Validación del Test de Zona como método de diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano

Transcripción

1 Validación del Test de Zona como método de diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano GONZALES A., Ana Rosa 1 CORTEZ G., Jacqueline 2 OLIVARES P., Jorge 3 RIOS C., Eddy 4 ORDOÑEZ J., Justina 5 1 Investigadora Adscrita Instituto de Genética 2 Docente Investigadora Instituto de Genética 3 Docente Emérito, UMSA, Master en Genética 4 Director IINSAD - UMSA 5 Directora Lab. Gen y Vida Instituto de Genética, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Andrés, Casilla 10080, La Paz - Bolivia PALABRAS CLAVES: Test Diagnóstico, Test de Zona, Capacidad fecundante, Infertilidad masculina. RESUMEN Los ensayos de unión del espermatozoide a la zona pelúcida del ovocito humano, evalúan la etapa crucial de la interacción espermatozoide-ovocito que lleva a la fecundación. utilizan ovocitos recuperados del tejido ovárico cadavérico y/o de ovarios obtenidos quirúrgicamente. Uno de los ensayos más comunes de unión, es el Test de Zona o ensayo con zonas pelúcidas intactas. El propósito de este trabajo fue validar el Test de Zona como método de diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano en pacientes con problemas de infertilidad, determinar su sensibilidad y especificidad. Identificar los valores predictivos y razones de verosimilitud y por último correlacionar el Test de Zona con otras pruebas de fertilidad in vitro. El diseño de investigación utilizado fue el Test Diagnóstico. Se estudiaron 22 pacientes infértiles y 22 fértiles de acuerdo a cálculo de tamaño muestral. Se obtuvo resultados de sensibilidad y especificidad (100% y 95.70% respectivamente), valores predictivos positivo y negativo (85.70% y 100% respectivamente), razones de verosimilitud positivo de 23% de la unión espermatozoide-zona pelúcida, mostrando una curva ROC con puntaje de 50 como el óptimo. Además se realizó un análisis de asociación, observando una correlación altamente significativa del Test de Zona con: 1) la morfología del espermatozoide normal según criterio estricto de Kruger (r = y un p = 0.01); 2) la reacción acrosómica (r= y un p = 0.01), 3) madurez espermática (r = y p = 0.01), 4) motilidad espermática (r = y un p = 0.01) y 5) test hipoosmótico (r = y un p = 0.01). Se validó el Test de Zona como método confiable de diagnóstico, se determinó que el Test de Zona es altamente sensible y espécifico. Los valores predictivos positivo y negativo y las razones de verosimilitud del Test de Zona indicaron que tienen la capacidad de discriminar los pacientes verdaderamente fértiles de los infértiles. Los resultados de correlación entre los diversos parámetros seminólogicos (motilidad y morfología normal) mostraron una concordancia notable con el Test de Zona, demostrando la solidez de los estudios, la coherencia del Test de Zona con el Gold Estándar, y la importancia de estos para la fecundación. La reacción acrósomica, madurez espermática y test hipoosmótico Vol. IX - Diciembre de 2001 BIOFARBO - (5)

2 GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ presentaron índices de correlación altos con el Test de Zona, mostrando su capacidad para evaluar la unión espermatozoide-ovocito. Esto predice que los espermatozoides para unirse a la zona pelúcida deben ser morfológicamente buenos, con acrosoma indemne, con madurez espermática y membrana plasmática intacta. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se concluyó que el Test de Zona puede ser utilizado como método de diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano en pacientes con problemas de infertilidad. ABSTRACT The assays to sperms-zona pellucida binding to human oocytes, tested the crucial stage of sperm-oocytes interaction, that leads to the fecundation. It is evaluated by using human oocytes recovered from cadaveric ovarie tissue or ovaries obtain quirurgically. One of the most common assays of binding, is the Zone Test or assay with intact pellucid zones. The porpouse of this work was to validate the Zona Test as a diagnosis method for the fecunding capacity of the human sperm in patients with fertility problems. Determine it s sensitivity and especificity. To identify it s predictive values and likely rates and the lats one, looking for a correlation between Zone Test and other fertility test in vitro. The investigation desing was: Diagnosis Test. The study group consisted was, 22 infertile and 22 fertile patients, according to the calculated sample size. The sensitivity and especifity values obtained were 100% and 95.70% respectivelly. The positive and negative predictive values were 85.70% and 100% respectivelly. The positive likely rates of the binding sperm-pellucid zone show a ROC curve with a 50 mark as the optimum. Also was made an association analysis, observing a highly significative correlation between the Zone Test with: 1) the normal sperm morphology according to the Kruger s strict criteria (r= and a p= 0.01), 2) the acrosome reaction (r= and a p= 0.01), 3) sperm maturity (r= and a p= 0.01), 4) sperm motility (r= and a p= 0.01) and 5) hipoosmotic test (r= and a p= 0.01). The Zone Test was validated as a thrusteable method of diagnosis. It was determine that the Zone Test is highly sensitive and especific. The predictive positive and negative values and the likely rates of the Zone Test showed its capacity to differenciate the real infertile patients of the fertile. The correlation results between the different semminological parameters (motility and normal morphology) showed a high concordation with the Zone Test, showing the strenght of the study and the test coherence with the gold standard; and their importance for fecundation. The acrosomic reaction, sperm maturity and hipoosmotic test presented high correlation rates with the Zone Test, showing its capacity for evaluate the oocytesperm binding. These correlation predicts that the sperm for binding with pelucid zone have to be morphologically goods, with onwurt acrosome, spermatic maturity and plasmatic membrane entire. According to the results obtain in the present work, it is conclude that the Zone Test can be used as a diagnosis method of the fecundation capacity of the human sperm in patients with fertility problems. INTRODUCCION La Reproducción Humana constituye una función fisiológica e indispensable para el mantenimiento de la especie (Comparato M., 1983), y dentro de este amplio campo, la infertilidad es una de las áreas que concita más interés, las causas son diversas por lo que se requiere de un estudio meticuloso y profundo para identificarlas. Muchas de las cuales aún son completamente desconocidas, y han de requerir el desarrollo de las tecnologías, mediante la elaboración de métodos que faciliten el descubrimiento de éstos factores etiológicos. La mayoría de los trabajos de investigación han concluido que, aproximadamente el 46.5% de la infertilidad conyugal se debe a un factor de origen masculino (OMS, 1992). Por esto, el rápido avance que ha ocurrido en el campo de la andrología durante los últimos años ha hecho necesario el desarrollo de nuevas metodologías que permitan evaluar de un modo más objetivo la calidad y capacidad de fecundación del espermatozoide humano. La habilidad del espermatozoide humano de fecundar a un ovocito depende de la estructura del espermatozoide, la calidad de la motilidad espermática, de la capacitación y reacción acrosómica. La alta incidencia de infertilidad causada por el tan llamado factor masculino, promovió una intensa investigación para predecir seriamente el potencial fecundante del espermatozoide humano tanto in vivo como in vitro. En este intento, la unión estrecha del espermatozoide a la zona pelúcida (ZP) es un evento crucial en la interacción gamética que lleva a la fecundación. Esta etapa de unión o binding puede proveer una información única predictiva del potencial fecundante del espermatozoide humano. Los ensayos de unión del espermatozoide a la zona pelúcida (ZP) evalúan principalmente, la etapa crucial de la interacción espermatozoide-ovocito que lleva a la fecundación, los investigadores Yanagimachi (1981); Overstreet y Hembree (1976), fueron los primeros en proponer un ensayo para evaluar la penetración de la ZP por espermatozoides humanos usando ovocitos recuperados de ovarios cadavéricos. Los dos ensayos más comunes de unión a la zona más corrientemente utilizados son: el Test de Hemizona (HZA) y el test de Zona (ZA) (Burkman y col., 1992). Ambos bioensayos tienen ventaja de proveer una prueba funcional homóloga para la unión del espermatozoide a la zona comparando poblaciones de espermatozoides fértiles e infértiles en el mismo ensayo. (6) - BIOFARBO Vol. IX - Diciembre de 2001

3 VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO Por tanto, estos bioensayos, pueden llegar a ser una herramienta experimental muy útil y valiosa para el análisis fisiológico y celular de los eventos que llevan a la fecundación y desarrollo pre-embrionario, primordialmente en aquellos pacientes en los que se sospecha de desórdenes en su fertilidad. El HZA y el ZA han probado ser altamente predictivos de un resultado de fecundación in vitro (FIV) (Oehninger y col., 1989), inicialmente desarrollados como un test para investigar infertilidad masculina y predecir el potencial fecundante, también está siendo usado para evaluar la función espermática después de un tratamiento contraceptivo (Burkman, 1988; Oehninger y col., 1991). Se ha establecido que parámetros como la morfología, la motilidad, reacción acrosómica, maduración espermática de los espermatozoides, serían de gran utilidad para esclarecer las posibles causas de infertilidad de origen masculino, así como para el éxito de los bioensayos. En nuestro país se hace necesario desarrollar modelos y técnicas actualizadas que redunden en el mejoramiento de los procedimientos convencionales del estudio y diagnóstico, que permitan así un mejor manejo de la infertilidad conyugal. Es así que, ensayos de este tipo se hacen necesarios implementar en nuestro medio para poder utilizarlos como métodos predictivos del potencial fecundante del espermatozoide humano, especialmente en aquellos pacientes infértiles que serán sometidos a pruebas de Reproducción Asistida como la inseminación artificial (IA), fecundación in vitro (FIV), transferencia intratubaría de gametos (GIFT), etc., cuya información será altamente beneficiosa para asegurar el éxito de dicha intervención. METODOLOGÍA DISEÑO DE INVESTIGACIÓN: Test Diagnóstico (Greenberg R., y col.,1998). TAMAÑO MUESTRAL El número total de pacientes estudiados fue de 44 (22 pacientes infértiles y 22 controles). El número de pacientes fue calculado de acuerdo a niveles prefijados de sensibilidad y de especificidad mínimos, y calculados en el programa Epi info DEFINICIONES Los Casos fueron definidos como aquellos pacientes que requieran un exámen de diagnóstico en infertilidad. Los Controles fueron definidos como aquellos pacientes que hayan embarazado a una mujer hasta dos años, que sean elegibles de acuerdo a los criterios de exclusión e inclusión. CRITERIOS DE ELEGIBILIDAD Casos: De Inclusión: Varones que acudieron a la consulta por problemas de infertilidad Vol. IX - Diciembre de 2001 De Exclusión: Varones fértiles, Varones con problemas de enfermedades de transmisión sexual (ETS),Varones con tratamiento de antibióticos Controles: De inclusión: Varones con mujeres embarazadas de 3 meses hasta individuos padres de niños antes de los dos años, que tienen parámetros de semen que caen dentro los rangos normales: Motilidad espermática grados II y III mayor a 50%; concentración espermática mayor a 20 millones spz/ml; morfología espermática normal mayor a 14 % de acuerdo al criterio estricto de Kruger. De Exclusión: Varones con problemas de infertilidad, Varones con problemas de ETS, Individuos con hijos mayores a los 2 años, Varones con tratamiento de antibióticos ESCALAS DE MEDICION Variable resultado: Prueba de oro o Gold Estándar que fue definida de acuerdo a los siguientes criterios: Pacientes con una mujer embarazada de 3 meses hasta hijos de 2 años clasificados como varones fértiles, que tuvieron parámetros seminológicos dentro del rango normal: motilidad espermática, grados III y II mayor a 50%; concentración espermática mayor a 20 millones de espermatozoides/ml; y morfología espermática normal mayor a 14% de acuerdo al criterio estricto de Kruger (Kruger TF, 1986 ). Variable predictora: Test de Zona, que considera como positivo a la unión de 50 o más espermatozoides a la zona pelúcida, y negativo a la unión menor a 50 espermatozoides a la zona pelúcida. Se determinó fertilidad como el grupo de pacientes tanto fértiles como infértiles. MATERIAL BIOLÓGICO Obtención de los ovocitos humanos cadavéricos Los ovocitos empleados fueron proporcionados por el Laboratorio de Reproducción y Desarrollo de la Universidad Católica de Chile. Los ovocitos se descongelaron y lavaron en medio Ham F 10 que contenía BSA 0.4 % (p/v) junto a un suave pipeteo para quitarles las células del cúmulo. Una vez lavados se emplearon para montar el Test de Zona. Obtención del Líquido Seminal El semen fue obtenido por masturbación después de un periodo de abstinencia sexual de 3 a 5 días, para luego ser utilizado en el Test de Zona y las otras pruebas in vitro. MÉTODOS A los 44 pacientes (fértiles e infértiles) se les realizó las pruebas de: Seminograma Completo, Test de Zona, Reacción Acrosómica, Test Hipoosmótico, y Madurez Espermática. BIOFARBO - (7)

4 GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ Seminograma Completo Se realizó el seminograma completo de acuerdo a parámetros establecidos por la OMS (1992), el estudio de la morfología se realizó de acuerdo al criterio estricto de Kruger, este método se basa en criterios muy estrictos, es decir cualquier pequeña anomalía convierte al espermatozoide en morfológicamente anormal, con lo que el valor mínimo de espermatozoides normales para considerar una muestra morfológicamente adecuada es tan solo del 14 %, en comparación con el 30% o más que definen los otros métodos convencionales de análisis morfológicos (OMS, 1992). Luego de realizar el Seminograma, se procedió al lavado de la muestra de semen por los métodos de percoll y swim up para separar la fracción de espermatozoides mótiles de los no mótiles y demás componentes celulares del líquido seminal. Después se utilizó la fracción mótil de espermatozoides para aplicar en el Test de Zona, y las demás pruebas de fertilidad in vitro: reacción acrosómica, test hipoosmótico, madurez espermática, además de la morfología y motilidad. Pruebas de Fertilidad In Vitro Test de Zona (Overstreet 1976 actualizado por Burkman LJ. y col.,1988) Una vez lavados los ovocitos utilizados para este Test fueron primeramente evaluados al microscopio y confirmando que se encuentran en Metafase II, se dejaron en medio Ham F 10 más 0.4% de albúmina sérica humana (HSA) toda la noche en una microgota debajo aceite mineral, a 37 0 C en 5% CO 2. Al día siguiente se procesó primero la muestra seminal realizando un lavado de percoll y swim up ajustando a espermatozoides mótiles/ml ( a espermatozoides motiles/ml x ovocito), 50 ul de este fue colocada bajo aceite mineral. Luego a esta gota de espermatozoides se colocó un ovocito y se procedió a coincubar los gametos a 37 0 C. en 5% de CO 2 durante 4 horas (Franken y col. 1986), luego de ese tiempo se lavaron en medio Ham F10 + HSA pipeteando vigorosamente para remover los espermatozoides unidos inespecíficamente, durante 4 a 5 veces, para luego ser llevados a un portaobjetos cubriéndolo con un cubreobjeto. El número de espermatozoides unidos a la zona pelúcida se determinó usando microscopía de contraste de fases. Los espermatozoides deben ser capaces de unirse a la zona pelúcida, atravesarla y llegar al espacio perivitelino antes de unirse a la membrana plasmática del ovocito. Se considera Test de Zona positivo a la unión de 50 o más espermatozoides a la zona pelúcida (Vigil y cols., 1993). Para las Pruebas de 1) la Reacción Acrosómica (RA), se realizó según Talbot y Chacon, modificada por M. Riffo, Universidad de Chile, 1992; 2) la Hinchazón de los Espermatozoides en Medio Hipoosmótico (HOS), según Jeyendran, R.S. y col., 1984, 3) Madurez Espermática según Terquen y Dadoune, RESULTADOS TEST DIAGNOSTICO Fertilidad vs. Gold Estándar VALORES TABLA No. 1 En la comparación de la Fertilidad vs. el Gold Estándar (Tabla Nº 1) el valor de sensibilidad obtenido muestra que el 90.48% de los pacientes infértiles tienen infertilidad verdadera confirmado con el valor predictivo positivo VP(+) que nos indica que del total de pacientes infértiles 86.4% en realidad son infértiles y el índice de verosimilitud positivo que existe una probabilidad de 6.9 veces que la prueba detecte pacientes verdaderamente infértiles. Mientras que la especificidad (Tabla Nº 1) nos indica que el 87% de pacientes fértiles dieron resultados negativos para infertilidad, confirmado con el valor predictivo negativo VP (-) que nos indica que el 91% de los pacientes con resultados negativos para la infertilidad verdaderamente son fértiles, respaldado con el índice de verosimilitud negativo(-) que nos indica que 0.1 veces es más probable que la prueba resulte negativa en pacientes fértiles. Fertilidad vs. Test de Zona PORCENTAJE IC 95% Sensibilidad ( ) Especificidad ( ) Valor predictivo (+) ( ) Valor predictivo (-) ( ) Razón de probabilidad (+)* 6.90 ( ) Razón de probabilidad (-)* 0.10 ( ) * o índice de verosimilitud En la comparación del Estado de Fertilidad vs. Test de Zona (Tabla Nº 2) el valor de sensibilidad obtenido indicó que el 100% de los pacientes con la enfermedad (infértiles) tuvieron una prueba positiva para la infertilidad por lo tanto, test de zona negativo (-) confirmado con el valor predictivo positivo(+) que nos muestra que del total de pacientes infértiles el 95.5% verdaderamente son infértiles y el índice de verosimilitud o razón de probabilidad positiva (+) nos muestra que existe una probabilidad de 23 veces más que VALORES TABLA No. 2 PORCENTAJE IC 95% Sensibilidad ( ) Especificidad ( ) Valor predictivo (+) ( ) Valor predictivo (-) ( ) Razón de probabilidad (+)* ( ) Razón de probabilidad (-)* - - * o índice de verosimilitud (8) - BIOFARBO Vol. IX - Diciembre de 2001

5 VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO la prueba detecte pacientes infértiles en aquellos verdaderamente infértiles. Mientras que la especificidad (Tabla Nº 2) nos indica que el 95.7% de pacientes fértiles tuvieron resultados negativos en la prueba de infertilidad, es decir un Test de Zona positivo(+), confirmado con el valor predictivo negativo (-), que nos indica que el 100% de los pacientes con resultados negativos para la infertilidad o sea Test de Zona positivo (+), verdaderamente son pacientes fértiles y no infértiles. TEST DE ZONA TEST DE ZONA POSITIVO nos indica que efectivamente el 85.7% de los pacientes infértiles realmente son infértiles y el índice de verosimilitud o razón de probabilidad positiva (+), que 8.3 veces es más probable que la prueba detecte pacientes infértiles en aquellos verdaderamente infértiles. La especificidad, muestra que el 88% de los pacientes fértiles nos dieron resultados negativos (-) en la prueba para la infertilidad, es decir, Test de Zona positivo (+) (Fig. Nº 1), confirmado con el valor predictivo negativo (-) que nos indica que el 100% de los pacientes fértiles con Test de Zona positivo (+) en verdad son fértiles. TABLA No. 3 VALORES PORCENTAJE IC 95% Sensibilidad ( ) Especificidad ( ) Valor predictivo (+) ( ) Valor predictivo (-) ( ) Razón de probabilidad (+)* 8.30 ( ) Razón de probabilidad (-)* - - * o índice de verosimilitud Determinación de los Puntos de Corte Curva ROC GRAFICO Nº 1 Figura Nº 1. Unión de espermatozoides humanos a la zona pelúcida mayor a 5 (Fuente propia) TEST DE ZONA NEGATIVO14 Se muestra los mejores puntos de corte de 40 y 50 con respecto a la sensibilidad y especificidad del Test de Zona. Valores Predictivos de los Puntos de Corte TABLA No. 4 VALORES Figura Nº 2. Unión de espermatozoides humanos a la zona pelúcida menor a 50 (Fuente propia) Gold Estándar vs. Test de Zona Comparando Gold Estándar vs. Test de Zona (Tabla Nº 2), el valor obtenido para la sensibilidad muestra que el 100% de los pacientes infértiles tuvieron prueba positiva (+) para infertilidad, es decir Test de Zona negativo (-) (Fig. Nº 2) confirmado con el valor predictivo positivo VP(+) que Vol. IX - Diciembre de 2001 Sensibilidad 87.17% 90.48% Especificidad 88.00% 88.00% Valor predictivo positivo VP(+) Valor predictivo negativo VP(-) Razón de probabilidad positivo Razón de probabilidad negativo De los 2 puntos de corte (40 y 50) que muestra la curva ROC, se escogió como el mejor, el punto 50, ya que se aumenta tanto la sensibilidad de 89.47% a 90.48% y la especificidad de 86.96%. BIOFARBO - (9)

6 GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ ANÁLISIS DE CORRELACIÓN DEL TEST DE ZONA CON OTRAS PRUEBAS IN VITRO Correlación entre el Test de Zona y la Reacción Acrosómica GRÁFICO Nº 2 GRÁFICO Nº 3 En la figura Nº 4 se observa la prueba de madurez espermática. Se observa que existe una correlación negativa r = entre el Test de Zona y la Reacción Acrosómica (RA) dando un p = 0.01 estadísticamente significactivo en la prueba de Spearman.(Steel R., y col. 1992). Resultados que muestran que a mayor número de espermatozoides reaccionados menor unión a la Zona Pelúcida del ovocito y existe mayor cantidad de espermatozoides unidos a la zona pelúcida cuando se detecta menor grado de reación acrosómica. La prueba de la reacción acrosómica se observa en las figuras Nº 3. Figura Nº 3: Prueba de la Reacción Acrosómica Figura Nº 4: Prueba de la Madurez espermática Ÿ * Ÿ Espermatozoides inmaduros Espermatozoides maduros Tinción Anilina Blue. 100X (Fuente propia) * Correlación entre el Test de Zona y la Morfología espermática GRÁFICO Nº 4 a) espermatozoide vivo con acrosoma intacto. b) espermatozoide vivo con acrosoma reaccionado Triple tinción de Talbot y Chacón Modif. 100X (Fuente propia) Correlación entre el Test de Zona y la Madurez espermática Se observa que existe una correlación positiva r = entre el Test de Zona y la Madurez Espermática dando un p = 0.01 estadísticamente significativo para la prueba de Spearman.(Steel R, y col., 1992). Resultados que muestran que a mayor número de espermatozoides maduros mayor unión a la Zona Pelúcida del ovocito. No observándose unión de espermatozoides inmaduros a la zona pelúcida. Se puede observar que existe correlación positiva r = entre el Test de Zona y Morfología Espermática Normal dando un valor p = 0.01 estadísticamente significativo en la prueba de Spearman.(Steel R, y col.,1992). Resultados que muestran que a mayor número de espermatozoides morfológicamente normales mayor unión de los mismos a la Zona Pelúcida del ovocito. (10) - BIOFARBO Vol. IX - Diciembre de 2001

7 VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO La figura Nº 5 nos muestra el resultado de la prueba de morfología espermática. Figura Nº 5: Morfología espermática de Spearman.(Steel R, y col.,1992). Resultados que muestran que a mayor número de espermatozoides con una membrana plasmática íntegra, mayor unión a la Zona Pelúcida del ovocito. > ==> > GRÁFICO Nº 6 En la figura Nº 6 se observa los resultados del Test hipoosmótico. > ==> : Espermatozoides con morfología anormal : Espermatozoides con morfología normal Tinción Giemsa.100X (Fuente propia) Figura Nº 6: Test Hipoosmótico (TH) TH Positivo TH Negativo Correlación entre el Test de Zona y la Motilidad espermática GRÁFICO Nº 5 A: Spz con membrana B: Spz con membrana plasmática íntegra plasmática no íntegra (Fuente propia) (Fuente propia) Se observa que existe una correlación positiva r = entre el Test de Zona y la Motilidad Espermática dando un valor p = 0.01 estadísticamente significativo en la prueba de Spearman.(Steel R, y col., 1992). Resultados que muestran que a mayor número de espermatozoides mótiles (grado III y II) mayor unión a la Zona Pelúcida del ovocito. Correlación entre el Test de Zona y el Test Hipoosmótico Se observa que existe una correlación positiva r = entre el Test de Zona y el Test Hipoosmótico dando un valor p = 0.01 estadísticamente significativo en la prueba Vol. IX - Diciembre de 2001 DISCUSION Ante la disyuntiva de aumentar el número de pruebas o escoger una sola prueba para diagnosticar pacientes con problemas de infertilidad, abaratando los costos, es que se planteó el Test Diagnóstico para establecer si la prueba del Test de Zona verdaderamente sirve para diagnosticar la capacidad fecundante del espermatozoide humano en pacientes infértiles. Las pruebas estadísticas del Test Diagnóstico nos da la probabilidad estimada de discriminar a los pacientes infértiles de los fértiles, y poder predecir la capacidad fecundante del espermatozoide humano con el Test de Zona. La zona pelúcida constituye un sitio crítico en la interacción gamética durante las etapas tempranas de la fecundación y, por lo tanto, la unión del espermatozoide a la zona es un requisito esencial del proceso de fecundación. Para que el espermatozoide sea capaz de atravezar la zona pelúcida in vitro deberá previamente haber experimentado el proceso de capacitación, exibir movilidad hiperactivada, poseer receptores que le permitan unirse a la zona y experimentar la reacción acrosómica. Dado que la zona BIOFARBO - (11)

8 GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ pelúcida cumple un rol esencial en la interacción gamética, la falta de unión de los espermatozoides a la zona y/o su incapacidad para penetrarla se asocia a ciertas causas de infertilidad masculina (Smith R., 1992) Aún cuando en los programas de FIV-TE es posible recuperar un número apreciable de ovocitos maduros in vivo, estos ovocitos son escasos para ser usados de rutina en la evaluación de la capacidad fecundante, lo cuál obliga a buscar otras fuentes de ovocitos que cumplan este propósito. Por otra parte, el utilizar ovocitos frescos es objetable desde el punto de vista ético. Las zonas pelúcidas utilizadas en los Test de Zona en humano pueden ser colectadas de ovocitos, obtenidos por aspiración folicular en programas de FIV-TE, estos ovocitos son almacenados en soluciones salinas hipertónicas o criopreservadas. Este tipo de tratamiento mata al ovocito y, por lo tanto, el ovocito es incapaz de llevar a cabo los mecanismos de bloqueo a la polizoospermia, con lo cuál serán varios los espermatozoides que podrán unirse y atravesar la zona alcanzando el espacio perivitelino. En contraste, el Test de Zona en ovocitos humanos no viables no permite evaluar otros aspectos esenciales de la capacidad fecundante del espermatozoide, tales como la fusión con la membrana plasmática del ovocito y la decondensación de la cromatina en el citoplasma ovular. Estas características pueden ser estudiadas utilizando el test de penetración de ovocitos de hamster. El Test de Hamster y el Test de Zona evalúan aspectos diferentes aunque complementarios de la función espermática (Smith R., 1992). Estudios realizados con el objeto de determinar la utilidad de este bioensayo (Test de Zona) como predictor de la fertilización in vitro humana señalan que la penetración de los espermatozoides al espacio perivitelino puede predecir los resultados de la FIV en el 90% de los casos estudiados, el 10% de falsos negativos observados (bioensayo (-) y fertilización (+)) puede ser atribuible a la variabilidad en la calidad de los ovocitos utilizados. Por otra parte, no se encontró una correlación significativa entre el número de espermatozoides unidos a la zona y la presencia de espermatozoides en el espacio perivitelino. En este ensayo, la ausencia de espermatozoides en el espacio perivitelino es indicativo de alteraciones a nivel de la capacitación, reacción del acrosoma o efectividad de las enzimas intraacrosomales. El reconocimiento entre el espermatozoide y la zona pelúcida es un acontecimiento específico de gran importancia que inicia una cascada de interacciones que culminan con la fecundación del ovocito. La especificidad de esta interacción es extremadamente importante y para que exista ésta, el espermatozoide ha producido receptores de superficie que solamente se unirán a una proteína de la zona pelúcida, la ZP3. A pesar de lo conservada que está la secuencia de péptidos de la molécula de ZP3, la unión de la zona pelúcida con el espermatozoide es un proceso muy específico. La cuantificación de la habilidad que presenta el espermatozoide humano para unirse a la zona pelúcida debe dar una indicación de su capacidad fecundante, al menos in vitro (Thomas P y Meizel S.,1986). El uso de este sistema de diagnóstico ha sido posible gracias al descubrimiento de que la capacidad de unir espermatozoides a la zona pelúcida humana se puede preservar indefinidamente, si los ovocitos se conservan en una solución altamente salina que contenga cloruro de magnesio 1.5 M y 0.1% de dextrano (Osman RA., y col., 1989, citado por Gomez E., y col., 1997). Como consecuencia de este descubrimiento es posible almacenar los ovocitos no fecundados del programa de fecundación in vitro (FIV), y reutilizarlos con fines diagnósticos para estudiar la competencia fucional de los espermatozoides de los pacientes. La habilidad de los espermatozoides humanos para fertilizar el ovocito es dependiente de la estructura del esperma, de la calidad del esperma, motilidad y capacitación. La elevada incidencia de la infertilidad humana causada por el así llamado factor masculino ha promovido una intensa búsqueda para una exacta causa para predecir el potencial fértil del espermatozoide humano in vivo e in vitro. El ensayo humano óptimo podía utilizar idealmente ovocitos humanos fertilizados vivos. Razones éticas, como fuese, previenen a los científicos y médicos para realizar una contribución al diagnóstico funcional directo (Overstreet, 1976). Como fuere ensayos de pronóstico exactos y de discriminación son necesarios para determinar que hombres infértiles son los probables para ejecutarles fertilización in vitro o in vivo. De acuerdo al resultado obtenido en la Tabla Nº 1 de comparación entre la prueba de la Fertilidad vs. Gold Estándar podemos observar que los parámetros considerados (Gold Estándar) son capaces de discriminar el 90% de los pacientes infértiles y el 87.5% de los fértiles habiendo un 10 y 13% de falsos positivos y falsos negativos respectivamente, esto podría deberse a que la espermatogénesis tiene una duración de 72 días, lo que significa que cada 72 días los parámetros seminológicos podrían variar en cada ciclo de división celular; por otro lado, si bien el estado de embarazo de la pareja es el parámetro más fidedigno de un paciente fértil, el tiempo transcurrido de un embarazo a otro también podría cambiar los parámetros de fertilidad. De ahí que es importante validar el Test de Zona como una de las pruebas más específicas para evaluar la capacidad fecundante del espermatozoide humano y diagnosticar a los pacientes verdaderamente infértiles. A diferencia de las pruebas rutinarias de los parámetros seminológicos, el Test de Zona, tiene la característica particular de permitir la visualización de los espermatozoides que efectivamente se unen a la zona pelúcida de los ovocitos, (Figs. Nº 1 y 2), donde se puede observar un Test de Zona positivo y Test de Zona negativo, de ahí su (12) - BIOFARBO Vol. IX - Diciembre de 2001

9 VALIDACION DEL TEST DE ZONA COMO METODO DE DIAGNOSTICO significación clínica es determinante a la hora de decidir si un paciente es fértil o infértil, además, por estas connotaciones es ampliamente utilizada en programas de Reproducción Asistida de alta complejidad como la Fertilización in vitro (FIV), Inyección intracitoplasmática (ICSI), etc. Como se muestra en la Tabla Nº 2 y las Figs. 1 y 2; utilizando el Test de Zona se pudo constatar que esta prueba es capaz de detectar el 100% de los pacientes infértiles y aproximadamente el 96% de pacientes fértiles, por lo tanto, esta prueba resultó ser de mayor sensibilidad y especificidad en relación al Gold Estandar debido a explicaciones anteriormente citadas, sin embargo, el Test de Zona aún no es capaz de discriminar aproximadamente un 4% de pacientes fértiles, porcentaje mínimo poco significativo. Estos resultados fueron similares a los encontrados por Morales P. (1999), con un 94.1% de sensibilidad y 100% de especificidad, donde en el estudio que realizaron, los espermatozoides de los 42 pacientes fueron capaces de penetrar al espacio perivitelino del ovocito cadavérico así como del ovocito humano fertilizado in vitro. En 3 individuos no existió penetración en el espacio perivitelino del ovocito cadavérico y no se detectó fertilización in vitro. Solo 2 pacientes fueron capaces de fertilizar a los ovocitos normales sin haber podido penetrar en el ovocito cadavérico, determinando de esta manera el valor predictivo de la penetración del espermatozoide en el espacio perivitelino del ovocito cadavérico humano en el resultado de la fertilización in vitro. De acuerdo a estos resultados sugiere que la penetración espermatozoidezona pelúcida es un bioensayo útil para predecir el potencial de fertilidad masculina en una fertilización in vitro. De acuerdo a la Tabla Nº 3 de comparación del Gold Estandar con relación al Test de Zona, se pudo verificar que utilizando ambas pruebas, discriminan al 100% de pacientes infértiles, por lo tanto, aumenta la sensibilidad en desmedro de la especificidad, lo que no tiene mayor importancia debido a que muestra un valor clínicamente aceptable para todas las pruebas. Los resultados obtenidos en las Tablas Nº 2 y 3, con la prueba del Test Diagnóstico, muestran que el Test de Zona es capaz de mostrar la capacidad fecundante del espermatozoide humano en forma estadística significativa, indicándonos que a una disminución en la capacidad de unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, implica la causa principal de falta de fertilización en ciertos pacientes que tienen problemas de infertilidad masculina, por lo tanto, nos dan una información fisiopatológica muy útil de la interacción espermatozoide-zona pelúcida. Los datos de las Tablas Nº 1, 2 y 3 nos muestran que los valores resultantes de sensibilidad elevada (90.48, 100 y 100% respectivamente) son clínicamente útiles para diagnosticar infertilidad, que como dijimos anteriormente son confirmados con el cálculo de los valores predictivos Vol. IX - Diciembre de 2001 positivos (86.4, 95.5 y 85.7% respectivamente) y las razones de probabilidad positiva ( 6.9, 23 y 8.3 respectivamente), los cuales nos orientan de manera directa a la estimación de la probabilidad de la infertilidad. Por el contrario, los valores de especificidad resultantes en el presente trabajo (87, 95.7 y 88% respectivamente), también dieron porcentajes de probabilidad elevados, que significa que las personas fértiles (sin la enfermedad) se diagnostiquen; confirmado con los valores predictivos negativos (91, 100 y 100% respectivamente), y con las razones de probabilidad negativa (0.1, 0 y 0 respectivamente); por lo tanto, estos parámetros estadísticos permiten diagnosticar a las personas que son efectivamente fértiles. La curva ROC para el Test de Zona (Gráfico Nº 1) mostró el puntaje de 50 como óptimo, de acuerdo a los porcentajes de sensibilidad y especificidad, de esta manera podemos clasificar como paciente fértil o Test de Zona positivo a la unión de 50 o más espermatozoides a la zona pelúcida y, como paciente infértil o Test de Zona negativo a la unión menor a 50 espermatozoides a la zona pelúcida; valores similares de punto de corte fueron descritos por Vigil y col., 1993, para definir pacientes fértiles e infértiles. La Tabla Nº 4 muestra los dos mayores puntos de corte (40 y 50), sin embargo, el punto de corte de 50 aumenta la sensibilidad y especificidad en relación al punto de corte de 40, de ahí que los valores predictivos del punto de corte de 50 es el resultado deseado de discriminación entre fértiles e infértiles. Los resultados del análisis de correlación entre los diversos exámenes, reacción acrosómica, madurez espermática, test hipoosmótico,, motilidad y morfología espermática con el Test de Zona muestran una concordancia notable (Gráficos Nº 2-6 ). Por tanto, para evaluar la capacidad fecundante del espermatozoide humano, es importante tomar en cuenta los principales eventos que nos llevan a la fecundación, como la capacitación espermática, reacción acrosómica y la unión espermatozoide-zona pelúcida. Es por esto que la fecundación se entiende mejor cuando se analiza después de conocer la maduración final de los gametos y los procesos que intervienen en su acercamiento, motivo por el que se tomaron en cuenta estos parámetros para su evaluación in vitro en el presente trabajo. CONCLUSIONES 1. El presente trabajo ha logrado demostrar que el Test de Zona tiene mayor sensibilidad y especificidad que las otras pruebas. 2. Se validó el Test de Zona como método confiable de diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano en pacientes con problemas de infertilidad. BIOFARBO - (13)

10 GONZALES, CORTEZ, OLIVAREZ, RIOS, ORDOÑEZ 3. Se determinó que el Test de Zona es altamente sensible (90.48%) y específico (86.96%), para detectar los pacientes verdaderamente infértiles y fértiles. 4. Los valores predictivos positivo y negativo y las razones de verosimilitud del Test de Zona indican, así mismo, que tienen la capacidad de discriminar los pacientes verdaderamente fértiles e infértiles. 5. Los resultados de correlación entre los diversos parámetros seminológicos (motilidad y morfología normal) muestran una concordancia notable con el Test de Zona, demostrando la solidez de los estudios, la coherencia del Test de Zona con el Gold Estándar, y la importancia de estos para la fecundación. 6. Los índices de correlación altos entre la reacción acrosómica, madurez espermática y Test Hipoosmótico con el Test de Zona, muestran la importancia de los mismos para favorecer la unión espermatozoide-ovocito, evento trascendental en la fecundación. 7. El Test de Zona junto con las pruebas de fertilidad in vitro coadyuvan con el diagnóstico de la capacidad fecundante del espermatozoide humano. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BURKMAN LJ, CODDINGTON CC, FRANKEN DR, KRUGER T, ROSENWAKS Z, HODGEN GD The Hemizona assa y (HZA); development of a diagnostic test for the bingling of human spermatozoa to human hemizona pellucida to predict fertilization potential. Fertility and Sterility ; 49: p. BURKMAN LJ, CODDINGTON CC, FRANKEN DR, KRUGER TF, ROSENWAKS Z, HODGEN GD En: Andrología, Fertilidad e Infertilidad de Gustavo Gonzales, Ediciones Instituto de Investigaciones de la Altura. Lima Perú pp. COMPARATO M. ; ALFONSIN A Esterilidad, Editorial Celsius Bs As Argentina pp. GOMEZ E., IRVINE S., AITKEN J., Diagnóstico de la función espermática. En: Reproducción Humana por Remohi J., Simón C., Pellicer A., Bonilla-Musoles F. McGraw-hill/Interamericana. Primera edición. España. 11: pp. GREENBERG R., FLANDERS D., DANIELS S., BORING J Epidemiología Médica. Editorial El Manual Moderno S.A. Impreso en México pp. JEGOU B Disminuye la fertilidad masculina?. En: Mundo científico. Septiembre. Nº 171. Editorial RBA revistas S.A pp. KRUGER T.F, MENKVELD R, STANDER FSH Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilizaction. Fertil Steril. 46: pp. KRUGER TF, ACKERMAN SB, SIMMONS KF, SWASON JR, ACOSTA AA A quick reliable staining technique for human sperm morphology. Arch. Androl. 18: pp. KRUGER T.F Morfología espermática. En: Reproducción Humana por Remohi J., Simón C., Pellicer A., Bonilla-Musoles F. McGraw-hill/Interamericana. Primera edición. España. 13: pp. KRUGER T.F, FRANKEN D.R., MENKVEL D.R En: Strict 1-2-3, Cuadernillo de Programa de Auto Aprendizaje sobre Morfología espermática. Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago-Chile. 1-4pp. MORALES P., VANTMAN D., MADARIAGA M Sperm penetration through the human zona pellucida as a predictor of in vitro fertilization. Andrología. 31: pp. OEHNINGER S. CODDINGTON CC. SCOTT R. FRANKEN DR. BURKMAN LJ ACOSTA AA. HODGEN GD: Hemizona assay: assessment of sperm dysfunction and prediction of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility 1989; 51: p. OEHNINGER S. ALEXANDER NJ Male infertility: The focus shifts to sperm to sperm manipulation. Curr opin obstet Ginecol; 3: pp. O.M.S. ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD Manual de Laboratorio para la examinación del semen humano y la interacción espermatozoide y mucus cervical. Editorial Médica Panamericana S.A. Tercera edición. Buenos Aires-Argentina pp. OVERSTREET JW. HEMBRE WC Penetration of zona pellucida of non living human oocytes by human spermatozoa in vitro Fertility and Sterility, 27: 815 pp. SMITH R Valor del Test de Hamster y Penetración de ovocitos humanos. En: Andrología, fertilidad e infertilidad. Programa de Reproducción humana. Organización Mundial de la Salud de Gonzales G. Ediciones Instituto de Investigaciones de la Altura. Impreso en Lima- Perú pp. TALBOT P. Y CHACON RS A triple-stain technique for evaluating normal acrosome reactions of human sperm. J. Exp Zool. 215: pp. TERQUEN A. Y DADOUNE JP Aniline Blue staining of human spermatozoa chromatin evaluation of nuclear maduration, the sperm cell. J Andre. Ed. Martinus Nijhoff Pyblishers pp. THOMAS P., MEIZEL S Zona pellucida glycoproteins. Annual Rev. Biochem. 57: pp. VIGIL, P., Fecundación en mamíferos. Actual Ginecol Obstet. Vol.3 Nº 4. Pontificia Universidad Católica de Chile pp. YANAGIMACHI R Mechanisms of fertilization in mammals. In fertililization and embryonic development in vitro. Edited by L. Mastroianni Jr, JB Biggers. New York, Plenum press, 81p. (14) - BIOFARBO Vol. IX - Diciembre de 2001