar falta de especificidad, especialmente con muestras complejas o tratadas con altas temperaturas. Frente a estos ensayos, las técnicas basadas en la amplificación de ADN por PCR han demostrando una alta sensibilidad y especificidad generando un considerable incremento de trabajos que describen la determinación de especies por métodos basados en ella. Actualmente, esta presenta grandes ventajas como son la rapidez, sencillez y la alta reproducibilidad, lo que permite estandarizar métodos que garantizan la homogeneidad de resultados entre diferentes laboratorios. En el presente trabajo, se realiza una revisión de métodos conocidos para la identificación de especies y se describe la experiencia en el Laboratorio Central de Veterinaria con las técnicas llevadas a cabo para la discriminación de rumiantes, carnívoros o especies de peces. 34

37 O 11 CONTROL DE IDENTIDAD EN ANIMALES DE EXPLOTACIÓN GANADERA MEDIANTE TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR. José Antonio Bouzada Dpto. Identificación Genética. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Establecer, de manera totalmente fiable, la identidad de los animales de explotación ganadera es una necesidad cuya importancia no ha parado de crecer en los últimos años. Esta necesidad se extiende tanto a los animales en estado vivo como después de su sacrificio y despiece así, como sus producciones. Esta importancia se debe a múltiples motivos como son el establecimiento de planes de mejora genética, planes de conservación de especies y/o razas en peligro de extinción, selección de apareamientos, confirmación de identidad en la venta de animales, trazabilidad de las produciones en la cadena alimentaria, certificación de denominaciones de origen o indicaciones geográficas protegidas, etc. Se hace mucho hincapié en el concepto de trazabilidad o rastreabilidad, es decir, en el conjunto de acciones, medidas y procedimientos técnicos que permiten identificar y hacer el seguimiento de un animal o producto desde su origen hasta el final de la cadena de comercialización. De ahí que el primer requisito de la trazabilidad sea la implementación de un sistema fiable de identificación animal. A lo largo del tiempo se han desarrollado y utilizado y siguen utilizando una gran variedad de sistemas de identificación individual como tatuajes, marcas de fuego, marcas de frío, crotales, chips electrónicos, bolos ruminales, transponders, la huella nasal, imágenes digitales de retina e iris, aunque todos los citados presentan una gran limitación como es la dificultad de su utilización en las cadenas de transformación o en el seguimiento de las producciones de los animales así identificados. Una buena solución a estas limitaciones la constituyen los marcadores moleculares, especialmente los basados en el ADN. Esta molécula está presente en prácticamente todas las células de todos los tejidos tanto de animales, como de los productos derivados de éste (carne, leche, semen, saliva, pelo, lana, plumas, etc), con la importante ventaja de que permanece prácticamente inmutable tanto durante la vida del animal como, una vez sacrificado éste, a lo largo de todo el proceso de comercialización de sus productos. 35

38 El principio de la identificación genética animal mediante marcadores moleculares se basa en que, con la excepción de los gemelos monocigóticos y los animales clonados, todos los individuos de una población difieren entre sí a nivel de su ADN (Cunningham y Meghen, 2001), siendo factible realizar una prueba genética para establecer estas diferencias (Lodish et al., 1995). La identificación de individuos en base a su ADN se ha desarrollado notablemente en las últimas décadas, tanto en medicina forense humana como en veterinaria. Existen diversas técnicas tales como el polimorfismo de tamaño en los fragmentos de restricción o RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism), la amplificación aleatoria de ADN polimórfico o RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados o AFLPs (Amplified fragment length polymorphisms), la técnica combinada de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction; PCR) y RFLP (PCR RFLP), los polimorfismos de conformación de las cadenas simples o SSCPs (Single Strand Conformation Polymorphisms), los polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), los minisatélites (VNTRs), los microsatélites (STRs), etc. Entre todos ellos, los microsatélites son, actualmente, la herramienta molecular de elección para el análisis genético y para estudios de identificación animal ya que poseen algunas características que los hacen muy útiles. Los microsatélites se encuentran en los genomas de todos los eucariotas y se ha descrito un elevado número de ellos en muchas especies de animales tanto domésticos, (entre ellas las principales especies de explotación ganadera, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, gallinas, etc), como especies de animales salvajes. Los microsatélites se distribuyen por todo el genoma de manera bastante uniforme, presentan una gran variabilidad genética, su modo de herencia es codominate simple, se pueden analizar mediante PCR multiplex, su análisis es relativamente rápido y para llevarlo a cabo se necesita muy poca cantidad de material biológico cuyo origen puede, además, ser muy diverso. En conjunto, estas características hacen que su análisis sea relativamente sencillo y que posean una gran capacidad de discriminación individual y de exclusión de relaciones de parentesco mal asignadas. A la hora de su análisis, hay que tener en cuenta que los microsatélites presentan una tasa de mutación que es relativamente elevada, varía entre 10 2 y 10 5 (Ellegren, 2004).), en algunos casos existen alelos silentes o de difícil amplificación que pueden afectar a algunas poblaciones concretas o estar muy ampliamente distribuídos, lo que lleva a una cierta heterogeneidad de los resultados sobre todo cuando se obtienen en diferentes laboratorios. Todo ello debe ser tenido en cuenta a la hora de interpretar los datos obtenidos. En concreto, los microsatélites son secuencias de ADN repetidas (entre 2 y 10 nucleótidos) en el genoma del animal, con secuencias conservadas a ambos lados lo que permite desarrollar técnicas de PCR para amplificarlos. Los más típicos constan de 36

39 10 30 copias de una repetición que usualmente no es superior a 4 pb de longitud (los más útiles suelen ser repeticiones de 2 nucleótidos y que no presenten alelos silentes ni inserciones o deleciones). Cada individuo tiene un número de repeticiones determinado del motivo de cada microsatélites. Ese número de repeticiones en cada marcador analizado caracterizará al individuo de manera que se pueda distinguir prácticamente de cualquier otro individuo aunque sea genealógicamente muy próximo. Además hay que tener en cuenta que, habitualmente, cada loci tiene dos alelos y necesariamente uno se habrá heredado de la madre y otro del padre. Por tanto, conociendo el perfil de microsatélites de uno o ambos progenitores se podrá determinar la paternidad. La presencia de tres o más alelos al analizar un microsatélite puede ser debida a la contaminación de la muestra, de forma accidental durante el análisis o de forma natural (freemartinismo o partos múltiples en general) o ser debida a la existencia de un número anormal de cromosomas. La determinación del perfil de microsatélites de un individuo, actualmente se realiza mediante PCR multiplex, lo que permite, usando dos parámetros, tamaño del fragmento amplificado y marcajes fluorescentes, realizar numerosas reacciones de amplificación simultáneamente y así disminuir el coste del análisis. Los resultados se visualizan en secuenciadores automáticos mediante electroforesis capilar de fragmentos marcados y posteriormente con programas informáticos se pueden interpretar los resultados. El resultado de dichas técnicas se muestra como un electroferograma comparado con el patrón de tamaño. Existe una gran cantidad de marcadores de tipo microsatélite descritos en las principales especies de explotación ganadera. La International Society for Animal Genetics (ISAG) y la Food and Agriculture Organization (FAO) llevan años intentando homogeneizar tanto los marcadores utilizados en cada especie como la denominación de los distintos alelos obtenidos, muy importante a la hora de compartir información de individuos analizados en laboratorios diferentes, algo que es muy habitual especialmente en las especies bovina y equina. Actualmente, en algunas especies, existen paneles de marcadores totalmente definidos, cuyo análisis se recomienda en todos laboratorios, mientras que en otras simplemente hay descritos una serie de marcadores de los cuales se recomienda analizar al menos de ellos. Los paneles de marcadores recomendados actualmente por la ISAG y la FAO para las principales especies de explotación ganadera son los siguientes: Bovinos (12 marcadores): BM1818, BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, INRA23, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126 y TGLA