1) CUANDO SE ROMPE EL CONTROL DE LA EXPRESION GENICA 741 2) PROTO-ONCOGENES, ONCOGENES Y GENES TUMOSUPRESORES 743

Transcripción

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2 CICLO CELULAR 1 737

3 1) CUANDO SE ROME EL CONTROL DE LA EXRESION GENICA 741 2) ROTO-ONCOGENES, ONCOGENES Y GENES TUMOSURESORES 743 3) MECANISMOS QUE ROICIAN LA DIVISIÓN DESCONTROLADA DE UNA CÉLULA YA DIFERENCIADA 746 4) ROTEÍNAS Y MECANISMOS ROTAGONISTAS DEL CONTROL EN EL CICLO CELULAR 748 a) La Familia de las Ciclinas 748 b) Kinasas Dependiente de Ciclinas (CDKS) 751 c) Mecanismo de Acción del Complejo Ciclina Kinasa 752 5) CORERESORES DE LA TRANSCRICIÓN QUE NO SE UNEN DIRECTAMENTE AL DNA COMO LO SON prb, p107 y p a) Factor prb 753 b) Factores p107 y p ) FACTORES DE LA TRANSCRICIÓN QUE SE UNEN AL DNA COMO p53 y E2F. 754 a) Factor p b) Factor p c) Factor E2F 757 7) AÉNDICE - CASASAS - DIFERENCIA ENTRE NECROSIS Y AOTOSIS ) INHIBIDORES DEL COMLEJO CICLINA/CDK QUE INTEGRAN LA FAMILIA CI/KI Y WAF a) roteínas de la familia INK4 son p16, p19, p b) Familia de inhibidores incluye a los tipo CI/ KI 762 9) OTROS MODULADORES 762 a) Factor MDM2 762 b) Factor CDC 25 A, B Y C 762 c) Complejos Ligantes de Ubiquitina AC Y SCF ) CICLO CELULAR 765 CICLO CELULAR 2 738

4 11) RELICACIÓN EN LA FASE S ) UNTOS DE CONTROL G1/S, S, G2/M Y M 772 a) rimer Sitio de Control G1/S 772 b) Segundo Sitio de Control en la fase S 775 c) Tercer Sitio de Control en G2/ M 778 d) Cuarto Sitio de Control a Nivel de la Mitosis (Sitio M), durante la formación del Huso Mitótico ) EXRESIÓN DE LOS GENES 784 FACTORES BASALES DE TRANSCRICIÓN ASOCIADOS A LAS RNA OL I, II Y III COMO LO ES TFIIH 784 1) RNA pol en Eucariotes 784 2) Factores de Transcripción ) TRANSCRICIÓN BASAL ) TRANSCRICIÓN INTENSIFICADA

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6 En este capítulo se describirán primero los Mecanismos que controlan el Ciclo Celular para continuar luego con la descripción del Ciclo mismo y finalmente el control de la expresión de los genes. 1) CUANDO SE ROME EL CONTROL DE LA EXRESION GENICA. Se asume que un organismo animal o vegetal se encuentra formado por un conjunto de células diferenciadas, que se encuentran fuera del Ciclo Celular (fig. 1 15), es decir en la etapa Go o de reposo. Las características específicas de sus tejidos dependerán por un lado de los genes que se están expresando y por el otro lado de aquellos que permanezcan silenciosos. Este proceso se encuentra a su vez vigilado por la actividad de otros genes de cuya expresión depende que este panorama sea estable. Como resultado de ello, podemos distinguir distintos tejidos y órganos diferenciados capaces de ser desarrollados a partir de un mismo genoma. El hecho de que una célula entre al Ciclo Celular se debe al producto de múltiples señales cuyo origen puede ser tanto externo como interno. Estas señales son a su vez capaces de desencadenar la orquestación de una serie de eventos que controlan este proceso. Entre las señales podemos encontrar algunas de origen químico, otras de origen eléctrico y algunas producidas por contacto entre las mismas células. Todas ellas se encuentran regulando por retroalimentación, la expresión de los genes tanto del crecimiento, como de la proliferación de las células diferenciadas. G2/M (sitio de control) G2 + M (mitosis) G1 Etapa de Reposo o Go S G1/S (sitio de control) Fig Ciclo Celular donde se observan los principales puntos de restricción ubicados en G1/S y en G2/M antes de la Mitosis. La célula de un tejido diferenciado se encuentra normalmente en estado de reposo o G0. or otro lado, en el intervalo G1 ( gap 1 en inglés) del Ciclo Celular, conocido como periodo de tiempo antes de la síntesis o etapa S (fig. 1 15), se reciben señales tanto del 741

7 ambiente celular como del estado interno de la célula. En este periodo G1, se prepara a la célula para la replicación del DNA que ocurre en la etapa S (por synthesis ). En esta última etapa, se sintetizan las hebras hijas del DNA, replicando los cromosomas mediante el empleo de un programa interno. Este se caracteriza por no recibir modulación desde el medio externo como ocurre en G1. osteriormente se pasa al intervalo G2 ( gap 2 ), donde la célula acumula material y se dispone ahora a la división física. Esta última ocurre en la Mitosis (M), dando origen a dos células hijas con su respectiva dotación de cromosomas. El tiempo empleado puede ser de 6 a 24 hrs. y las 3 etapas consumen el 90 % de este. En general el tiempo que demora el Ciclo Celular depende de la ventana en el intervalo G1, donde la célula decide si proliferar o no, en base a las señales moduladoras que recibe tanto desde el exterior cómo interior. Mientras más largo sea G1 mayor tiempo tomará el Ciclo Celular. El cuerpo humano contiene de 50 a 100 trillones de células (10 18 ), de estas algunos billones (10 12 ) perecen diariamente y las restantes se deben multiplicar para reemplazar a las otras. Tomando en cuenta que el tiempo de vida promedio es de 70 años. Se tiene al final un número astronómico de divisiones celulares, donde es necesario detener a las células que han sufrido mutaciones o errores durante su vida media o en sus preparativos para duplicarse. Estos errores pueden ocurrir cuando el DNA ha sido expuesto a agentes físicos o químicos dañinos o cuando una enfermedad determinada, como la Ataxia Telangiectasia (ver capítulo 13 ), es capaz de aumentar la susceptibilidad de los cromosomas a este tipo de daño. En estos casos los errores pueden inducir a más errores, lo que sucede por ejemplo cuando se produce un huso mitótico defectuoso, que impide la correcta segregación de los cromosomas. La verificación y balance de los intervalos G1 ( recepción de señales) y G2 ( acumulación de material), se lleva a cabo en los untos de Control del Ciclo Celular. El primero y más conocido de ellos se encuentra destinado a evaluar el daño al DNA y se ubica hacia el final del intervalo G1 (límite G1/S). Otro de ellos, se encuentra en el intervalo G2 (límite G2/S), es decir mientras la célula aumenta de masa. En este último sitio, se evalúan tanto la fidelidad de la replicación del DNA, como la generación del huso mitótico para dividirse posteriormente en M. En aquellos tejidos como piel, sangre y epitelio intestinal, la división celular continúa durante toda la vida, en contraste con la célula nerviosa y la célula muscular que permanecen en la etapa Go. Aquí las células permanecen en un estado de continua de diferenciación o bien sufren una llamada diferenciación terminal. or otro lado, las células de otros tejidos pueden salir de Go, luego de un tiempo y volver a entrar al Ciclo Celular normalmente. En el caso de las células cancerosas, tenemos que estas pierden la capacidad de control por retroalimentación y la comunicación con las células vecinas, por lo tanto se reproducen agresivamente migrando hacia otros tejidos, invadiendo y destruyendo aquellos órganos necesarios para sostener la vida. El estudio de los genes que controlan el Ciclo Celular, se inició observando el crecimiento en los brotes de la levadura Sacharomyces Cerevisiae. Se empleó este espécimen por ser unicelular y contar con un ciclo que se encuentra regido tan solo por la disponibilidad de sustrato, es decir sus células no pueden dividirse sino se alcanza un tamaño determinado. Además, presenta la particularidad de que cuenta con solo 32 genes destinados a desarrollar las distintas etapas del Ciclo y que si alguno de ellos se encuentra alterado por alguna mutación, el Ciclo se detiene. 742

8 Mucho más complejas son las células animales que están sometidas a una red de señales correspondientes a un organismo pluricelular, las que se encuentran a su vez involucradas en la coordinación de cada célula que forma un tejido. Desde la etapa embriónica hasta la etapa adulta y a la vez regulan sus cambios metabólicos en coordinación con el resto del organismo. Así tenemos que las señales recibidas en G1, son captadas por receptores y transmitidas por proteínas de relevo que dependen de dos tipos especiales de genes. Estos pueden ser conocidos como los roto-oncogenes y los Genes Tumosupresores (Fig. 2 15). Factor de Crecimiento Factor de Inhibición VIA ACELERADORA rotooncogenes ROTEINAS DE RELEVO VIA FRENADORA Genes Tumosupresores Liberación o retención de Factores de Transcripción NUCLEO Fig Ambas vías de relevo se dirigen desde el exterior al núcleo pasando y amplificando señales para controlar la expresión de los genes. Volver al inicio 2) ROTO-ONCOGENES, ONCOGENES Y GENES TUMOSURESORES a) roto-oncogenes: son los genes que normalmente codifican proteínas que sirven de relevo a señales químicas que provienen desde el exterior de la célula y se dirigen hacia los genes en el núcleo (fig. 2 15). Estas señales son transportadas por las proteínas conocidas como Factores de Crecimiento, roteínas Kinasas (asociadas y no asociadas a receptores), Receptores asociados a la roteína G (activados por GT), roteínas G asociadas a membranas, Enzimas Fosforiladoras del tipo Serina y Treonina Kinasas junto a roteínas que se unen al DNA, como son los mismos Factores de Transcripción. Todos estos elementos son capaces de amplificar la señal y acelerar la expresión de los genes que conducen a la división celular, sin embargo cuando sufren alguna mutación inducen a una transformación celular y pasan ahora a llamarse Oncogenes (del Griego: Onkos = masa o tumor). b) Oncogenes (Tabla 1 15): Estos genes no son capaces de controlar su expresión y ya no permanecen silenciosos cuando la célula se encuentra en Go, ya que producen una gran cantidad de copias anormales o defectuosas de sus propias proteínas, 743

9 indicando que sufren más de alguna mutación. Esta puede ser tanto en los genes que regulan el control de su expresión, como aquellos genes que son regulados y portan a la vez una información defectuosa en sus copias proteicas. Todos estos errores son cumulativos y arrastran a la célula fuera de Go, estimulando la división y proliferación celular sin control. or ejemplo, en aves el gen viral v-src por Rous Sarcoma Virus, estimula la formación de un carcinoma de un espécimen a otro, por medio de una simple infección viral. Sus efectos son capaces de sacar a la célula diferenciada de su estado de reposo (fig. 3 15). Sin embargo, otra forma de este gen es del tipo no oncogénica y se encuentra silenciosa en el espécimen adulto, con el nombre de gen c-src, que se encuentra clasificado como un roto-oncogén. Este gen fue activo durante el desarrollo, pero ahora ya no se expresa en la célula diferenciada. RETROVIRUS LTR gag pol env onc LTR Secuencia repetitiva term inal que actúa com o p rom otora roteina de la Capsula Trans - criptasa Inversa roteína de la envoltura Oncogene Fig Secuencias de un retrovirus que puede actuar promoviendo (aportan la secuencia para la unión de la RNA pol ) la transcripción de un proto-oncogén o introducir parte de este a la célula normal. El ejemplo anterior permite deducir que los proto-oncogenes también pueden constituir oncogenes mediante la acción de un Retrovirus (fig. 3 15), muchos de los 100 o más oncogenes encontrados tienen su contrapartida en los retrovirus. El contenido de las partículas virales puede integrarse al genoma e inducir su transcripción. Incluso puede ocurrir que un retrovirus sin un oncogen, se inserte cerca de un proto-oncogen del huésped e induzca o aumente la expresión de este en unas 30 o 100 veces. Esta expresión anormal se atribuye a que las regiones LTR (Long Terminal Repeats) de los retrovirus, contienen poderosos promotores y secuencias intensificadoras que son responsables de estas características. c) Genes Tumosupresores (Tabla 1 15 ) : Son lo contrario de lo anterior y codifican proteínas que normalmente inhiben o frenan la proliferación celular. En el caso de mutar, sus copias ya no son efectivas frenando la expresión (fig. 2 15). Normalmente cuando las condiciones para la Mitosis son desfavorables, estos genes se activan y se da tiempo a la célula para que repare el daño. En el caso de que sea este muy extenso, la célula entra en la vía de la Apoptosis o muerte programada. Este hecho ocurre por digestión de sus ácidos nucleicos y la denaturación de sus proteínas. Lo anterior permite deducir que la alteración de un gen Tumosupresor, debido a una mutación conducirá a la pérdida de su actividad inhibidora y aquellas células diferenciadas, pero con DNA dañado por mutaciones previas pasarán ahora a 744

10 reproducirse teniendo una ventaja selectiva sobre las células normales que sí morirán. En la Tabla 1 15, se describen algunos Oncogenes y genes Tumosupresores descubiertos en diferentes tipos celulares. Estos genes son capaces de actuar a distintos niveles en la transmisión de señales desde el exterior de la célula hasta su núcleo. TABLA 1 15 erb-b ONCOGENES Codifica para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y es una roteína Kinasa transmembrana que forma parte de una familia de receptores ubicados en la membrana citoplasmática. Se encuentran relacionados con la curación de las heridas y pueden sufrir sobre expresión o amplificación. GENES TUMOSURESORES NF-1 Codifica para la proteína que inhibe a la proteína estimuladora Ras en el citoplasma. Implicado en cánceres del sistema nervioso periférico y leucemia mieloide. N-ras Codifica para una proteína que actúa como relevo de señal estimulatoria en el citoplasma (se une al GT y es conocida como proteína G), sufre una mutación puntual y se encuentra implicado en las Leucemias RB Codifica para la proteína prb que en el núcleo se une a los factores de transcripción de la familia E2F impidiendo la expresión de los genes necesarios paras entrar al Ciclo Celular. c-myb c-myc Codifica para un Factor de Transcripción. La falta de su Ct inhibitorio por deleción o disrupción, lo activa de forma trans y aumenta su capacidad de transformación de células hematopoyéticas. Se encuentra su contrapartida en el retrovirus generador de leucemia de las aves como v-myb Codifica para factores de transcripción en el núcleo que a su vez activan genes promotores de crecimiento. Sufre de translocación y amplificación. Implicado en las leucemias, cáncer a la mama, estómago y pulmones 53 Codifica para la proteína p53 que detiene la división celular y puede conducir a las células a la Apoptosis. Se encuentra en el núcleo. Es claro que los genes Tumosupresores al ser estimulados actúan en conjunto con los roto-oncogenes para decidir si una célula prolifera o no. or lo tanto si cualquiera de los elementos de la cascada formada por las proteínas inhibitorias desaparece, se corta su efecto. Es sabido que aquellos cánceres producidos tanto por mutación en los rotooncogenes como por mutación de los genes Tumo-supresores, son del peor pronostico, ya que la proliferación celular es acelerada y a la vez no tiene freno. d) Genes involucrados en la reparación del DNA, constituyen un tipo de genes similares a los anteriores. Su falla se encuentra relacionada con la perdida del control durante el Ciclo Celular. La misión de ellos es velar porque cada copia de las hebras madres sea replicada de una forma exacta y a su vez deben evitar la inestabilidad de los cromosomas. La alteración de dichos genes por medio de algunas mutaciones, induce a los siguientes síndromes: 745

11 1) Ataxia (falta de coordinación) Telangiectasia (dilatación de los capilares), se produce por falla del gen ATM que a su vez provoca Leucemia o Linfoma. 2) Anemia de Fanconi, conocida como falla en el gen FancD2, que provoca Leucemia mielogénica aguda. 3) Síndrome de Bloom, falla del gen BLM que codifica para una DNA Helicasa, cuya falta provoca una alta incidencia en la ruptura de los cromosomas. 4) Xeroderma igmentosum, caracterizado por una falta de reparación en los cromosomas expuestos a la luz UV y que produce una alta susceptibilidad al cáncer hereditario al colon sin la presencia de pólipos. 5) Síndrome de Li-Fraumeni, producido a causa de los genes tumosupresores de la familia T53, que entrega instrucciones para la síntesis de p53 y CHEK2 por Check point Kinase 2 o roteína Kinasa relacionada con reparación al daño causado al DNA. La falla de ambos genes a la vez predispone a sarcomas, leucemias, tumores de mama, tumores cerebrales y adrenales. 6) Síndrome de ruptura de los cromosomas o Síndrome de Nijmegen, cuyo gen responsable es el NBS1. Este se relaciona con el procesamiento de las rupturas producidas en la doble hebra de DNA, su falla provoca Leucemia o Linfoma. Volver al inicio 3) MECANISMOS QUE ROICIAN LA DIVISIÓN DESCONTROLADA DE UNA CÉLULA YA DIFERENCIADA Los siguientes mecanismos sacan del reposo a una célula diferenciada: a) La inserción, que puede ocurrir en cualquiera de los lados del proto-oncogen. Este tipo de activación se ha demostrado en el caso de los proto-oncogenes c-myc y c-myb (Tabla 1-16). Más aún, pueden ocurrir mutaciones del tipo puntual, como sucede con c- ras, ubicado en el cromosoma humano 11, donde el cambio de una Guanina por una Citosina se relaciona con el cáncer a la vejiga. Esta mutación hace que el aminoácido Glicina, normalmente en la posición 12 de una proteína G (Transductora de mensajes con subunidades α, β y γ) se cambie por Valina. Este cambio no permite la liberación de GT de la subunidad α de esta proteína y queda continuamente activada, haciendo que la señal pase hacia el núcleo donde provoca una transformación. b) La deleciones o pérdida de una secuencia. Este tipo de accidente molecular provoca una transformación de los tejidos, como ocurre con el oncogen del receptor EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), ubicado en el cromosoma 7. Cuando este receptor sufre la deleción del dominio que se une al ligante que lo activa, forma un dímero donde la enzima Tirosina Kinasa que es parte normal de su estructura permanece ahora activa y no es controlada por el ligante, por lo tanto el receptor permanece activado. Es decir como si el ligante estuviera unido continuamente al receptor y pasa señales que no han llegado o no existen, desencadenando una respuesta anormal en la célula. c) Las translocaciones que ocurren en los cromosomas, son también fuente de alteración para uno o más de los elementos de la cascada transductora de señales. Este 746

12 proceso se observa en el cromosoma hiladelphia, que contiene una fusión entre los oncogenes bcr1 y abl, que a su vez activan continuamente a la Kinasa de abl provocando un tipo específico de Leucemia. d) Otro de estos casos ocurre como consecuencia de la amplificación accidental de los proto-oncogenes, al aumentar su número de copias. Este mecanismo, también desemboca en el desarrollo de algún tipo de cáncer. or lo tanto, en base a lo anterior se puede concluir que al menos en las células Humanas, la transformación ocurre por una o todas las causas anteriores, es decir cuando fallan los genes Tumosupresores, se estimulan los Oncogenes sin contrapartida o falla la reparación del DNA. La consecuencia de las fallas anteriores es la aparición de una nueva actividad enzimática denominada Telomerásica. Es interesante hacer notar la presencia de una nueva enzima denominada Telomerasa (Fig. 4 15) por Telómero o extremo de los cromosomas, en aquellas células que han perdido su diferenciación y que se consideran malignas o cancerosas. GGGG CCCC GGGG GGGG GGGG GGGG GGGG GGGG CCCC 5 Hebra hija o extremo más corto donde el cebador fue hidrolizado por la DNA pol I 3: La Telomerasa posee un RNA cebador incluido, propio de su estructura GGGG GGGG GGGG GGGG 3 1: Telómeros o secuencias repetidas en tandem en la hebra madre en grupos de 5 CCCC 2: Secuencia repetida por la Telomerasa y adicionada al grupo de secuencias anteriores del telómero CCCC 4: La elongación por la Telomerasa deja espacio para la unión de un cebador que es parte de la Telomerasa. CCCC GGGG GGGG GGGG GGGG GGGG CCCC DNA pol CCCC 3 CCCC 5: Cebador hecho por la Telomerasa 6: La DNA pol I tiene ahora lugar de anclaje y completa la hebra hija retardada Fig La Telomerasa posee una secuencia de RNA complementario al repetido y el resto lo constituyen las subunidades de proteína pertenecientes a la enzima. Los Telómeros no tienen secuencias codificantes de proteínas y presentan solo secuencias del tipo repetitivo en grupos de a 5 dispuestas en tandem. La actividad de la enzima Telomerasa, radica en la elongación del extremo de los Telómeros cuando el cromosoma se replica una y otra vez. Lo sorprendente de esta enzima, es que no se encuentra presente en la célula normal, donde por cada Mitosis se acortan los cromosomas. Esto se debe a que la DNA pol I avanza solo en dirección 5 a 3 y el 747

13 cebador de RNA que emplea para anclarse e iniciar la replicación, es eliminado por la actividad exonucleasa de la DNA pol I, dejando el extremo 5 más corto en la hebra hija. De esta manera, después de un total de 50 a 60 replicaciones se produce un acortamiento notable, comparado con la célula cancerígena que es inmortal y cuyos cromosomas no se acortan a causa de que los telómeros son reparados oportunamente por la Telomerasa, ya que esta enzima incrementa el número de secuencias repetitivas y deja espacio para que entre un cebador de RNA que es parte de la misma enzima. La DNApol I se ancla a este cebador y completa la replicación de la hebra madre al rellenar el hueco en la hebra hija. Volver al inicio 4) ROTEÍNAS Y MECANISMOS ROTAGONISTAS DEL CONTROL EN EL CICLO CELULAR. Los procesos que ocurren en el Ciclo Celular se basan en el control que se ejerce sobre un complejo formado por dos proteínas. Una de ellas es la subunidad reguladora denominada Ciclina y la otra es la subunidad catalítica que fosforila sustratos y a la vez es fosforilada. A esta última se la denomina Kinasa dependiente de Ciclina (CDK) (fig. 5-15). El Ciclo Celular es un sistema de elevada complejidad, donde es necesario analizar el control, la identidad y el comportamiento de cada uno de sus integrantes. De esta manera se pretende distinguir, como ocurren aquellas transformaciones que conducen a la célula a replicarse normalmente o indiscriminadamente (cáncer): Volver al inicio a) LA FAMILIA DE LAS CICLINAS Las Ciclinas (fig. 5-15), integran una familia de proteínas que comparten un segmento de su secuencia. Durante el Ciclo Celular, las Ciclinas son controladas en su expresión a nivel de transcripción y degradación, cambiando en cantidad y especificidad de acción. De esta manera, son capaces de caracterizar cada etapa del Ciclo y a su vez aseguran la continuidad de este. Luego de que cada Ciclina ha cumplido con su función, son destruidas mediante la acción de sistemas especializados (AC y SCF, más adelante), manteniendo así la unidireccionalidad del Ciclo Celular. Los complejos entre Ciclinas y CDKs, una vez formados regulan su actividad mediante distintos procesos. Entre ellos tenemos fosforilación, defosforilación y unión a proteínas inhibitorias capaces de retardar la actividad de este complejo. De esta manera se hace al Ciclo Celular más lento y se le da tiempo suficiente a los sistemas de reparación, para subsanar aquellas fallas y errores ocurridos durante situaciones adversas, como aquellos efectos genotóxicos causados tanto por radiación como la presencia de agentes químicos, fuera de aquellos errores normales cometidos durante la replicación del DNA. Las Ciclinas son a su vez capaces de regular la especificidad de las CDKs. Esta tarea la ejecutan mediante la inducción de cambios conformacionales, mientras que la actividad misma del complejo Ciclina/ CDK es regulada por las fosforilaciones y defosforilaciones de la subunidad catalítica desde otros factores. 748

14 CICLINAS: SON LAS SUBUNIDADES REGULATORIAS DE LAS KINASAS, QUE SE EXRESAN ERIÓDICAMENTE DURANTE EL CICLO. CONFIEREN ACTIVACIÓN Y DISTINTAS ESECIFICIDADES CICLINA 1 4 CKI Ubiquitina KINASA DENDIENTE DE -Thr(160)- CICLINA(Cdk) 2 3 -Thr(14)- -Tyr(15)- 5 Ubiquitina KINASAS DEENDIENTES DE CICLINAS: SON LAS SUBUNI-DADES CATALÍTICAS ACTIVADAS OR LAS CICLINAS. SON CONS-TITUTIVAS. ACTÚAN COMO SERINA Y/O TREONINA KINASA. AL FOSFORILAR ACTIVAN, INHIBEN Y/O MARCAN ARA LA DEGRADACIÓN 1 : Activación de las Kinasas por asociación entre Ciclinas y Cdk 2 : Control por fosforilación inhibitoria de Thr 14 y Tyr 15 3 : Control por fosforilación activadora de Thr 160 mediante CAK, este último formado por el complejo CDK7- Ciclina H - MAT1. 4 : Unión con inhibidores de Cdk denominados como CKIs (Inhibidor de la Kinasa dependiente de Ciclina) 5 : Degradación de Ciclinas y/o CKIs por medio de Ubiquitinación Fig Control del Ciclo celular mediante el Complejo Ciclina Kinasa dependiente de Ciclina (CDK). Las Ciclinas poseen un segmento de secuencia homóloga de aproximadamente 100 aminoácidos, que es altamente conservado y que se denomina Cyclin box donde se encuentra una Secuencia típica de la Ciclina. Esta región es la que se une a la Cdk. En general, las Ciclinas se dividen en dos tipos, las G1(Ciclinas D y E) y las Mitóticas (Ciclinas A y B). Las G1 son de vida media corta y se degradan por sus secuencias conocidas por las siglas EST, ubicadas en el extremo Ct de la Cyclin box. or otro lado, las Mitóticas duran más tiempo y se acumulan durante G2, para unirse a las Cdks y formar el Factor de romoción de la Mitosis o MF. Este último actúa como la señal necesaria para entrar a la Mitosis. Las Ciclinas mitóticas (A y B) se degradan precisamente antes de entrar a la mitosis, por medio de la marcación con Ubiquitina. Este último es un péptido señalizador, que se une a la secuencia típica denominada secuencia para la destrucción. Esta se encuentra localizado hacia el lado N terminal de la secuencia común a todas las Ciclinas. La unión de la Ubiquitina es llevada a cabo por los sistemas AC y SCF. Estos sistemas de proteasas, se conocen bajo el nombre de AC por Complejo romotor de la Anafase y SCF por Skp1-Cullin-Fbox (o complejo de tres proteínas). Ambos contienen al roteosoma 26 S encargado de hidrolizar a las Ciclinas. 749

15 Ciclina D Ciclina E Ciclina A Ciclina B G0 G1 G1/S S G2 G2/M M INKs Cip/Kip Cip/Kip Fosforilación Ciclina B Cdc2 Ciclina A Cdk2/Cdc2 Ciclina E Cdk2 Ciclina D- Cdk4/Cdk6 Fig Niveles de las distintas Ciclinas durante el Ciclo Celular Volver al inicio b) KINASAS DEENDIENTE DE CICLINAS (CDKS). 750

16 En la Tabla 2 15 se observan los distintos complejos fosforilantes Ciclina CDK, donde tanto CDK4 como CDK6 son típicas de G1 y se activan por las Ciclinas D (Ver figura 12-15). ares de Ciclina CDK TABLA 2 15 Etapa del Ciclo Sustrato Efecto Regulatorio G1 prb fosforilado Suelta los E2F de prb para que E2F se una al DNA e inicie la transcripción Ciclina D/CDK4,6 Ciclina E/CDK2 Ciclina E/CDK2 S prb fosforilado Reafirma el efecto de fosforilación sobre prb Ciclina A/CDK2 G1/S E2F-1/D1 fosforilado Ciclina A/ CDC2 o G2, p53 CDK1 G2/M Se une a E2F1/D1 y lo fosforila impidiendo que se unan al DNA Estimula especificidad de unión al DNA Ciclina B/ CDC2 o CDK1 G2/M ORC fosforilado aso de G2 a M Ciclina B/CDC27 TFIID Inhibición Como parte de Fosforilación del TFIIH/Cdk7 Dominio carboxiterminal de RNA pol II (CTD Como parte de la actividad CAK: Cdk7 Fosforila otras CDKs Ciclina C/CDK8, G1, S, G2, M RNA pol II Ciclina H/CDK7/MAT1 (factor de ensamblaje) Ciclina B/CDC2 TFIIIB Inhibición Ciclina B/CDC2 oly (A) olimerasa Inhibición A continuación a finales de G1 aparece la actividad fosforilante de CDK2 que se mantiene hasta S con la Ciclina E y Ciclina A. En la etapa S, se tiene la actividad de CDC2 o CDK1 y además la actividad de CDK7. En G2 se tiene a CDK2 y CDC2 con Ciclina A, para terminar con CDC2 y Ciclina B en la Mitosis. 751

17 CAK o el complejo entre CDK7 y Ciclina H, no varía su expresión durante el Ciclo y regula positivamente a CDC2 y CDK2, que fosforilan a las kinasas en las Treoninas. Volver al inicio c) MECANISMO DE ACCIÓN DEL COMLEJO CICLINA KINASA En el caso genérico del complejo Ciclina CDK ocurre que la CDK en especial CDK2, se encuentra formada por dos lóbulos en cada uno de sus extremos. El Nt tiene segmentos de estructura β- pegada y el lóbulo del extremo Ct tienen estructura α- hélice. Entre ambos lóbulos queda el sitio activo donde se une el AT y la entrada a este mismo se encuentra resguardada por el bucle T. Al unirse la Ciclina a CDK2, se provoca el acercamiento de tres residuos de Argininas dispersos en la estructura, uno de ellos unido a la hélice de secuencia STAIRE, el otro unido al bucle T y el último pertenece al bucle catalítico. El bucle T, es un sitio específico de la secuencia, donde se encuentra una Serina o una Treonina capaz de ser fosforilada y que ejerce a la vez un cambio conformacional, que se imparte al resto de la proteína. De esta manera las tres Argininas se desplazan siendo coincidentes en el bucle T, donde forman un bolsillo en el que la Thr 160, es fosforilada por CAK (Ciclina H- CDK7). Esto se traduce en la abertura del sitio catalítico para aceptar y fosforilar a una proteína como sustrato, además se estabiliza la forma activa de la estructura y se produce un aumento de la interacción con la Ciclina por medio del aumento de los enlaces hidrógeno. or otro lado, la fosforilación en Tyr 15 y Thr 14 de la secuencia por otras kinasas actúa inhibiendo la actividad fosforilante. En general acerca de la actividad de las Kinasas se pueden desprender los siguientes conceptos: 1) Los complejos Ciclina/CDK se encuentran involucrados en todos los procesos de activación del Ciclo Celular incluyendo a la Mitosis 2) Las Kinasas dependientes de Ciclinas son constitutivas, mientras que las Ciclinas son inducibles. 3) La especificidad de las Kinasas depende exclusivamente de las Ciclinas. 4) La actividad enzimática de las Kinasas es regulada por procesos de Fosforilación y Defosforilación. 5) Los inhibidores de las Kinasas (CDKIs o CKIs) actúan por unión a las Kinasas. 6) Los sistemas Ubiquitina-roteosoma son los encargados de hidrolizar a las Ciclinas y a los CDKIs. 7) Una gran cantidad de sustratos son fosforilados por las Kinasas resultando en activación, inhibición además de marcación para la degradación e incluso el reconocimiento de su ubicación en distintos compartimentos de la célula. 8) En general existen 4 mecanismos para controlar la actividad de las Kinasas: a) Unión de las Ciclinas 752

18 b) Unión de los CDKIs (Inhibidores de las Kinasas dependientes de Ciclina) c) Fosforilaciones activadoras e inhibitorias d) Degradaciones mediadas por Ubiquitinas de Ciclinas y CDKIs Volver al inicio 5) CORERESORES DE LA TRANSCRICIÓN QUE NO SE UNEN DIRECTAMENTE AL DNA COMO LO SON prb, p107 Y p130. a) Factor prb La función de la proteína prb kd (998 aminoácidos), se determinó al descubrirse que faltaba total o parcialmente en un tipo especial de cáncer que afecta a niños con una muy baja incidencia y que se conoce como Retinoblastoma Retinal. El gen responsable, es de 200kb y no se encuentra presente a causa de una deleción total o parcial del brazo largo (q) del cromosoma 13, banda 14 (13q14). La enfermedad también aparece cuando el gen se encuentra normalmente presente, pero debido a un error durante la etapa de procesamiento en el transcrito primario (RNAhn), se producen copias proteicas no funcionales que se encuentran mal ensambladas. Cuando uno de los alelos del gen RB se pierde por alguna deleción accidental en las células somáticas no se produce ningún efecto, sin embargo la perdida de este alelo en las células germinales crea un portador con un fenotipo aún normal, cuya descendencia tendrá mayor probabilidad de tener una segunda mutación en los heterozigotos, pero en el alelo normal adquiriendo ahora la enfermedad a una edad mas avanzada. or otro lado, la perdida de ambos alelos en un homocigoto hace que la enfermedad aparezca a temprana edad. prb es fosforilado por los complejos Ciclina/ CDKs y normalmente la proteína prb, no se encuentra fosforilada o bien se le halla hipofosforilada en la célula en reposo. prb forma parte de un complejo inhibidor de la expresión (prb-e2f-gen), precisamente de aquellos genes que son necesarios para entrar al Ciclo Celular o pasar por los distintos puntos de control del Ciclo. prb tiene por función retener a los factores activadores de la familia E2F en un complejo que se halla en su forma inactiva. Cuando prb en el complejo es fosforilado progresivamente o hiperfosforilado, libera a los factores de transcripción, dejando ahora al factor E2F unido al Gen. A su vez E2F activa de forma trans (alelo paterno y materno) la expresión de los genes. or lo tanto sin prb, las células abandonan Go y se replican aún con el DNA dañado produciéndose el Cáncer de la Retina o Retinoblastoma. Volver al inicio b) Factor p 107 y p 130. Otras proteínas de la familia de prb denominada tumosupresora, son las proteínas p107 (107 kds) y p130 (130kDs), ambas retienen o inactivan a algunos de los factores de transcripción de la familia E2F (fig.11-15) y a su vez inhiben la expresión de varios genes que solo pueden ser liberados por fosforilación. 753

19 Tanto prb como p107 y p130, se les puede denominar proteínas bolsillo, ya que tienen por función reclutar o echarse al bolsillo a la Histona Deacetilasa (HDAC). Esta última junto a la otra enzima Histona Acetil Transferasa (HAT), tienen por función deacetilar y acetilar respectivamente a las Histonas, precisamente en el grupo ε -Amino de sus Lisinas. Al ser Acetilada una Lisina esta pierde su carga positiva, por introducción del grupo N- Acetilo y ya no interacciona con los fosfatos negativos del DNA. De esta manera se pierde la estabilidad del nucleosoma que se desarma para dejar DNA al descubierto e iniciar la transcripción. Una complicación que presenta este mecanismo, es que el efecto depende en parte, de la identidad de las Histonas pertenecientes al Nucleosoma y la posición en la secuencia de las Lisinas modificadas. En otras palabras, cuando prb se halla hiperfosforilado no se une a E2F y tampoco recluta a HDAC, quedando el DNA descubierto para su expresión. El mecanismo exacto aún no se ha dilucidado. Volver al inicio 6) FACTORES DE TRANSCRICIÓN QUE SE UNEN AL DNA (p53, p73 Y E2F). a) FACTOR p53 Uno de los primeros genes tumosupresores que fue encontrado en vertebrados es el p53, de 393 codones y 53 kd ubicado en el cromosoma 17 región p13 (brazo corto, banda 13). Durante el Ciclo Celular normal, el gen p53 es inactivo, pero en el caso de que ocurra daño en el DNA como radiación UV, agentes químicos o variación del pool de los nucleótidos. La célula expresa este gen y su producto la proteína p53, aumenta de vida media manteniendo a la célula en reposo, es decir permite que el daño que estimuló su expresión sea reparado. Si este daño es muy extenso o el gen es activado muy tarde para prevenir la división celular, la célula entra en Apoptosis o muerte programada. De esta manera se eliminan permanentemente los errores genéticos. La proteína del gen p53, posee a su vez modificaciones post-traduccionales que la hacen aún más activa. Así su dominio cerca del Nt (amino terminal) es acídico con cargas +, similares a las de los factores de transcripción y se une al DNA en la forma de un tetrámero. Esta conformación es también promovida por las interacciones de su dominio en el extremo Ct (carboxilo terminal) que una vez fosforilado, tiene la capacidad de activar la transcripción de un gen conocido como p21/ WAF1. El producto de este gen, actúa a su vez inhibiendo la acción de los complejos Ciclina-Kinasa dependiente de Ciclina. De esta manera se impide la acción fosforilante de estos sobre prb y no se expresan los genes que permiten el paso por el punto de restricción antes del límite G1/S, como se verá más adelante. La vida media de la proteína p53 es de corta duración (15 a 30 minutos) y se encuentra sujeta a fosforilaciones por los complejos Ciclina A-CDK2 y Ciclina B-CDC2 que operan en la fase S y G2/M, pero no por las Ciclinas de la fase G1 como Ciclina E/CDK2 y Ciclina D1/ CDK4. or otro lado, el gen p53 puede sufrir a su vez, mutaciones en ciertos lugares denominados puntos calientes y que se encuentran ubicados entre los codones , , , y Sucede aquí, que no todos los daños son reparados con la misma premura y a causa de ello, ocurren mutaciones permanentes en los aminoácidos 175, 248 y 273 que conducen a la pérdida de la función. En estos casos la 754

20 proteína p53, no es capaz de inducir la expresión de p21 (roteína inhibidora del Complejo Ciclina/CDK) y de retardar por consiguiente el Ciclo Celular o dirigirlo hacia la Apoptosis (muerte celular). La célula alterada se divide así, con su DNA dañado y este es pasado a la descendencia. En general las mutaciones por inserción o deleción en ambos alelos de este gen se asocian con cáncer al colon, mamas, hígado y pulmones. or lo tanto la célula con p53 dañado tiene una ventaja selectiva sobre aquellas células normales, pero también dañadas que se dirigen hacia el proceso de Apoptosis. La forma mutante de p53 parece tener aún más afinidad por el DNA que la forma wild type (original, no mutada) y actúa de manera dominante tipo trans, es decir como un oncogén (trans significa que afecta al gen de su alelo materno y paterno) estimulando en este caso la proliferación celular a diferencia de su forma original, que es en realidad tumo-supresora. MDM2 secuestra p53 Degradación ESTIMULO GENOTÓXICO SENSORES 19/ARF Aumento en la Transactivación cantidad o en la actividad de p53 Corte y Empalme alternativo en locus Transactivación ARF-INK4a / INK4A Ciclina D prb E2F Transactivación BAX AOTOSIS DETENCIÓN EN G1 MUERTE CELULAR CDK4 Complejo activador Ciclina /CDK inhibido por p21 y p16 prb ASO A LA FASE S Fig Apoptosis y detención en G1 del Ciclo Celular mediados por la proteína p53. prb no es fosforilado y permanece unido a E2F. El balance entre la diferenciación celular, progreso en el Ciclo Celular y Apoptosis se encuentra regulado por la razón prb y p53. Si el nivel de prb es mayor que el de E2F la célula no progresa en el Ciclo como ocurre en Go. or otro lado si la cantidad de prb fosforilado es mayor que la cantidad de prb no fosforilado y este es menor que la cantidad de factor de transcripción, la célula progresará en el Ciclo Celular pasando a S y luego a G2/M. Cualquier daño que sea detectado en este proceso aumentará los niveles de p53 y empezará el proceso Apoptótico. Durante la Apoptosis la célula no libera contenido intracelular y no produce inflamación como en la necrosis celular. Durante la Apoptosis se produce una agrupación de los organelos junto a la formación de agregados por los ribosomas, incremento en el volumen E2F 755

21 de las mitocondrias y generación de vacuolas por el retículo endoplásmico que junto a la anterior condensación del citoplasma y cromatina, forman los cuerpos apoptóticos. En estos casos ocurre que en la superficie de la célula se muestra Fosfatidil Serina, N-Acetil Glucosamina y Lectinas o receptores opsónicos, que a su vez estimulan la fagocitosis por células vecinas del parénquima. En la figura 7 15, se observa el daño causado al DNA por luz UV y/o radiación, lo que se denomina como estímulo genotóxico. Este último es capaz de detener la síntesis de DNA y RNA mediante un agotamiento del pool de nucleótidos, ya que no se continúan sintetizando las enzimas correspondientes, las cuales son inhibidas en su transcripción. Los sensores que reconocen el daño al DNA, se encuentran constituidos por una serie de proteínas codificadas por aquellos genes cuya falla acarrea los siguientes síndromes: Ataxia Telangiectasia, Síndrome de ruptura de los cromosomas o síndrome Nijmegen, Anemia de Fanconi y síndrome de Bloom como se vio anteriormente. Una vez reconocido el daño, se activa la producción y/ o actividad de la proteína p53 por medio de aquellos mecanismos de control a nivel de la transcripción o post transcripción. La proteína p53 es capaz de autorregularse al inducir el factor MDM2, este último disminuye los niveles del mismo p53, ya sea por degradación o bien secuestrando la proteína misma hacia el nucleolo. or otro lado, p53 estimula mediante transactivación la síntesis de la proteína p21 que inhibe directamente la fosforilación y/o activación de prb (fig. 7-15). A continuación se activa el sistema ARF/INK que significa Alternative reading frame / Inhibitor of Cyclin Dependent Kinase, donde se emplean exones comunes (2 y 3) para generar proteínas totalmente diferentes como p16 y p19, donde ambas presentan el primer exón diferente. La primera de ellas p16 es parte del sistema INK4a y actúa directamente como inhibidor del complejo Ciclina D/CDK4, mientras que la segunda p19, es parte del sistema ARF que inhibe a MDM2 e indirectamente impide el crecimiento celular por medio del aumento de los niveles de p53, que ya no es secuestrado por MDM2. Esto último se traduce en un aumento de los niveles de inhibidor p21 sobre el complejo CiclinaD/CDK4. En base a lo anterior, no se puede pasar a la fase S y continuar con el Ciclo, produciéndose el arresto o detención en la fase G1. En cuanto a la Apoptosis, p53 induce por transactivación el factor BAX, que actúa sobre la Mitocondria e induce un desacoplamiento entre la Fosforilación Oxidativa y la Cadena de Transporte de Electrones. Este hecho deja sin energía al sistema y conduce a una posterior muerte celular. Un mejor análisis de estos procesos se encontrará en el siguiente Apéndice al final de este tema. Volver al inicio b) FACTOR p73 p73 tiene dominios con un cierto grado de identidad con p53. 29% para el dominio de transactivación, 63% para el dominio de unión al DNA y 38% para el dominio responsable de la oligomerización. El gen de la p73 se halla asociado a la región del brazo corto del cromosoma 1, banda 36(1p36). Cuando este gen se encuentra con una deleción (le falta un pedazo), se produce un tipo de cáncer conocido como neuroblastoma. or otro lado, este mismo gen presenta los mismos puntos calientes que p53. resenta lugares de su secuencia con una alta incidencia de mutaciones, como lo es aquella zona entre los residuos 113 y

22 Otra evidencia que la liga a p53 es que el producto proteico de p73 inhibe el crecimiento de las células de neuroblastoma in vitro y también parece promover la apoptosis. Volver al inicio c) FACTOR E2F. Estos incluyen a la familia E2F 1, 2 y 3 que se unen predominantemente a prb, más el factor E2F4 que se une a todas las proteínas como prb, p107 y p130, mientras que E2F5 se une a p130. Estos factores se necesitan libres para pasar desde Go a G1 y el punto de restricción antes del límite G1/S. Los factores E2F heterodimerizan con otras proteínas relacionadas distantemente y que son las D-1, 2 y 3, las cuales se emplean para mejorar su eficiencia de unión con el DNA. Estas últimas montan la capacidad de unión al DNA mediante el complejo E2F-D. or lo tanto D es considerado como un factor activador que promueve en forma cooperativa la actividad de los promotores de la familia E2F. De esta manera, el heterodímero E2F-D funciona como activador trans (activa alelo paterno y materno) de la transcripción de aquellas secuencias promotoras que se encuentran ubicadas corriente arriba de los genes. Estos genes ahora activados codifican para las siguientes enzimas y factores: Dihidrofolato Reductasa (DHFR), Timidina Kinasa (TK), Timidilato Sintasa (TS), DNA polimerasa α (DNApol), CDC2, Ciclina E y Ciclina A. CNA por Antígeno Nuclear de la Célula roliferativa y Factores de licenciamiento (familias CDC y MCM). Además de aquellos genes que regulan la proliferación celular como: c-myc, B-Myb, prb, p107, E2F1, E2F2, CDK1, p21, p27 y p19 En general, la vía del E2F-pRB se encuentra formada por la familia E2F de factores de transcripción, la familia de las roteínas del Retinoblastoma o roteínas Bolsillo, Ciclinas y Kinasas dependientes de Ciclina (CDKs) e Inhibidores de las Kinasas dependientes de Ciclina ( CKIs o CDKis). De esta manera regulan el progreso durante el Ciclo Celular, además también regulan la Apoptosis celular. Esta última vía se encuentra descontinuada en la mayoría de los cánceres. La familia E2F1, 2 y 3 tiene una secuencia aminoacídica donde se distinguen distintos motivos como la región donde se une la Ciclina, región donde se une el DNA, la región responsable de la dimerización, la caja marcada, la zona de transactivación y la zona del bolsillo. Mientras que los factores reforzadores del efecto como D1 y D2 que son expresados a lo largo del Ciclo comparten algunas regiones homólogas como la zona de unión al DNA y la zona responsable por la dimerización. En general con E2F forman un heterodímero que pueden estar reprimido, inhibido o activado, según sea el grado de fosforilación. Volver al inicio 7) AÉNDICE- CASASAS- DIFERENCIAS ENTRE NECROSIS Y AOTOSIS 757

23 Aquí se describen como ejemplos, algunas de las vías entre las cuales p53 no se encuentra mediando la Apoptosis Celular, sin embargo los mecanismos para destruir la célula son similares a nivel de la Mitocondria. CASASAS Son proteasas que existen en la forma de Zimógenos. Tienen tres dominios el prodominio del Nt, un dominio p20 y otro p10. ueden ser activadas por otra Caspasa, por la inducción en la cercanía de otra molécula y por asociación con alguna subunidad regulatoria. oseen en el sitio activo Cisteína y rompen el enlace peptídico después de un residuo de Aspártico. Este efecto puede activar o desactivar a otro miembro de la vía de señalización desencadenando o inhibiendo su efecto. Existen en general dos tipos, el Tipo I son iniciadoras de pro-dominio largo, que sirve para interaccionar con otras moléculas y Tipo II o efectoras con un ro-dominio corto y son el producto de la vía de señalización. Las Caspasas actúan sobre múltiples blancos, por ejemplo Lamin A o Laminina A. Esta última es una proteína estructural que mantiene la integridad del núcleo, otro blanco es AR o poly-ad Ribosa olimerasa, que se encuentra involucrada en la reparación del DNA, RB proteína tumo supresora y a la vez reguladora del ciclo celular, Histona H1 otra proteína esencial que se necesita para la organización de la cromatina y CAD o DNA asa activada por Caspasa, encargada de romper el DNA en células apoptóticas. Otra de estas vías la constituye la activación de Linfocitos citotóxicos que inyectan la enzima denominada Granzima B. Esta última estimula los niveles de Caspasa 8 que cataliza el paso de ro-caspasa 9 a Caspasa 9 activa, que a su vez desencadena una cascada amplificadora de Caspasas, cuyo resultado final consiste en la proteólisis de la integridad estructural tanto del citoplasma como del núcleo, atacando proteínas del citoesqueleto y aquellas enzimas involucradas tanto en la replicación como reparación del DNA. La Apoptosis celular puede ser mediante señales externas a la célula y este tipo se denomina como instructiva, ya que es transmitida por receptores en la membrana celular. El otro tipo es interno o intrínseco y es mediado por la Mitocondria. Aquellos receptores en la superficie de la célula denominados TNF-R1 ( Tumoral Necrosis Factor ) caen en el primer tipo y son específicos para el Factor de Necrosis Tumoral (fig. 8 15). En su estructura presentan varios dominios y entre ellos encontramos a DD por Death Domain, que solo enfoca hacia el lado citoplasmático de la célula. DD se une se une lateralmente al dominio homólogo DD de una molécula adaptadora, denominada FADD o MORT1. Esta última contiene al dominio DED por Death Effector Domain. A su vez el dominio DED de la molécula adaptadora se une al dominio homólogo de la molécula ro- Caspasa 8 (Caspasa: roteasa tipo Zimógeno) que a su vez da origen a la molécula funcional como Caspasa-8. Esta última activará por proteólisis a p22bid, convirtiéndola en una proteína de menor peso molecular como p15bid. Esta última migra dentro de la membrana mitocondrial y actúa como un factor pro-apoptótico estimulando la abertura del canal T. Este hecho provoca la pérdida del gradiente electroquímico, 758

24 LINFOCITOS CITOTÓXICOS TNF: Factor Tumoral de Necrosis TNF-R1: Receptor de TNF G R A N Z I M A B D D DED ro-caspasa 8 ADATADOR O ROTS. FADD/MORT 22 BID ro Caspasa 9 15 BID ro Caspasa 3 15 BID ANT T Caspasa Tetramérica 8 Caspasa 9- Activa Fig Vías de Apoptosis en la célula. Caspasa 3 Cascada de Activación de las Caspasas desacoplamiento de la fosforilación oxidativa, producción de ROS ( Reactive Oxygen Species por radicales libres del Oxígeno altamente tóxicos), disminución del elemento reductor protector de membranas GSH y de AT, liberación de Ca +2, ro-caspasa y otras roteasas al citoplasma. En fin, toda una cadena de eventos conducentes a la muerte celular. A continuación en la Tabla 3 15, se observan algunas de las diferencias entre Necrosis y Apoptosis. TABLA 3-15 DIFERENCIAS ENTRE NECROSIS Y AOTOSIS 759

25 CARACTERÍSTICAS NECROSIS AOTOSIS Respuesta de los Inflamación Ninguna tejidos A nivel de los tejidos Grupos de células Solo células individuales afectadas Volumen celular Células hinchadas Células se condensan Membrana celular erdida de la integridad y formación de vesículas Formación de cuerpos apoptóticos en vesículas Organelos En pedazos Morfología Intacta citoplasmáticos. Núcleo Agregados irregulares de cromatina Condensación de la cromatina Volver al inicio 8) INHIBIDORES DEL COMLEJO CICLINA/CDK QUE INTEGRAN LA FAMILIA INK 4 Y CI/KI, WAF1 a) roteínas de la familia INK4 son p16, p19, p18 (fig. 9-15). Las Kinasas dependientes de las Ciclinas D, E y A pueden ser inhibidas por las familias de inhibidores (CDKIs) correspondientes a las proteínas INK4 (Inhibidores de Kinasa, Tabla 4 15), representadas por p16 (INK4a), p15 (INK4b), p18 (INK4c) y p19 (INK4d). Todos se unen a los complejos de G1 (fig. 9 15), como lo es Ciclina D CDK4,6 aunque también pueden ser inhibidores de CDK2. La proteína tumo-supresora llamada p16 (sinónimo Mts1), es un regulador negativo del complejo Ciclina D-CDK4. 760

26 Familia INK 4 Familia Cip/ Kip p19 p21 p53 TGF-B p18 p15 p16 p27 p57 roteína secuestradora de p27 Myc Ciclina D Ciclina E CDK 4 CDK 2 p 107 p130 p RB E2F D G en de C iclina E G en de C iclina A Otros Genes G1 Fig Cadena de Inhibidores del Ciclo Celular R S Al parecer modula o inhibe la fosforilación de prb por este complejo. or lo tanto cuando p16 sufre mutaciones o deleciones, el complejo se hace activo y prb es fosforilado totalmente, liberando sin control a los factores de transcripción E2B pasando por el punto de restricción antes del límite G1/S. En algunos tipos de cánceres al pulmón, el 20% ha perdido la función de p16 y el 80% ha perdido la función de prb. Volver al inicio b) Familia de inhibidores incluye a los tipo CI/ KI. Se encuentran constituidos por las proteínas p21 (Cip 1), p27 (Kip1) y p57 (Kip2), que pueden bloquear directamente la acción fosforiladora del Complejo Ciclina E CDK2 en la fase G1 tardía para que la célula no pase a S. También son capaces de unirse, pero en menor grado a los complejos Ciclinas D-CDK4,6. Factor KI1 o proteína p27 y Kip2 o p57, permanecen altas durante Go y caen en respuesta a la estimulación mitogénica. La proteína p27 se une al complejo CiclinaD- CDK4,6 bloqueando la entrada a la fase S y también a los complejos Ciclina E-CDK2 y Ciclina A-CDK2, (Tabla 4 15). Factor WAF1 ( wild type fragment 1 ), es la proteína p21 (Cip1). Es producida cuando la proteína p53 aumenta su nivel después para detectar daño al DNA. La p53 se une a la 761