UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA Nombre: QUIROZ VALENCIA ROSALBA ADRIANA Matrícula: Teléfono: Licenciatura: Biología División: Ciencias Biológicas y de la Salud Unidad: Iztapalapa Trimestre: 03-P Titulo del Proyecto de Investigación: Biología y Ecología de pequeños mamíferos. Título del Trabajo de Servicio Social: Cariotipo de Peromyscus difficilis felipensis ( RODENTIA: MURIDAE ) de una población del Estado de Oaxaca. Asesor: M en C. CAROLINA MÜDESPACHER ZIEHL. Lugar de Realización: Laboratorio de Citogenética Animal. Departamento de Biología. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa. Clave de Registro: BO43.02

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3 CARIOTIPO DE PEROMYSCUS DIFFICILIS FELIPENSIS ( RODENTIA: MURIDAE ) DE UNA POBLACIÓN DEL ESTADO DE OAXACA. INTRODUCCIÓN. El presente trabajo se realizó como complemento a los estudios de citogenética realizados anteriormente a las poblaciones de Peromyscus difficilis felipensis de los estados de Morelos y Estado de México. Considerando que esta subespecie presenta una distribución disyunta, el estudio del cariotipo de la población de Oaxaca es importante para comparar con el patrón de bandas obtenido en los estados del centro. En México se reportan 450 especies de mamíferos y es el país en América con mayor riqueza. En nuestro país están representados 10 órdenes de mamíferos terrestres y los roedores cuentan con 222 especies, por lo que constituyen el orden más diverso y mas abundante con el 50% de las especies de mamíferos aproximadamente, debido a que han tenido una radiación adaptativa muy extensa. Ceballos, et al., (1984). Peromyscus difficilis felipensis es una especie que parece estar restringida a sitios rocosos; prefiere los hábitats áridos. Se ha colectado en matorrales de tipo semidesértico, en bosques de pino, de encinos y en pastizales. Son de hábitos nocturnos, son semiarborícolas. Sus grandes pabellones auditivos les permiten captar ultrasonidos, como los que emiten los murciélagos y posiblemente también los puedan emitir. Peromyscus difficilis felipensis es herbívoro, su dieta consiste en materia vegetal, principalmente semillas, mientras que los cacomixtles, zorrillos, víboras y lechuzas son sus depredadores. Ceballos, et al., (1984). Su reproducción parece presentar dos o tres partos entre los meses de junio a noviembre, naciendo de 2 a 3 crías por parto. Su distribución ocupa el área central del país desde el sur de Chihuahua y Coahuila hasta Oaxaca. Ceballos, et al., (1984). Peromyscus difficilis felipensis es el más grande del género (longitud total mm, cola mm, pata mm, oreja mm, peso g). Aunque es muy semejante a P. truey en su coloración, cola larga y orejas grandes, sin embargo en el vientre el color es ante y la cola siempre es mayor que la cabeza y el cuerpo, lo que también lo diferencia de P. maniculatus, P. melanotis y P. aztecus. 2

4 Peromyscus difficilis felipensisi del Estado de Oaxaca. En cuanto a genética se refiere, la descripción completa de todos los pares de cromátidas que posee un tipo celular dado constituye su cariotipo. El cariotipo es propio de cada especie y se identifica por el número de cromosomas y por el tamaño y forma de éstos. Para su reconocimiento son importantes ciertas características, como la posición del centrómero y la presencia de satélites, entre otras. Los pares de cromosomas iguales, denominados homólogos, se ordenan por tamaños decrecientes. Si tienen el mismo tamaño se atiende a la posición del centrómero. La técnica de bandeo en los últimos diez años ha desarrollado procedimientos de tinción que revelan bandas discretas a lo largo de las cromátidas hermanas. Estas bandas permiten el reconocimiento de cada par de cromátidas y el apareamiento de pares homólogos que presenten modelos de bandas semejantes. Entre los muchos procedimientos de tinción que se han ideado en distintos laboratorios para producir cromosomas con bandas, los dos más usados son la técnica del Giemsa salina ácida que revela bandas-g y la técnica de la mostaza de Quinacrina, que produce las bandas-q fluorescentes. Los métodos más comúnmente usados son el bandeo G, R, C, T y Q. Los cuatro primeros utilizan el colorante Giemsa. El bandeo-g produce un patrón particular de bandas claras y oscuras, y el bandeo-r da lugar a un patrón que es inverso al del bandeo-g. El bandeo-c hace que la heterocromatina constitutiva se tiña de oscuro, mientras que en el bandeo-t tiñe las regiones teloméricas y los centrómeros. 3

5 En el bandeo-q, el uso del colorante Quinacrina produce una alternancia de bandas fluorescentes débiles y brillantes, que se pueden ver a través de un microscopio de fluorescencia ultravioleta, correspondiendo las bandas brillantes obtenidas con esta técnica a las bandas oscuras del bandeo-g. Como la posición, anchura y número de bandas difieren entre los distintos pares de cromosomas, es posible actualmente, ser mucho más certero en la identificación de determinados cromosomas. Estudiando muchas células tratadas del mismo modo, es posible dibujar un ideograma que es una representación idealizada de las bandas que aparecen recurrentemente sobre cada par de cromosomas. Cada cromosoma consiste de una serie continua de bandas. Una banda es una parte de un cromosoma claramente distinguible de sus partes adyacentes por su intensidad de color más clara o más oscura. Las bandas están ubicadas en varias regiones a lo largo de los brazos del cromosoma y estas regiones están delimitadas por marcadores específicos. Estos marcadores están definidos por características morfológicas distintas y consistentes importantes para la identificación de cromosomas. ANTECEDENTES El desarrollo de las técnicas citogenéticas permiten abordar diferentes aspectos evolutivos de las especies y subespecies (Hsu y Arrighi, 1968). El cariotipo ha sido una herramienta de gran utilidad en la resolución de múltiples problemas sistemáticos. Por ejemplo, Bowers (1974) y Bowers et al.,(1973) utilizando básicamente el cariotipo encuentran evidencia de que las poblaciones de Peromyscus maniculatus rufinus que se distribuye en las montañas de Arizona corresponden realmente a Peromyscus melanotis y no a Peromyscus maniculatus como tradicionalmente se creía. Así mismo, utilizando el cariotipo Gunn y Greenbaum (1986) corroboran que Peromyscus oreas es una especie distinta de Peromyscus maniculatus y no una subespecie de esta última. OBJETIVO GENERAL. Determinar el cariotipo de Peromyscus difficilis felipensis de la población del estado de Oaxaca para contribuir al conocimiento de la subespecie. OBJETIVO PARTICULARES. Obtener el cariotipo, bandas G y C de Peromyscus difficilis felipensis de la población del Cerro San Felipe, Oaxaca. 4

6 MATERIAL Material de Campo Trampas Sherman Brújula Altímetro Cámara fotográfica Geoposicionador Guantes Jaulas Bebederos Material del Laboratorio Microscópio Optico Leicca AxiofotZEIZ Balanza analítica Centrífuga J-500 Vortex Parrilla Cristalizadores Agitadores Jeringas Cajaspetrí Estuche de disección Porta y cubreobjetos Pipetas Pasteur. Bolsas de plástico Espátulas Tubos de ensaye Cronómetro Vasos Coplin REACTIVOS. Fosfato de sodio dibásico Na 2 HPO 4 Fosfato de potasio KH 2 PO 4 Cloruro de potasio KCl Cloruro de sodio NaCl Tripsina 0.05% Colchicina 0.01% Acido acético Metanol 70 y 90% Giemsa (MERCK) Hidróxido de bario Acido Clorhídrico HCl 0.2N Solución Salina 2XSSC METODOLOGIA. Determinación del área de trabajo. El lugar de colecta se encuentra ubicado en la Sierra Norte de Estado de Oaxaca, en el municipio de Santa Catarina Ixtepeji N y W, a una altura de 2901msnm. Se encuentra dentro del área natural protegida conocida como La Cumbre, rodeado por un extenso bosque de pino encino. Captura: Se capturaron 8 ejemplares vivos: (2 machos y 6 hembras) mediante la utilización de trampas Sherman, utilizando como sebo avena. 5

7 Transporte: Los ejemplares fueron transportados en jaulas después de haber sido capturados. Procesamiento del material: Se procesaron 8 ejemplares de Peromyscus difficilis felipensis, 6 hembras y 2 machos. Correspondientes a los números de catalogo ( 1AQV a 8AQV ).El proceso de taxidermia de los ejemplares se inició con la obtención de las medidas corporales y del peso, así como la identificación de sexo, todos los datos antes mencionados se anotaron en la etiqueta correspondiente para piel y cráneo. Obteniendo de esta forma los siguientes datos: 1 AQV AQV AQV AQV AQV AQV AQV AQV La obtención de las medidas se realizo de la siguiente forma: a) Longitud total del cuerpo: Se obtuvo de la distancia que va desde la punta de la nariz hasta la punta de la cola. b) Longitud de la cola vertebral: Se obtuvo midiendo la distancia que va desde el nacimiento de la cola vertebral hasta su extremo distal. c) Longitud de la pata posterior derecha: Se midió la distancia que va desde el talón hasta el extremo del dedo mas largo o hasta el extremo de la uña de tal dedo. d) Longitud de la oreja derecha: Se midió la distancia media entre la base inferior del trago hasta el extremo distal de la pina. Identificación: Se sexarón los ejemplares anotando el sexo al que pertenecían con los símbolos convencionales: ( ) para machos y ( ) para hembras. Se identificaron los ejemplares mediante caracteres propios de la especie, ( Peromyscus difficilis felipensis es el más grande del género presenta una longitud total mm, cola mm, pata mm, oreja mm, peso ) siguiendo para ello claves dicotómicas de identificación. 6

8 Técnica Citogenética: Considerando el peso del animal y 45 minutos antes de ser sacrificado se le inyectó de manera intraperitoneal 0.01 ml de colchicina por gramo de peso corporal. Después de transcurrido el tiempo antes mencionado se prosiguió a sacrificar al animal con cloroformo, posteriormente se tomaron las medidas de la longitud total, longitud de la cola, longitud de la pata, longitud de la oreja y peso. Una vez sacrificados los ejemplares, se realizó una incisión abdominal de la que solamente se extrajeron los huesos largos (fémur y tibia), los cuales fueron limpiados totalmente de músculo, a los huesos extraídos se les retiro la médula ósea mediante la técnica propuesta por Baker y Qumsiyeh (1988) con algunas modificaciones. Se cortó la epífisis del fémur y la tibia y por medio de una solución hipotónica de cloruro de potasio al 1% a 37 C se lavó el interior de los huesos con ayuda de una jeringa, la cual fue introducida por uno de los extremos del hueso obteniendo así la médula ósea para contenerla en un tubo de centrifuga hasta obtener un volumen de 5 ml, el cual se resuspendió con una pipeta Pasteur y se incubó de 20 a 25 minutos a 37 C, antes de iniciar el centrifugado se le agregó fijador a la suspención la cual fue centrifugada a 3000 rpm durante 5 minutos. Una vez que se obtuvo el centrifugado se retiró el sobrenadante con una pipeta Pasteur hasta dejar el botón celular, el cual presentó una coloración rojo opaco, posteriormente fue resuspendido en un vortex adicionando al mismo tiempo fijador de Carnoy (metanol acetico 3:1) gota a gota por las paredes hasta llegar a un volumen de 5 ml. Finalmente se dejó el fijador durante 20 minutos. Los pasos anteriormente mencionados fueron repetidos por tres ocasiones más para así obtener un botón celular completamente blanco. Elaboración de preparaciones: Una vez que se obtuvo la suspención del fémur y la tibia se prosiguió a la obtención de las preparaciones por medio de goteo desde una altura aproximada de 2.5 a 3 metros, dejando caer de 4 a 5 gotas, gota a gota sobre los portaobjetos, los cuales fueron previamente lavados y desengrasados. Dichos portaobjetos fueron refrigerados horas antes de realizar el goteo. Una vez terminado el goteo se pasaron las preparaciones por la flama de un mechero Bunsen y se dejaran secar al aire libre. 7

9 Tinción: Se realizaron 200 preparación con el material óseo obtenido, 25 preparaciones por ejemplar, en cada laminilla o preparación se revisaron 50 metafases. La tinción de las preparaciones en las que se encontraron células con cromosomas mitóticos; se tiñeron con Giemsa al 5% en solución de Buffer de Sorensen. Análisis de las preparaciones: Las preparaciones ya teñidas fueron revisadas en el microscópio de campo claro con objetivos de 10X, 40X y 100X, se seleccionarón de estas un número representativo de las mejores metafases de cada ejemplar, el número de ejemplares fue de 5 machos y 5 hembras para poder obtener así el número cromosómico. Obtención de fotografías: Se seleccionaron las mejores metafases a las que se les tomaron fotografías en el Axiofoto marca Zeiss con el objetivo de 100X. Elaboración del Cariotipo: Una vez obtenidas las fotografías 3x fuerón amplificadas 5 veces su tamaño, para elaborar el cariotipo correspondiente e identificar los cromosomas con los parámetros propuestos por Levan, et al (1964). OBTENCIÓN DE BANDAS G: La obtención de bandas G se realizó mediante la utilización de la técnica (de Grouchy y Turleau, 1987), con algunas modificaciones. Preparación de reactivos gr de Fosfato de sodio dibásico Na 2 HPO 4 diluido en 100 ml de agua destilada (solución 1) 0.4gr de Cloruro de sodio NaCl,. 0.1gr de Cloruro de potasio KCl de Fosfato de sodio dibásico Na 2 HPO gr de Fosfato de potasio KH 2 PO 4. Los cuatro reactivos se disuelven en 500 ml de agua destilada. (solución 2) 8

10 Tomar 50 ml de la solución 2 y se agregan 5 ml de Tripsina 0.05% Reactivo para Tinción de Bandeo. 1 ml de Giemsa, 1 ml de la solución 1, y 48 ml de agua destilada, (Agitar hasta hacer espuma) Procedimiento: Se sumergieron la preparación en PBS (buffer fosfato salino) con tripsina, durante (5.20 min.). Se lavaron las preparaciones en PBS sin tripsina Tinción en Giemsa durante (6 min). * NOTA: Los tiempos se vieron modificados por el tiempo de maduración que presentaron los cromosomas. Se seleccionaron las mejores metafases en las cuales se observaron claramente las bandas, que posteriormente fueron fotografiadas y medidas. El patrón de bandas G, se realizó con el fin de confirmar que los cromosómas están con su par correspondiente de acuerdo al número de bandas presentes. OBTENCIÓN DE BANDAS C: Se utilizo la técnica de Summer et al.,(1971) y Arrighi y Hsu (1971), las preparaciones sin teñir se dejaron reposar de 5 a 6 días. Se colocaron las preparaciones en un vaso de Coplin con HCl 0.2N durante 15 min. para remover las proteínas. El HCl se preparó cada vez que se iba a utilizar con duración de un día para su uso. Se lavó tres veces en agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Se colocaron las laminillas en un vaso de Coplin el cuál contenía una solución saturada de Hidróxido de Bario a 45ºC durante 90 o 120 segundos. El hidróxido de Bario actuó en la disociación de la eucromatina. Se pasaron las preparaciones a HCl a 0.2N para detener la acción del hidróxido de Bario Inmediatamente después se lavó tres veces con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente. Posteriormente se colocaron las laminillas en una cámara húmeda. Se colocaron 4 gotas de 2XSSC con pipeta Pasteur a lo largo de las laminillas y se les dejó caer encima un cubreobjetos. Se incubo a 60ºC durante toda la noche. 9

11 Se lavaron las laminillas en 2 vasos de Coplin durante 5 min cada uno con etanol al 70 y 95% respectivamente después de enjuagaron con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente, esto evito la formación de cristales. Las preparaciones se tiñeron con Buffer de Giemnsa al 4% durante 8 minutos, se enjuagaron levemente con agua destilada para quitar el exceso de colorante. RESULTADOS Foto metaface bandas G 10

12 Cariotipo de bandas G de Peromyscaus difficilis felipensis Idiograma de bandas G de Peromyscaus difficilis felipensis 11

13 # de crom oso P ro m P 1 Prom edio P ro m. Prom edio % del brazo % del brazo Tipo de Par m a P 1 P 2 y P 2 to ta l d e (P ) q 1 q 2 Q 1 y Q 2 to ta l d e (Q ) PB Ic D p q crom osom a M etacéntrico M etacéntrico M etacéntrico M etacéntrico Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Subtelocént Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Telocéntrico Subtelocént M etacéntrico De acuerdo a la clasificación de Levan se obtienen los siguientes pares de autosomas 2n=48 NF=76 Sexuales Metacéntricos 2 Subtelocéntricos 13 Telocéntricos 8 X Subtelocéntrico YMetacéntrico 12

14 Tabla de obtención de bandas G PAR CROMOSOMICO CROMOSOMAS NO.BANDAS NEGRAS x CROMOSOMA NO. BANDAS BLANCAS x CROMOSOMA Bandas negras 183 Bandas blancas 137 Total

15 DESCRIPCIÓN DE BANDAS G PAR 1 (9, 10) Este par es tres veces más pequeño que el par tres y es un par metacéntrico. p- 1 región 1.1 banda negra q- 3 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca ancha 1.3 banda negra delgada PAR 2 (23,3) Este par es del mismo tamaño que el par uno y es también un par metacéntrico. p-1 región 1.1 banda negra q- 3 regiones 1.1 banda negra ancha 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra moderada PAR 3 (46,48 ) Los cromosomas que forman este par son subtelocéntricos y son los más grandes que conforman el cariotipo. En este par el cromosoma 48 presenta una ligera condensación respecto al cromosoma 46. q- 10 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca moderada 1.7 banda negra ancha 1.8 banda blanca moderada 1.9 banda negra delgada 1.10 banda blanca moderada PAR 4 (8,25) Este par presenta casi el mismo tamaño que el par tres y esta conformado por cromosomas subtelocéntricos, en donde el cromosoma ocho presenta una ligera condensación en los brazos q. p-3 regiones 1.1 banda blanca ancha 1.2 banda negra delgada 1.3 banda blanca ancha q-7 regiones 1.1 banda negra ancha 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra moderada 1.6 banda blanca moderada 1.7 banda negra moderada p-3 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra ancha 14

16 PAR 5 (41,44) Este par es 1/5 más pequeño que el par tres y esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 2 regiones 1.1 banda negra ancha 1.2 banda blanca moderada q- 8 regiones 1.1 banda blanca moderada 1.2 banda negra ancha 1.3 banda blanca delgada 1.4 banda negra ancha 1.5 banda blanca delgada 1.6 banda negra delgada 1.7 banda blanca delgada 1.8 banda negra moderada PAR 6 (1,45) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 8 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca moderada 1.7 banda negra delgada 1.8 banda blanca moderada PAR 7 (4,15 ) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 8 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca moderada 1.7 banda negra delgada 1.8 banda blanca moderada PAR 8 (16,29) Este par es 1/4 más pequeño que el par tres y esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 2 regiones 1.1 banda negra ancha 1.2 banda blanca delgada q- 8 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra moderada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca delgada 1.7 banda negra muy delgada 1.8 banda blanca muy delgada PAR 9 (35,11) Este par en tamaño es similar al par 8 y esta formado por cromosomas subtelocéntricos p- 1 región 1.1 banda negra q- 5 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra moderada 1.4 banda blanca delgada 1.5 banda negra ancha 15

17 PAR 10 (2,5) Este par es del mismo tamaño que el par 9, esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 3 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra ancha PAR 11 (31,20) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 5 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra moderada PAR 12 (42,37) Este par es dos veces más pequeño el par tres y que esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 4 regiones 1.1 banda blanca moderada 1.2 banda negra delgada 1.3 banda blanca moderada 1.4 banda negra moderada PAR 13 (43,26) Este par es similar al par doce y esta formado por cromosomas subtelocéntricos. p- 1 región 1.1 banda negra q- 3 regiones 1.1 banda blanca moderada 1.2 banda negra moderada 1.3 banda blanca moderada PAR 14 (47, 18) Este par es tres veces más pequeño que el par tres y esta formado por cromosomas subtelocéntricos y es similar a los pares 12 y 13. p- 1 región 1.1 banda negra q- 6 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra muy delgada 1.4 banda blanca delgada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca moderada PAR 15 (17, 19) Este par esta conformado por cromosomas subtelocéntricos. p-1 región 1.1 banda negra q- 4 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra moderada 1.4 banda blanca delgada 16

18 PAR 16 (6, 24) Este par esta conformado por cromosomas telocéntricos y es el mas grande de este tipo. q-10 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca moderada 1.7 banda negra delgada 1.8 banda blanca moderada 1.9 banda negra delgada 1.10 banda blanca moderada PAR 17 (24, 6) Este par es 1/3 más pequeño que el par tres y esta conformado por cromosomas telocéntricos. q- 5 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra muy ancha 1.4 banda blanca delgada 1.5 banda negra moderada PAR 18 (39,7 ) Este par es un poco más pequeño que el par 17 y esta conformado por cromosomas telocéntricos. q- 5 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra moderada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra moderada PAR 19 (28,34) Este par esta conformado por cromosomas telocéntricos. q- 3 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca ancha 1.3 banda negra ancha PAR 20 (38,14) Este par es 2 veces más pequeño que el par tres y esta constituido por cromosomas telocéntricos. q- 3 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra ancha PAR 21 (21,22) Este par esta conformado por cromosomas telocéntricos y es parecido al par 20 en tamaño. q- 5 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca delgada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca delgada 1.5 banda negra delgada PAR 22 (40,36) Este par es tres veces más pequeño que el par tres y esta conformado por cromosomas telocéntricos. q- 5 regiones 1.1 banda negra delgada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra moderada 17

19 PAR 23 (12,13) Este par es similar en tamaño al par 22 y esta formado por cromosomas telocéntricos. q- 8 regiones 1.1 banda negra moderada 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra muy delgada 1.4 banda blanca delgada 1.5 banda negra muy delgada 1.6 banda blanca delgada 1.7 banda negra muy delgada 1.8 banda blanca delgada SEXUALES (27) X Este cromosoma es uno de los mas grande del cariotipo, es un cromosoma subtelocéntrico. p- 3 regiones banda blanca moderada 1.2 banda negra delgada 1.3 banda blanca ancha 1.2 banda blanca moderada 1.3 banda negra muy delgada 1.4 banda blanca moderada 1.5 banda negra delgada 1.6 banda blanca delgada 1.7 banda negra moderada 1.8 banda blanca moderada 1.9 banda negra delgada 1.10 banda blanca moderada 1.11 banda negra moderada 30 (Y) Este cromosoma es 5 veces más pequeño que el cromosoma 27 es un cromosoma metacéntrico. p- 1 región 1.1 banda negra q- 3 regiones 1.1 banda blanca ancha 1.2 banda negra moderada 1.3 banda blanca ancha q- 11 regiones 1.1 banda negra moderada 18

20 Foto bandas C Cariotipo bandas C 19

21 Ideograma bandas C DESCRIPCIÓN DE BANDAS C Utilizando la técnica de bandeo C se aprecia que la mayoría de los pares cromosómicos de Peromyscus difficilis felipensis poseen regiones de heterocromatina constitutiva centromérica ecepto el par ocho que presenta una condensación de heterocromatina en la parte intersticial y distal del brazo q. PAR 1 (38,39) Este par cromosómico metacéntrico presenta una condensación de heterocromatrina constitutiva en la región centromérica y una banda mas clara en la parte distal del brazo q. PAR 2 (37,45) Este par también metacéntrico presenta una condensación clara de heterocromatina centromérica y una condensación distal de heterocromatina más obscura en el brazo q. PAR 3 ( 8,9 ) Los cromosomas que forman este par son subtelocéntricos y presenta una condensación de heterocromatina centromérica, en el brazo p se observa una pequeña banda clara en la porción distal, mientras que en el brazo q se presentan dos bandas intersticiales y una distal. 20

22 PAR 4 (46,20) Este par formado por cromosomas subtelocéntricos presenta una condensación centromérica y una condensación en la parte distal del brazo q. PAR 5 (34,30 ) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos presenta condensación de heterocromatina centromérica, el brazo q presenta dos regiones de condensación una intersticial clara y una terminal más obscura. PAR 6 ( 6,12 ) Este par formado por cromosomas subtelocéntricos presentan condensación centromérica en mayor proporción y tres bandas de condensación en el brazo q dos intersticiales de las cuales una es mas clara y una distal también clara. PAR 7 (13,14 ) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos que presentan una condensación de heterocromatina centromérica y tres bandas intersticiales en el brazo q. PAR 8 (26,27) Este par también subtelocéntrico presenta una condensación de heterocromatima en dos regiones del brazo q una intersticial mas obscura y una mas clara en la parte distal del brazo. PAR 9 (22,48 ) Este par formado por cromosomas subtelocéntricos presenta una condensación de heterocromatina constitutiva en dos regiones una en la parte centromérica y otra en la parte distal del brazo q, ambas bandas presentan una coloración muy obscura. PAR 10 (16,24) Este par es similar al par 6 esta formado por cromosomas subtelocéntricos y presenta una condensación similar de heterocromatica ya que presenta cuatro regiones una centromérica y tres intersticiales en el brazo q. PAR 11 (32,47) Este par esta formado por cromosomas subtelocéntricos con dos zonas de condensación una centromérica de mayor tamaño y una intersticial en el brazo q. PAR 12 (36,42) Este par también formado por cromosomas subtelocéntricos presenta una condensación de heterocromatina centromérica que abarca todo el brazo p y dos zonas mas delgadas de condensación en la parte casi distal del brazo q. 21

23 PAR 13 (43,23) Este par constituido por cromosomas subtelocéntricos presenta dos zonas de condensación de la heterocromatina constitutiva una en la región centromérica y otra en la parte distal del brazo q. PAR 14 ( 2,44 ) Este par formado por cromosomas subtelocéntricos y es similar al par 13 ya que presenta dos regiones de condensación de la heterocromatina una centromérica y una distal.. PAR 15 (17, 19) Este par esta conformado por cromosomas subtelocéntricos es similar al par 11 con dos zonas de condensación una centromérica de mayor tamaño y una intersticial en el brazo q. PAR 16 (4,11) Este par formado por cromosomas telocéntricos presenta tres zonas de condensacion de la heterocromatina una centromérica de mayor amplitud y dos intersticiales. PAR 17 (3, 5) Este par formado por cromosomas telocentricos presenta dos secciones de condensación una centromérica y una intersticial. PAR 18 (7,1 ) Este par es similar el par 17 presenta dos secciones de condensación una centromérica y una intersticial. PAR 19 (18,41) Este par esta formado por cromosomas telocéntricos presenta tres zonas de condensación de la heterocromatica constitutiva una región centromérica, una intersticial y una distal. PAR 20 (35,15) Este constituido por cromosomas telocéntricos presenta una condensación de heterocromatina en la región centromérica del cromosoma. PAR 21 (19,10) Este par similar al par 17 y18 esta conformado por cromosomas telocéntricos, presenta dos secciones de condensación de la heterocromatina una centromérica y una intersticial. PAR 22 (40,36) Este par esta conformado por cromosomas telocéntricos, los cuales presentan dos secciones de condensación de la heterocromatina una sección centromérica y una terminal. 22

24 PAR 23 (29,31) Este par es similar al par 21 esta formado por cromosomas telocéntricos y presenta dos secciones de condensación una centromérica y una intersticial. SEXUALES (25) X Este cromosoma es el mas grande y es un cromosoma subtelocéntrico el cual presenta varios puntos de condensación de la heterocromatina, uno en la parte terminal del brazo p, otro en la región centromérica, tres en la zona intersticial del brazo q y uno mas en la zona distal de este mismo brazo. 28 (Y) Este cromosoma es metacéntrico y presenta dos zonas de condensación de la heterocromatina una centromérica y otro intersticial en el brazo q. 23

25 TABLA DE OBTENCIÓN DE BANDAS C PAR CROMOSOMICO CROMOSOMAS SITIO DE CONDENSACION DE LA HETEROCROMATINA centromérica y distal Centromérica y distal Centromérica, distal e intersticial Centromérica y distal Centromérica, intersticial y distal centromérica, intersticial y distal centromérica e intersticial intersticial y distal centromérica y distal centromérica e intersticial centromérica e intersticial centromérica e intersticial Centromérica y distal centromérica e intersticial centromérica e intersticial centromérica e intersticial centromérica e intersticial centromérica e intersticial centromérica,intersticial y distal centromérica centromérica e intersticial centromérica y distal centromérica e intersticial centromérica, distal e intersticial - 28 centromérica e intersticial 24

26 TABLA QUE PRESENTA EN NÚMERO DE BANDAS C POR CROMOSOMA. # PAR CROMOSOMICO # BANDAS DE CONDENSACION x CROMOSOMA Cromosoma X 6 Cromosoma Y 2 69 No. de bandas obtenidas en el complemento haploide # Bandas x cromosoma 61 x 2 = 122 # Bandas en cromosomas sexuales =

27 DISCUSIÓN El análisis de datos obtenidos 2n=48 y FN= para Peromyscus difficilis felipensis de Oaxaca muestra que esta población cae dentro del patrón cariotípico propuesto por Hsu y Arrighi (1968). Las bandas obtenidas con la técnica de bandeo G caen dentro del patrón de bandas descrita por Greenbaum, et al (1994) para este género. Al realizar dicha técnica se pudo observar que los tiempos de tripsina se modifican de acuerdo al tiempo de maduración que presentan los cromosomas. También se pudo observar que la longitud de algunos cromosomas pares presenta variacion longitudinal, por la posible condensación de la cromatina constitutiva (eucromatina). Los resultados en la técnica de bandeado C, muestran una condensación de heterocromatina constitutiva hacia la región centroamérica en la mayoría de los autosomas, similar a la que presentan las subespecies de heteromidos Chaetodipus spinatus lambi, C.s. bryanti, C.s. brocus y C.s. peninsulae descritos por González (2002). CONCLUSIÓN El análisis de resultados muestra que el cariotipo de Peromyscus difificilis felipensis del estado de Oaxaca consta de 2n= 48 FN=76 además presenta un patrón de bandas característico de la especie ya que el número de bandas G consta de 183 bandas obscuras y 137 bandas blancas, obteniendo así un total de 320 bandas según los resultados obtenidos. Los cuales caen dentro del rango descrito por Greenbaum (1994). Lo anterior nos permite suponer que dicha subespecie no ha sufrido variación genética a pesar de la alteración de su hábitat natural. En cuanto a la técnica de bandeo C se observo una condensación de heterocromatina en la región centromérica de la mayoría de los pares, y el numero total de bandas C es de 130 para el complemento haploide. Derivado de estos resultados se determina que el cariotipo de bandas C es de carácter centromérico. 26

28 BIBLIOGRAFÍA Allard, M.W., S.J. Gunn e I.F. Greenbaum Mensural discrimination of chromosomally characterized Peromyscus oreas and P. manicualtus. Journal of Mammalogy. 68: Baker, R.J. y M.B. Qumsiyeh Methods in chiropteran mitotic chromosomal studies. Pp , in Ecological and behhavioral methods for the study of bats (T.H. Kunz, ed.), Smithsonian Institution Press. Washington, D.C. London. 530 Carleton, M.D.1989.Systematics. G. L. Kirkland y J.N. Layne, Eds Advances in the study of Peromyscus. Special Publication of the American Society of Mammalogists Ceballos G. G. y C. Galindo Leal Mamíferos silvestres de la Cuenca de México. Editorial Limusa Gonzalez,M. R Tesis: Comparación Aloenzimatica y Cromosómica entre poblaciones de Chaetodipus spinatus (Rodentia: Heteromyde). Facultad de Ciencias UNAM. Glazier, D.S Ecological shifts and the evolution of geografical restricted species of North American Peromyscus (mice). Journal of Biogeography. 7:63-83 Gunn, S.J. and I.F. Grennbaum Systematic implications of karyiotipic in mainland Peromyscus from the Pacific Northwest. Journal of Mammalogy. 67: Greenbaum, I. F, S. J Gun et al Cytogenetic nomenclature of deer mice, Peromyscus (Rodentia): Revision and review of the standardized kariotype. Cytogenet Cell Genet. 66: Greenbaum,I.F.,and R.J. Baker 1978.Determination of the primitive Karyotype of Peromyscus. J.Mamm.59:

29 Hsu,T.C. y F.E. Arrighi Chromosomes of Peromyscus (Rodentia, Cricetidae) I. Evolutionary trends in 20 species. Cytogenetics Levan,A., K Fredga y A.Sanbderg.1964.Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, 52: Osgood, W.H Revision of the mice of the American genus Peromyscus. North American Fauna. 28:1-285 Patton, J.L Chromosome studies of certain pocket-mice genus Peromyscus (Rodentia: Heteromydae). Journal of Mammalogy. 48:27-37 Stangl,Jr.,F.B y R.J.Baker A chromosomal subdivision in Peromyscus leucopus: Implications for the subspecies concept as applied to mammals pp. In Festschrift for Walter W. Dalquest in honor of his sixty-sixth birthday. (N.N.Horner,Ed ) 28