Fundamentos de Microscopía Óptica

Transcripción

1 Técnicas de Microscopía aplicada a las Ciencias Forenses Adaptación Open Course Ware (OCW) Máster Ciencias Forenses Universidad de Murcia Sesión 2: Fundamentos de Microscopía Óptica Nicolás Ubero Pascal Este documento está sujeto a una licencia Creative Commons

2 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Nota informativa del autor de la presentación Las imágenes, ilustraciones y/o esquemas que aparecen en esta presentación pueden no ser completamente de la propiedad del autor, por tanto la autoría de éstas, así como su procedencia, se pueden consultar al final de la presentación bajo el título: Créditos de las Ilustraciones Copyright informative note of presentation Pictures (photography, illustrations and/or graphics) appearing in this presentation could not be at all copyrighted by the author, therefore at the end of the presentation all the pictures will be related to their authorship and the pathway of the web site where they have been taken. The title of that slide is: Pictures Copyright Nicolás Ubero Pascal 2

3 Microscopía óptica: instrumentación y principios Autor: David R. Caprette, Ph.D. Adaptación: Nicolás Ubero Compound Microscope, circa 1751

4 Microscopio óptico compuesto Cabezal Estativo Macrométrico Micrométrico Ocular (adaptador para los ojos) Revolver Objetivo Platina móvil condensador Lente de campo (fuente luminosa) Control de iluminación

5 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Fundamentos técnicos de la microscopía óptica Óptica (lentes) Iluminación Aumentos Campo visual Resolución campo Contraste Profundidad de Enfoque Nicolás Ubero Pascal 5

6 Refracción La luz se dobla en ángulo cuando incide en una superficie Al igual que un vehículo cambia su dirección cuando entra en un terreno de gravilla Aire Cristal Pavimento suelto Esta primera rueda frena Onda incidente La componente que incide primero se ralentiza primero La onda se comprime y se dobla en el límite del medio que produce la desaceleración Pavimento consolidado Eje perpendicular

7 Aumentos y Orientación I Dirección de la luz rápido lento rápido Las líneas de puntos son perpendiculares a la superficie de la lente Una lente biconvexa curva la luz en la misma dirección cuando entra y cuando sale Posición actual Imagen aparente Frog gastrula, saggital section; arrow indicates yolk plug Punto focal Dirección del movimiento Dirección aparente abajo Objeto real Imagen proyectada arriba izquierda derecha

8 Aumentos y Orientación II Por qué una lente de aumento simple no produce una imagen invertida? Con el objeto más cerca de la lente que del punto focal, los rayos de luz divergen dando al observador la ilusión de que está viendo un objeto más grande, más alejado, pero en la misma orientación.. object focal point

9 Aumentos Aumentos finales usando una lente simple (por ejemplo un estereomicroscopio) 40x 100x 400x La misma imágen: usando un microscopio óptico compuesto 40x 100x 400x

10 Resolución Resolución (d) = 0.61λ n sin α λ = Longitud de onda de la luz; n = índice de refracción Escala de resolución teórica 5 µm 2 µm 0.2 µm 1 µm 0.4 µm Escala de resolución de una 1 µm

11 Campo visual y profundidad de campo Volumen tridimensional Teniendo en cuenta los cambios del aumento Profundidad de campo a diferentes aumentos escala = 5 mm cubreobjeto (#1) 0.15 mm thick 40x Volumen de espacio observado Profundidad de una típica muestra montada en humedat 0.1 mm 40x 100x 400x 100x 400x Grosor del portaobjeto normal 1 mm 1000x 1000x

12 Campo visual e intensidad de la luz Aumento final 100x 400x 1,000x Campo aparente: (izquierda) Sin ajustar el brillo (derecha) Después de compensar con el control de intensidad Demasiado brillante Correcto correcto Correcto Demasido oscuro Demasido oscuro Aumento del objetivo 10x 40x 100x Quantity of light Diámetro de campo real 2 mm 0.5 mm 0.2 mm Área 3 mm mm mm 2

13 El contraste y el condensador Vista superior de un condensador con selector de filtros Apertura del condensador: tres posiciones Totalmente cerrado Vista lateral del condensador Resolucióny contraste optimizados Totalmente abierto

14 Contraste y variación en el condensador Tres imágenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con células de levadura) Contraste bajo Contraste óptimo Alto contraste A B (Izquierda) Bacillus thuringinensis con endosporas: (A) campo claro; (B) Contraste de fases (400x) (derecha) Pseudopodo de Chaos (Pelomyxa) carolinensis: (C) campo claro; (D) campo oscuro (100x) C D

15 Enfocando multiples surperficies objetivo Esquema no a escala Foco inicial por encima de la preparación Preparación Condensador abierto para una mayor claridad Dirección del enfoque

16 Observando a través del especimen Enfocando a través de un filamento de Spirogyra (400x) Siguiente paso Siguiente paso Células superiores enfocadas Cloroplastos enfocados justo debajo de la pared celular Aproximadamente a la mitad de la célula Siguiente paso Siguiente paso Siguiente paso Enfoque en el centro de la célula Alcanzando el fondo Cloroplastos enfocados justo encima de la pared celular

17 Microscopía con aceite de inmersión Aumentos en seco Aceite de inmersión Diffracción severa que compromete una buena resolución La difracción es minimizada con el uso de aceite de inmersión A A: Bacteria at 400x Aumentos en seco mostrando una imagen borrosa (Resolución pobre) B B: Bacteria at 1000x Con un objetivo de inmersión (Porción central del campo de visión de A)

18 Uso del objetivo de inmersión Enfocar en seco con el objetivo de mayor aumento. Mover el revólver y dejarlo en una posición entre dos objetivos Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el espécimen Colocar cuidadosamente el objetivo de inmersión sobre el espécimen 5 Disposición de aceite sobre el cubreobjetos Y ya se puede observar La punta del objetivo debe estar completamente embebida en el aceite. Colocación de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos)

19 Enfoque con un objetivo de inmersión Demasiado lejos, mover la platina hacia arriba Correcto solo es necesario un buen enfoque Demasiado cerca mover la platina hacia abajo Imagen no visible Alto o bajo correcto Imagen no visible

20 Ajuste de los oculares Separación de los ojos Enfoque del ocular (girar para enfocar) Totalmente abierto Imagen doble Totalmente cerrado centro Girar para extender el tubo del ocular Ajustar para una sola imagen

21 Lentes sucias? Si ve marcas contra un campo vacío, mueva la muestra de izquierda a derecha Si las marcas no están en la preparación, girar el ocular Manchas fuera de foco pueden aparecer en el condesador. Para saberlo... si se mueven, las manchas están en la preparación... si se mueven indica que las marcas están en el ocular...si alejamos el condensador estas estarán mas fuera de foco

22 Comparación de los distintos tipos de microscopía óptica Autor: David R. Caprette, Ph.D. Adaptación: Nicolás Ubero Dave Caprette

23 Comparación de los tipos de microscopía óptica Campo claro Spirogyra Bacillus Amoeba proteus Campo oscuro (top) bright field (bottom) D.I.C. Contraste fases 400x D.I.C., (off axis condenser) 100x except as noted 400x 40x

24 Microscopía de campo claro Objetivo Imagen de la muestra* Campo claro muestra platina Condensador Control de diafragma Filtro de luz de día Fuente de iluminación Diámetro del campo visual *Volvox (fixed and stained)

25 Microscopía de campo oscuro Objetivo Imagen de la muestra* Campo oscuro Luz dispersat muestra Platina condensador Filtro opaco Filtro luz de día Fuente luminosa Diámetro del campo visual *yeast cells in suspension

26 Microscopía de contraste de fase Imagen proyectada Luz alterada por la muestra Objetivo (no se esquematizan todos sus componentes Membrana plasmática halo Luz no obstaculizada Condensador Diafragma anular (Fuente de luz no mostrada) Placa de fase muestra Platina Diafragma visto desde arriba plasmagel plasmasol con gránulos Vacuola allimentaria Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis pseudopodium, 400x

27 Microscopía Contraste Interdiferencial (Nomarski) Polarized light Dirección de la vibración (luz que llega al observador) a (a) (b) (c) b (a) luz blanca (no polarizada) (b) Filtro polarizador (c) Luz polarizada Amoeba proteus (100x): (a) imagen de campo claro; (b) D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el condensador

28 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro N. Ubero-Pascal Nicolás Ubero Pascal 28

29 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con campo oscuro A N. Ubero-Pascal Nicolás Ubero Pascal 29

30 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con contraste de fases B N. Ubero-Pascal Nicolás Ubero Pascal 30

31 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases C N. Ubero-Pascal Nicolás Ubero Pascal 31

32 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski D N. Ubero-Pascal Nicolás Ubero Pascal 32

33 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Créditos de las Ilustraciones / Pictures copyright Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Dirección web: Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Dirección web: Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: Light Microscopy: Instrumentation and Principles y Light Microscopy: comparison of optics, publicadas on line en. Disponible en la página web: Las figuras A, B, C y D de las páginas 29 a32 son de Nicolás Ubero Nicolás Ubero Pascal 33