1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Transcripción

1 INTRODUCCION Esta monografía tiene como objetivo presentar los lineamientos, conforme a lo establecido por la Pontificia Universidad Javeriana para optar al título de Especialista de Laboratorio Clínico, de la investigación cuyo tema es la medición de marcadores inmunológicos en el diagnostico de diabetes autoinmune. De esta forma, el desarrollo temático de la monografía, se presenta de manera tal que se permita una comprensión en los mecanismos subyacentes de la diabetes mellitus tipo 1a como una enfermedad autoinmune y los métodos diagnósticos disponibles. Para la ejecución de la misma, se realizó una revisión de la literatura que reúne los últimos conocimientos sobre diabetes, haciendo especial énfasis en la determinación de autoanticuerpos para el diagnóstico, clasificación y seguimiento de pacientes con diabetes tipo 1a. 9

2 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1 FORMULACION DEL PROBLEMA La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica, que afecta aproximadamente a 16 millones de personas en el mundo. Se caracteriza por desordenes en el metabolismo de carbohidratos, conllevando a un estado de hiperglicemia y el desarrollo de complicaciones en muchas funciones vitales. De acuerdo a la clasificación ofrecida por la Asociación Americana de Diabetes (Winter, 2002) la diabetes la podemos encontrar como tipo 1 (insulinodependiente), tipo 2 (no insulinodependiente) y otros tipos específicos de diabetes. A su vez la diabetes tipo 1 puede subclasificarse en autoinmune (1a) o idiopatica (tipo 1b). La diabetes tipo 1a se relaciona con la presencia de infiltración linfocítica de las células de los islotes y autoanticuerpos contra una variedad de antigenos de estas células antes que la enfermedad sea evidente clínicamente. Estos antigenos incluyen la descarboxilasa ácido glutamica (GAD), IA-2 e Insulina (IAA). 1.2 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA El interrogante surge cuando se desea saber si la medición de dichos autoanticuerpos ofrecen utilidad y confianza para el diagnóstico de diabetes autoinmune, y si su detección en individuos no diabéticos indica un riesgo incrementado de desarrollo de diabetes tipo 1. 10

3 2. JUSTIFICACION En la diabetes tipo 1a, la deficiencia de insulina se debe a la destrucción de las células beta pancreáticas por autoanticuerpos. Las manifestaciones clínicas de diabetes no ocurre hasta que un gran porcentaje de estas células han sido destruidas. El periodo presente entre la producción de autoanticuerpos y el desarrollo de la enfermedad clínica puede ser usado para la predicción y prevención de la enfermedad. En un futuro, cuando existan terapias preventivas disponibles para diabetes tipo 1, el tamizaje de autoanticuerpos contra islotes, en la población pediátrica podría ser considerada para considerar aquellos en riesgo. 11

4 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la utilidad de la medición de autoanticuerpos en el diagnostico, clasificación y seguimiento de diabetes tipo 1a. 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS - Revisar las principales características de la diabetes, teniendo en cuenta su definición, criterios de clasificación, origen, etiología, historia natural, y la presencia de autoanticuerpos con sus correspondientes métodos diagnósticos. - Describir los principales marcadores inmunológicos descritos en la literatura presentes en la diabetes tipo 1a. 12

5 4. MARCO DE REFERENCIA 4.1 GENERALIDADES SOBRE DIABETES La Diabetes mellitus comprende una familia de desordenes del metabolismo de carbohidratos que se caracterizan por hiperglicemia y el desarrollo a largo plazo de complicaciones macrovasculares, microvasculares y neuropáticas (Winter, 2002). En Enero de 2005, la Asociación Americana de Diabetes (ADA) reviso la clasificación de diabetes, siendo clasificada como diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, otros tipos específicos de diabetes (ej. diabetes secundaria), o diabetes gestacional. Tabla 1. Clasificación de diabetes mellitus I. Diabetes tipo 1 A. Mediada por inmunidad B. Idiopática II. Diabetes tipo 2 III. Otros tipos específicos A. Defectos geneticos de la funcion de las celulas β : Cromosoma 12, HNF-1α (MODY3), Cromosoma 7, glucokinase (MODY2), Cromosoma 20, HNF-4α (MODY1), Cromosoma 13, insulin promoter factor-1 (IPF-1; MODY4), Cromosoma 17, HNF-1β (MODY5), Cromosoma 2, NeuroD1 (MODY6), DNA Mitocondrial, Otros B. Defectos genéticos en la accion de la insulina Resistencia a Insulina Tipo A, Leprechaunismo, Síndrome Rabson-Mendenhall, Diabetes Lipoatrófica, Otros C. Enfermedades del pancreas exocrino : Pancreatitis, Trauma/pancreatectomía, Neoplasia, Fibrosis Quística, Hemocromatosis, Pancreatopatia Fibrocalcular, Otros D. Endocrinopatías : Acromegalia, Síndrome de Cushing, Glucagonoma, Feocromocitoma, Hipertiroidismo, Somatostatinoma, Aldosteronoma, Otros 13

6 E. Inducida por drogas o químicos : Vacor, Pentamidina, Acido Nicotínico, Glucocorticoides, Hormona Tiroidea, Diazoxide, Agonistas β-adrenergicos, Tiazidas, Dilantin, α-interferón, Otros F. Infecciones : Rubeola Congénita, Citomegalovirus, Otros G. Formas no comunes de diabetes : Sindrome Stiff-man, Anticuerpos Anti receptor de insulina, Otros H. H. Otros sindromes genéticos algunas veces asociados con diabetes : Sindrome de Down, Sindrome de Klinefelter, Sindrome de Turner, Sindrome de Wolfram, Ataxia Friedreich, Corea de Huntington, Sindrome de Laurence-Moon-Biedl, Distrofia Miotónica, Porfiria, Sindrome de Prader- Willi, Otros IV. GDM (Diabetes Mellitus Gestacional) American Diabetes Association, De acuerdo a la publicación del Comité de Expertos en Diabetes mellitus de la Organización Mundial de la Salud del 2003, se enumerarán los criterios para que un paciente sea considerado diabético de acuerdo a las mediciones de glucosa plasmáticas. Tabla 2. Criterios Clasificación Diabetes Criterios Glucosa plasmática en ayunas: Diabetes Intolerancia a la glucosa 126 mg/dl Valores mg/dl Test Tolerancia Oral a la Glucosa (75 g) (OGTT): Diabetes Intolerancia a la glucosa 126 mg/dl mg/dl Los síntomas incluyen perdida de peso, sed excesiva, poliuria, letargia y ocasionalmente dolor abdominal. 14

7 La diabetes tipo 1, también conocida como diabetes juvenil (debido al inicio temprano) o diabetes mellitus insulino-dependiente (debido a la necesidad clínica de insulina), es subclasificada como diabetes tipo 1 autoinmune (tipo 1a) o diabetes tipo 1 idiopatica (tipo 1b), lo que las diferencia es la presencia o no de autoanticuerpos contra los islotes (Notkins, 2001) (Winter, 2002). La diabetes tipo 1a es una enfermedad de origen multifactorial, donde el sistema inmune juega un papel importante en su patogénesis; debido a la destrucción autoinmune de las células β de los islotes de Langerhans en el páncreas, la producción de insulina disminuye y esto es lo que conlleva finalmente a la presentación clínica de la enfermedad. En el periodo en que son evidentes los síntomas clínicos, 80-90% de las células β han sido destruidas. Las células que secretan glucagon, somatostatina, y polipéptido pancreático generalmente se preservan y se distribuyen dentro de los islotes. La insulitis, es un infiltrado inflamatorio con un gran número de células mononucleares y células T CD8 (Notkins, 2001). Un grupo de individuos presentan diabetes clínica en la edad adulta sin necesidad de suplemento de insulina, siendo inicialmente clasificados en el grupo de pacientes con diabetes tipo 2. Estos pacientes, pueden presentar un proceso autoinmune similar a la diabetes tipo 1a, con susceptibilidad genética HLA así como autoanticuerpos contra antigenos de los islotes, secreción de insulina baja, y una alta tasa de progresión a la dependencia de insulina. Quienes presentan estas características son catalogados dentro de un grupo de pacientes con diabetes autoinmune latente del adulto o LADA (Pozzilli, 2001). 15

8 4.2 ETIOLOGIA La diabetes mellitus tipo 1 tiene un amplio componente genético debido a la alta tasa de transmisión familiar: el pariente de un diabético tiene aproximadamente un 7% de riesgo de desarrollar la enfermedad, y a su vez el hijo de un diabético tiene un 6% (Bach, 1994). Han sido identificados diversos factores genéticos indicadores de susceptibilidad, entre ellos encontramos haplotipos del antigeno HLA como DRBI*03-DQAI DQBI*0201 (DR3-DQ2), DRBI*04-DQAI*0301-DQB1*0302 (DR4-DQ8) o MICA5 y MICA 5.1 (Falorni, 2005). Es bien conocido que estudios en gemelos idénticos demuestran una tasa de concordancia menor del 50%, soportando el hecho de que aunque algunos genes son importantes, los factores ambientales pueden ser aún más importantes. Se sabe que la diabetes tipo 1 puede desarrollarse en conjunto con ciertas infecciones virales. De esta forma, se especula que la combinación de genes de susceptibilidad con factores ambientales son importantes en el desarrollo de diabetes tipo 1 (Lenmark, 1999). La naturaleza de los factores ambientales no esta muy bien esclarecida pero han sido implicados factores de la dieta incluyendo exposición temprana a leche de vaca y virus, especialmente enterovirus (Schmidt, 2005). De acuerdo a estudios prospectivos realizados en niños desde su nacimiento, estudio BABYDIAB por Zyegler y Colegas y el estudio DAISY (estudio de diabetes autoinmune en jóvenes) por Norris y colegas, se describe una relación entre la dieta temprana en niños y el desarrollo de autoanticuerpos contra las células de los islotes pancreáticos. Ambos estudios concuerdan en que la edad del inicio de la alimentación con cereal es un factor importante en el riesgo de desarrollar 16

9 diabetes tipo 1; en cambio, el consumo de leche de vaca en temprana edad no es un factor concluyente en el desarrollo de diabetes tipo 1. Los reportes de estos estudios deben ser muy bien interpretados, debido a que en lugar de planear otro tipo de dieta en los niños se debe observar otros aspectos subyacentes al desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo el hecho de que algunos mediadores ambientales (enterovirales o dieta) tienen en común el ser influenciados por la inmunidad del intestino (Atkinson, 2003). 4.3 INCIDENCIA La diabetes mellitus tipo 1 es una de las enfermedades crónicas mas comunes de la niñez y es diagnosticada en aproximadamente % de los niños. Sin embargo, los signos clínicos de la diabetes mellitus tipo 1 puede aparecer a cualquier edad. La insulitis se presenta en muchos pacientes en el momento del diagnostico clínico (Falorni, 2004). La diabetes mellitus tipo 1 es mas frecuente en sujetos afectados con otras enfermedades autoinmunes tales como tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, gastritis atrófica o enfermedad de Addison que en la población general (Falorni, 2004). 4.4 HISTORIA NATURAL DE LA ENFERMEDAD El modelo que mas se acomoda a la explicación de la historia natural de la enfermedad es el realizado por George Eisenbarth en Este modelo postula que en individuos con predisposición genética a diabetes tipo 1, las interacciones entre genes con factores ambientales pueden disparar el proceso autoinmune. La autoinmunidad es reconocida primero por la detección de autoanticuerpos antiislotes. En los estadios tardíos de la enfermedad, cuando gran cantidad de células β han sido destruidas, se evidencia intolerancia a la glucosa, diabetes 17

10 manifiesta, y eventual perdida de las células β y la función del péptido C (Atkinson, 2005). Figura 1. Pérdida progresiva de la masa de células en la historia natural de diabetes tipo 1. Winter, 2002 Aun quedan vacíos en este modelo, debido a diferentes aspectos a tener en cuenta: no se conoce la masa de células β exacta en el momento del nacimiento; se ha encontrado alta susceptibilidad genética con relación a genes del CMH tipo II pero baja o población dependiente con genes de Insulina y moléculas CD 152; no se conocen con exactitud cuales agentes infecciosos están involucrados, cuando y como actúan; no se conoce si la perdida de masa de células beta es de tipo linear o tiene periodos de mejoría (Atkinson, 2005). En términos de agentes ambientales en lugar de considerar un evento ambiental precipitante individual, es más adecuado considerar que el medio ambiente dispara y los reguladores del desarrollo de la enfermedad actúan a través del 18

11 periodo previo al inicio de la enfermedad. El impacto cualitativo y cuantitativo del medio ambiente juega un papel en el desarrollo de la diabetes tipo 1. Otra nueva faceta para considerar es la disregulación inmune. Las evidencias mas recientes sugieren que el compromiso en la regulación propia de las respuestas inmunes autoreactivas y protectoras pueden resultar de actividades anormales de la población de células T conocidas como células T reguladoras, las cuales se distinguen por la expresión de la molécula CD25. En términos de marcadores inmunes humorales, mas que considerar los ICAS como el primer componente de la respuesta inmune humoral, la mayoría de estudios han sugerido que los anticuerpos contra la molécula de insulina por si misma representa el primer anticuerpo que es reconocido en la patogénesis de la diabetes tipo 1. La pendiente de la perdida de la masa de células beta, varia dramáticamente basada en el tipo de insulitis, la susceptibilidad de las células beta a la destrucción, y la capacidad de aquellas células β de repararse y regenerarse (Atkinson, 2005). 4.5 PATOGENESIS DE LA DIABETES TIPO I EN HUMANOS La pregunta frecuente que se realizan los investigadores es acerca de como se pierde la tolerancia fisiológica a los auto-antigenos presentes en las células β en sujetos diabéticos, conllevando a un proceso patogénico mediado por células T (Bach, 1994). Los dos modelos animales más usados en el estudio de diabetes son el ratón NOD (en inglés, nonobese diabetic mouse) y la rata BB (BioBreeding) (Bach, 1994) (Notkins, 2001). Aunque existe amplia información sobre la patogénesis de la enfermedad autoinmune en estos modelos, hay poca información directa de la patogénesis de la diabetes tipo 1 en humanos. De hecho, muchas de nuestras ideas acerca de la patogénesis de la diabetes tipo I en humanos son el resultado de la extrapolación con roedores (Notkins, 2001). 19

12 La interacción inicial de genes y factores ambientales parece disparar una respuesta mediada por el sistema inmune, el tipo de HLA del individuo puede controlar el reconocimiento de ciertos autoantigenos, con la aparición de diferentes autoanticuerpos como el primer signo de destrucción de la célula β (Notkins, 2001). Los marcadores más importantes de autoinmunidad contra las células β son autoanticuerpos contra insulina (IAA), descarboxilasa del ácido glutámico (GAD65) y antigeno-2 de células de los islotes (IA-2) (Lenmark, 1999). La progresión a una diabetes clínica, es disparada por el desarrollo de un fenotipo de células T más agresivo y un cambio en el balance de Th1 a Th2, produciendo un fondo más inflamatorio. Técnicas morfológicas muestran una disminución marcada de las células β con el tiempo, consistente con una inflamación autoinmune, probablemente dirigida por macrófagos y linfocitos que circundan e infiltran los islotes. Debido a las pocas células pancreáticas viables restantes, la información disponible es limitada sobre la naturaleza y función de estas células. Las células CD8 parecen predominar, pero ni la proporción de células CD4 y CD8, ni la significancia de otros tipos celulares en el infiltrado (ej. células natural killer macrófagos, células dendríticas) es conocido. Más aún, la proporción de células CD4 o CD8 especificas para GAD/IA-2/insulina no esta bien definido (Notkins, 2001). La expresión de moléculas Fas-Fas Ligando, en células T citotóxicas, también favorece la presentación clínica de la diabetes. La evaluación de los islotes durante la insulitis sugiere que la apoptosis mediada por Fas ocurre y proporciona un posible mecanismo de destrucción de las células β. Recientemente, se está prestando mayor atención a algunos subgrupos de células T reguladoras, las cuáles han mostrado capacidad para controlar el desarrollo de la patología. 20

13 El papel de diferentes citoquinas tanto proinflamatorias como anti-inflamatorias se está estudiando en la enfermedad, con el fin de convertirse en posibles blancos terapéuticos. Un gran número de citoquinas están involucradas en la diferenciación y activación de las células T que contribuyen a la patogénesis de la DMT1a. De esta manera se ha demostrado la utilidad del bloqueo de citoquinas patogénicas como IFN-γ (interferón-gama), receptor de IL-2 (IL: interleuquina) o IL- 12. También se ha demostrado prevención en animales, con bloqueo de citoquinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 o TNF-α. El uso de citoquinas con propiedades regulatorias, como IL-4, IL-10 e IL-13 entre otras ha mostrado utilidad en retardar la progresión de la patología. 4.6 AUTOANTICUERPOS EN DIABETES TIPO 1A Los anticuerpos contra antígenos propios, llamados autoanticuerpos, pueden ser detectados en el suero de pacientes con diabetes tipo 1, y esto ha sido usado como una ayuda en el diagnostico, clasificación y predicción de la enfermedad (Schmidt, 2005). Los autoanticuerpos pueden ser detectados incluso durante la fase prodrómica, como en el caso de la diabetes tipo 1a, durante la cual no existen síntomas clínicos, pero se esta llevando a cabo una destrucción de las células secretoras de insulina (Leslie et al, 2001). Estudios usando estos autoanticuerpos en diabetes tipo 1 han conducido a un grupo de principios los cuales son relevantes a las enfermedades autoinmunes en general (Schmidt, 2005). 21

14 Los anticuerpos pueden reflejar la presencia, naturaleza, e intensidad de la respuesta inmune. Es posible usar autoanticuerpos como marcadores de actividad de enfermedad. 4.7 UTILIDAD DE LA MEDICION DE AUTOANTICUERPOS Clasificación de la enfermedad También la medición de autoanticuerpos pueden ayudar a definir la naturaleza de la diabetes, proveyendo marcadores para clasificarla en autoinume o no (Leslie et al, 2001), basada en la presencia o ausencia de anticuerpos asociados a enfermedad. Una proporción de adultos que presentan diabetes no dependiente de insulina, clasificados aparentemente como diabetes tipo 2, han demostrado tener un anticuerpo contra la descarboxilasa del acido glutamico (GAD) y además tienen un proceso genético, inmunológico y metabólico diferente en comparación de aquellos pacientes que no requieren insulina y que no presentan anticuerpos contra GAD (Schmidt, 2005). Esta observación significa en términos prácticos que aquellos pacientes con diabetes no insulinodependiente tienen un alto riesgo de progresión a terapia con insulina dentro de los seis años siguientes al diagnostico (Schmidt, 2005) Actividad de la enfermedad Aunque los autoanticuerpos asociados con diabetes, pueden reflejar la presencia del proceso de la enfermedad, no hay evidencia que ellos causan la enfermedad, sin embargo, ellos son mejores marcadores predictivos que los genes de alto riesgo. Puede predecirse la tasa de progresión de la enfermedad de aquellos 22

15 pacientes con combinaciones de autoanticuerpos o con autoanticuerpos IA-2 que progresan mas rápidamente (Schmidt, 2005) Marcadores predictivos Debido a que los autoanticuerpos son marcadores de actividad de la enfermedad, también bajo ciertas circunstancias pueden ser usados como predictores de enfermedad. Esto es prometedor, especialmente para aquellas enfermedades como la diabetes tipo 1a que tiene un amplio periodo preclínico, ya que el objetivo de la predicción es la prevención. La prevención podría realizarse evitando aquellos factores ambientales que dispararían la enfermedad (prevención primaria) o con el uso de terapias que modularan el proceso destructivo antes de la aparición de los signos clínicos (prevención secundaria) (Leslie et al, 2001). Tres parámetros deben ser cuidadosamente cuantificados para que los ensayos predictivos sean clínicamente útiles: sensibilidad de predicción, especificidad de predicción, y valores predictivos positivos (Leslie et al, 2001). Sensibilidad de predicción: es calculada dividiendo el número de sujetos en una cohorte con autoanticuerpos quienes desarrollan la enfermedad por el número general de sujetos que desarrollan la enfermedad. Idealmente, cada sujeto que desarrolla una enfermedad autoinmune deberá presentar este autoanticuerpo particular (alta sensibilidad de enfermedad) antes del diagnóstico clínico (Schmidt, 2005). Sin embargo, ya que los autoanticuerpos asociados a la enfermedad no se desarrollan simultáneamente y debido a que muchos pacientes tienen solamente un autoanticuerpo antigeno-especifico; usando un panel de diferentes autoanticuerpos se puede aumentar la sensibilidad de predicción (Leslie et al, 2001). 23

16 Especificidad de predicción: como un marcador autoinmune refleja la oportunidad de que una persona con el marcador no va a presentar la enfermedad. Este es calculado dividiendo el número de sujetos en una cohorte sin el marcador de autoinmunidad quien no desarrollara la enfermedad por el número total de sujetos quienes no desarrollaran la enfermedad. La especificidad es importante si un marcador de enfermedad se usará para identificar individuos que pueden necesitar consejería o terapia para prevenir el desarrollo de la enfermedad. Una relación recíproca existe entre sensibilidad y especificidad (Leslie et al, 2001). Si un autoanticuerpo es usado para predecir la enfermedad, idealmente cada sujeto con el anticuerpo, pero sin sintomatología, eventualmente desarrollará la enfermedad clínica. Esto quiere decir, que el ensayo podría mostrar un alto valor predictivo para desarrollar la enfermedad. El valor predictivo positivo es calculado dividiendo el número de sujetos con anticuerpos positivos en la muestra inicial quienes desarrollan la enfermedad por el número general de sujetos positivos para anticuerpos. La significancia pronostica de algún marcador varia en la población en diferentes niveles de riesgo. Si el riesgo de enfermedad es alto luego el valor predictivo puede ser alto, pero cuando el riesgo de la enfermedad es bajo, como en la población en general, luego hay una reducción correspondiente en el poder predictivo (Leslie et al, 2001) Predicción de diabetes tipo 1 Es posible tamizar a la población general con distintos autoanticuerpos, para identificar individuos en alto riesgo de desarrollar la enfermedad; de esta forma, ofrecer una terapia para prevenir la progresión a la enfermedad clínica o para limitar las consecuencias y el impacto de la enfermedad. El principal interrogante es la edad ideal o intervalos en los que se debe realizar el tamizaje de autoanticuerpos para lograr el máximo valor predictivo de sensibilidad 24

17 y especificidad. Los autoanticuerpos presentes en diabetes tipo 1 pueden aparecer a los 5 años de edad, los IAA son más prevalentes en los niños jóvenes y más raros en los adultos pero están presentes máximo hasta los 14 años de edad, de esta forma el tamizaje debe realizarse al nacimiento y repetirse a diferentes intervalos después. Una fracción significativa puede ser obviada cuando el tamizaje se realiza en infantes solamente (Schmidt, 2005). La presencia de diferentes autoanticuerpos relacionados con diabetes ocurre secuencialmente en el curso de la enfermedad y la interpretación de los distintos grupos de anticuerpos debe ser diferente dependiendo de la edad del individuo (Schmidt, 2005). Un estudio en pacientes con diabetes tipo 1 recientemente diagnosticada, demostró la presencia de múltiples autoanticuerpos en 60% de los pacientes menores de 16 años pero en solamente 37% de los casos de pacientes mayores. La detección de una combinación de autoanticuerpos relacionados con diabetes es menos valiosa en el tamizaje en adultos comparada con niños (Schmidt, 2005). Así que un test inicial altamente sensible como ICA o genes HLA, puede ser realizado, seguido por ensayos mas específicos los cuales pueden ser repetidos en diferentes intervalos (Schmidt, 2005). En miembros familiares (aquellos con un riesgo genético alto), el tamizaje con anticuerpos anti islotes (ICAs), tiene una alta sensibilidad para predecir diabetes, pero solamente aquellos individuos con diversos autoanticuerpos contra las células β parecen progresar a la enfermedad. La presencia sérica de autoanticuerpos contra cualquiera de estos antígenos (GAD, IAA, IA-2) de las células β esta asociada con la progresión a diabetes clínica en un 2 15% de los familiares de un paciente con diabetes tipo 1a. Sin embargo, si están presentes los tres autoanticuerpos, el riesgo a diez años de presentar la enfermedad se 25

18 incrementa a un %, con una sensibilidad del 80-90% (Editorial: Toward Precise Forecasting of Autoimmune Endocrinopathy, 2004). 4.8 MEDICION DE AUTOANTICUERPOS EN DIABETES TIPO 1 Muchos autoanticuerpos han sido detectados en el inicio de la diabetes tipo 1. De acuerdo a su descubrimiento, se numerarán en orden cronológico: Tabla 3. Autoanticuerpos en diabetes 1a 1970s Autoanticuerpos contra las células de los islotes (ICAs) Autoanticuerpos contra la superficie de las células de los islotes (ICSAs) 1980s Autoanticuerpos anti-insulina (IAAs), 64-kDa (64 KAs), receptor de insulina, carboxipeptidasa-h, proteínas de choque térmico 1990s Autoanticuerpos 64-kDa (64 KAs) = Descarboxilasa del ácido glutámico (GADAs) Autoanticuerpos contra islotes: 51-kDa descarboxilasa aromatica-lamino-acida, 30 kda quimiotripsinogeno, DNA topoisomerasa II, glima 38, GLUT2, glicolipidos, GM2-1 gangliosido, IA-2, IA-2β, ICA69, proinsulina, y 52-kDa RIN (insulinoma de rata). WINTER, William E. et al., 2002 La descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), la molecula similar a la familia de las tirosin fosfatasas (IA-2) e insulina son los principales autoantigenos en diabetes tipo 1. Estos autoanticuerpos han sido usados para estudiar la actividad de la enfermedad, determinar la tasa de progresión de la enfermedad, y ayuda a clasificar y predecir la enfermedad clínica. La aparición de los autoanticuerpos en niños jovenes conduce a la propuesta que la diabetes tipo 1 es inducida en la vida 26

19 tempranamente. Estudios de autoanticuerpos durante el periodo prediabetico mostraron variabilidad en la tasa de progresión de la diabetes clínica basados en el título y número de anticuerpos. (Leslie et al, 2001) ICAs Los ICAs fueron descritos por primera vez en 1974 y han representado el gold estandard para analisis de autoanticuerpos por muchos años (Falorni, 2005). Los ICAs son detectados por inmunofluorescencia indirecta usando páncreas humanos obtenidos de donadores de tipo sanguíneo O como sustrato (Greenbaum, 2003). Los ICAs son autoanticuerpos policlonales que reaccionan con todas las células del islote (ej. α, β, γ, δ), y se han encontrado dos patrones de tinción. En uno de ellos, las células beta son las fluorescentes (selectivo para células beta o ICA restrictivos). En el otro patrón el islote completo brilla (ICA de islote completo). Al parecer este patrón se encuentra más vinculado con la diabetes de tipo 1 (Greenbaum, 2003). Los antígenos contra los cuales ICA reacciona son múltiples e incluyen GAD, ICA512 (IA-2), glicoesfingolípidos, y otros (Atkinson, 2005). Los anticuerpos contra células de los islotes, constituye un buen marcador de autoinmunidad en diabetes, el cual puede ser detectado en los niños en el momento de diagnostico de la enfermedad (Borg, 1997). En un principio fue difícil estandarizar el análisis, debido a la mezcla de antígenos que participan en la reacción de estos anticuerpos o a la variabilidad de un páncreas a otro. Además, es de un trabajo intensivo y no es automatizado, requiere de un alto nivel de aseguramiento de calidad y control de calidad para producir resultados confiables y precisos (Greenbaum, 2003). Por esto en el primer taller de inmunología de la diabetes en 1985, fue identificado un estandar mundial JDF (Juvenil Diabetes Foundation), que permite la expresión de los ICAs 27

20 en unidades comunes. Esto ha conllevado a una dramática reducción en la variación interlaboratorios, a pesar de la influencia de numerosos factores tales como la subjetividad de la interpretación de los resultados y la variabilidad de la reacción de ICA en relación con el páncreas usado en el ensayo. En niños con diabetes mellitus tipo 1, la sensibilidad diagnostica de los ICAs es de 70-90% (Borg, 1997) (Falorni, 2005).. En el inicio de diabetes mellitus tipo 1 en adultos, los ICAs tienen un valor de sensibilidad diagnostica ligeramente menor. La especificidad de ICAs para diabetes mellitus tipo 1 es de aproximadamente 96-98%, estos autoanticuerpos pueden encontrarse en un 2-4% en pacientes sanos. El valor predictivo de ICA para diabetes mellitus tipo 1 en la población general es bajo debido a que la prevalencia de diabetes mellitus es solamente de % El valor predictivo de ICAs en parientes de primer grado es influenciado por diversos factores. Este es alto cuando los ICAs son detectados en un titulo alto en combinación con otros autoanticuerpos. En contraste, el valor predictivo de los ICAs en titulo bajo en ausencia de otros autoanticuerpos es bajo (Falorni, 2005). La persistencia de ICAs parece predecir una tasa incrementada en la perdida de la producción de la insulina endógena. En estudios prospectivos un alto titulo de ICAs parecen predecir una perdida mas rápida de peptido-c (Falorni, 2005). En niños, la disfunción de las células β fue demostrada en individuos ICA positivos quienes tienen los alelos HLA de alto riesgo como son DQB1*0302 o DQB1*0201 (Falorni, 2005) Autoanticuerpos contra Insulina Los autoanticuerpos contra insulina (IAA) se definen como anticuerpos que se unen a la insulina en individuos que no reciben tratamiento con ésta. A diferencia 28

21 de los ICA, el antígeno de IAA se conoce (insulina) y es específico de las células beta (Greenbaum, 2003). La insulina fue el primer autoantígeno de islotes, célula β específico, descrito (Falorni, 2005). Es una proteína pequeña de 51 aminoacidos codificada por el cromosoma 11 (Notkins, 2001). El peptido de la cadena de Insulina B, aminoácidos 9-23, es el blanco de la respuesta autoinmune por Linfocitos T, en ratones NOD (Eisenbarth, 2002). El ensayo de inmunoprecipitación para autoanticuerpos no distingue entre autoanticuerpos espontáneos de los autoanticuerpos que aparecen después de inmunización con insulina, los cuales aparecen como consecuencia de terapia con insulina exógeno (Winter, 2002). Los IAAs se presentan mas frecuentemente en individuos que presentan HLA- DR4. Las técnicas que detectan autoanticuerpos contra insulina por ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) no se recomiendan debido a que los IAAs detectados no correlacionan con la diabetes autoinmune, por esto, muchos investigadores han utilizado radioinmunoensayos en fase fluida (Winter, 2002) (Living, 2000). Solamente el radioinmunoensayo (RIA) combina una sensibilidad diagnostica adecuada con especificidad, como se demostró en los talleres internacionales para la estandarización del ensayo IAA (Farloni, 2004). El volumen de suero necesario para radioinmunoensayos de gran sensibilidad, con precipitación con polietilen glicol y centrifugación seguida por un conteo gamma, ha limitado la medición de IAA (Living, 2000). La precisión diagnóstica baja de los ELISAs se deben probablemente al exceso de autoantígeno estratificado en el pozo, lo cual determina la unión de baja afinidad de anticuerpos no relacionados con el proceso autoinmune, y la disponibilidad reducida de los epítopos conformacionales (Farloni, 2004). 29

22 Durante la historia natural de la enfermedad, los anticuerpos contra la insulina usualmente se presentan como el primer marcador de advenimiento de un proceso autoinmune (Eisenbarth, 2002) (Farloni, 2004). Los epítopos IAA se encuentran localizados en las regiones de aminoácidos B1-B3 y A8-A13 de la insulina humana, y son altamente conservados entre los pacientes con diabetes tipo 1 o individuos prediabéticos (Farloni, 2004). En el inicio de la diabetes tipo 1, los IAAs se presentan en 35-60% de los niños pero son menos comunes en adultos (Winter, 2002). La detección de autoanticuerpos antiinsulina (IAA), son importantes en el diagnóstico y predicción de diabetes tipo 1 (Liping, 2000). La especificidad diagnostica de los IAA para diabetes mellitus tipo 1 es cercana al 99%, y el valor predictivo de IAA para diabetes tipo 1 es alto solamente cuando es usada en combinación con ICA o otros autoanticuerpos (Farloni, 2004) Autoanticuerpos contra Descarboxilasa del Ácido Glutámico En 1982 se identificaron anticuerpos contra una proteína de 64 kda de los islotes en pacientes con diabetes tipo 1 por medio de la inmunoprecipitación de determinadas proteínas de los islotes humanos marcadas con sustancias radiactivas (S-metionina) en suero de pacientes con diabetes de tipo 1 (Falorni, 2004). En el momento del diagnostico, alrededor de 80% de los individuos diabéticos poseían anticuerpos contra un antígeno de 64 kda, pero estos anticuerpos no aparecían en los pacientes con otros trastornos autoinmunitarios o en los testigos sanos. El autoantígeno de 64 KDa fue identificado como la enzima Descarboxilasa del Acido Glutámico. Han sido caracterizadas dos isoenzimas diferentes de GAD de peso molecular de Da (GAD 65) y Da (GAD 67). GAD65 y GAD67 30

23 son codificadas por dos genes diferentes localizadas en los cromosomas 10 y cromosoma 2 respectivamente (Falorni, 2004). GAD65 esta involucrada en la conversión de acido glutámico a acido gamaaminobutirico (GABA), un neurotransmisor inhibitorio (Notkins, 2001). GAD no es especifico de las células beta o islotes. GAD es expresado predominantemente en el sistema nervioso. Otros tejidos que expresan GAD incluyen los testículos, ovarios, corteza adrenal, pituitaria, tiroides y riñón (Winter, 2002). Han sido usados anticuerpos monoclonales contra GAD65 para demostrar que los epítopos de la enzima están localizados en las regiones centrales y COOHterminales (Kobayashi, 2003). El uso de moléculas quiméricas GAD65/GAD67 y GAD65 mutada han confirmado esta localización de los epítopos de los anticuerpos. Por lo menos un epítopo conformacional es localizado en el centro y dos en la region COOH- terminal de la enzima, mientras que un epítopo linear (menos frecuentemente reconocido por los anticuerpos humanos) es localizado en la región NH2- terminal. El análisis de la secuencia de aminoácidos de GAD65 ha mostrado una región central altamente homologa con Coxsackie B5 o proteínas de choque térmico (Falorni, 2004). Los Autoanticuerpos contra GAD han sido detectados en diversas enfermedades autoinmunes, incluyendo diabetes mellitus autoinmune, el síndrome stiff-man, y el síndrome autoinmune poliendocrino tipo 1 (Kobayashi, 2003). GAD65 puede ser encontrado en 70 75% de los pacientes con Diabetes mellitus tipo 1, y en 1 2% de pacientes sanos. Los anticuerpos contra GAD67 han sido encontrados en solamente 15-25% de pacientes con Diabetes autoinmune (Falorni, 2004). La prevalencia de GAD65 en pacientes con presentación de la 31

24 enfermedad no es influenciada por la edad, de esta forma GAD65 es el marcador de tipo autoanticuerpo más sensible para diabetes autoinmune y para la diabetes autoinmune latente del adulto (LADA) (Falorni, 2004). Debido a que los GADAs son más persistentes que los ICAs después del diagnóstico de diabetes tipo 1, los GADAs pueden ser más frecuentemente positivos que los ICAs en LADA. Debido a que la frecuencia de LADA es de 5-15% basado en estudios ICA, usando GADAs como el marcador autoinmune, la prevalencia de LADA en diabetes tipo 2 fenotípica puede ser aún mayor (Winter, 2002). Resultados importantes de estudios en animales indican que la GAD es posiblemente un antígeno clave en la diabetes tipo 1 (Winter, 2002). El valor predictivo de GAD65 para diabetes mellitus autoinmune es ligeramente mayor en comparación con ICA o IAA. Sin embargo, la presencia simultánea de ICA, IAA y GAD ha demostrado un alto valor predictivo para presentar diabetes mellitus autoinmune. Mas específicamente, el número de autoanticuerpos mas que sus niveles, correlacionan positivamente con el riesgo de diabetes autoinmune en parientes de pacientes diabéticos. En parientes de primer grado positivos para un solo anticuerpo (IAA, GAD65 o IA-2Ab) el riesgo de presentar diabetes mellitus autoinmune es de aproximadamente del 20% en 5 años. El riesgo se incrementa a 90% en sujetos positivos para los tres autoanticuerpos (Falorni, 2004). No es claro si la presencia de anticuerpos contra GAD65 en pacientes con diabetes mellitus influencia el curso clínico. La presencia de GAD65 en el inicio de la enfermedad puede predecir una rápida perdida de la función de las células β (Falorni, 2004). 32

25 4.8.4 Autoanticuerpos contra proteínas de tipo fosfatasa de tirosina Por el tiempo en que se estableció que el antígeno de 64 KDa era GAD, se inmunoprecipitó otra proteína distinta de GAD con anticuerpos en el suero de pacientes con diabetes de tipo 1. Este autoantígeno también de 64 KDa fue tratado con proteasas que condujo a la demostración de tres fragmentos distintos de 50, 40 y 37 KDa. El fragmento de 50 KDa demostró provenir de GAD65. Los fragmentos de 37 y 40 KDa provienen de las proteínas asociadas a la membrana de los islotes distintas a GAD65. El antígeno de 40 KDa se identificó como la proteína IA-2 similar a la fosfatasa de tirosina, llamada también ICA512, codificada por el cromosoma 2. El antígeno de 37KDa es una fosfatasa de tirosina llamada fogrina, IA-2 β o IA-2. Entre los individuos con diabetes de tipo 1 es mas frecuente encontrar anticuerpos contra IA-2 que contra IA-2 β. Similar a los GAD, IA-2 es encontrado en tejido nervioso y otros tejidos endocrinos incluyendo la pituitaria; se encuentra también en las células α y β de los islotes pancreáticos. Algunos ensayos de autoanticuerpos anti IA-2 detectan la molécula entera, mientras que otros detectan porciones de la molécula (ensayos IA-2c y ensayos ICA512) (Winter, 2002) (Notkins, 2001). Cuando se ensayan anticuerpos contra ICA512 o IA-2a en estudios de la historia natural de pre-diabetes, algunos investigadores sugieren que los autoanticuerpos ICA512 se desarrollan más tardíamente que los GADAs y así pueden servir como marcadores de riesgo a corto término para la presentación clínica de diabetes tipo 1 (Winter, 2002). El uso de radioinmunoensayos para IA-2Ab (o ICA512Ab) ha demostrado que estos autoanticuerpos están presentes en 70-80% de niños con diabetes mellitus insulinodependiente. Similar a IAA, IA-2Ab son más comunes entre niños 33

26 diabéticos que adultos y están asociados con alelos HLA-DRB1*O4 (Falorni, 2004) Otros Marcadores Se ha demostrado la existencia de autoanticuerpos circulantes contra CD38 en aproximadamente 4-20% de pacientes con diabetes mellitus tipo 1 y en un 8-19% de pacientes con diabetes mellitus tipo2. CD38 es un receptor expresado en la superficie celular y es considerado uno de los mediadores fisiológicos de la secreción de insulina. Anticuerpos contra CD38 muestran una actividad agonista que media la liberación de Ca+ en las células blanco y, en estudios in Vitro, la liberación de insulina por los islotes humanos. La presencia de anticuerpos anti CD38 en pacientes con diabetes tipo 2 es más frecuente en aquellos individuos que co-expresan otros autoanticuerpos antiislotes, tales como GAD65, pero los dos marcadores diferencian distintas subpoblaciones. Los pacientes positivos para anticuerpos anti CD38 tienen una función de las células β normal, después del test de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y características fenotípicas de diabetes mellitus tipo 2 (Falorni, 2004) Sensibilidad y Especificidad Diagnostica El taller de Inmunología en Diabetes y la Sociedad de Diabetes e Inmunología han organizado talleres en estandarización de anticuerpos desde El taller más reciente, acerca de autoanticuerpos contra islotes combinados demostró que los GAD65Ab e IA-2Ab tienen una sensibilidad y especificidad diagnóstica alta y pueden ser medidos consistentemente por muchos laboratorios. La sensibilidad diagnóstica de los autoanticuerpos contra insulina es dependiente de la edad y disminuye con el incremento de esta. El ensayo de concordancia para autoanticuerpos contra insulina en diferentes laboratorios fue marcadamente menor que para IA-2Ab y GAD65Ab, respectivamente. El taller de 34

27 Autoanticuerpos antiislotes combinados, sin embargo, demostró que el uso de la combinación de ensayos de autoanticuerpos hace posible para los laboratorios conseguir una discriminación excelente entre diabéticos y controles. Este taller internacional de estandarización también demostró que una combinación de tres ensayos pueden ser usados no solamente para identificar nuevos pacientes con diabetes tipo 1 sino para definir criterios para la inclusión en intervención inmune y otras herramientas (Lenmark, 1999). Sensibilidad diagnóstica y especificidad de los autoanticuerpos para diabetes tipo 1 Autoantígeno Sensibilidad, % Especificidad, % Insulina GAD IA Actualmente se están buscando estrategias de tamizaje cuyo objetivo es evidenciar cual es la combinación ideal de medición de autoanticuerpos, cuya sensibilidad permita involucrar la mayor cantidad de pacientes con riesgo de desarrollar diabetes tipo 1a al menor costo. En un estudio realizado en Estados Unidos (Krischer, 2003), cuyo objetivo era determinar la combinación ideal de autoanticuerpos para identificar la población de personas no diabéticas parientes de diabéticos, positivos para anticuerpos anti-islotes (ICA), autoanticuerpos microinsulina (MIAA), autoanticuerpos anti GAD65 (GAA), y autoanticuerpos IA- 2Ab (ICA512), arrojo resultados en la sensibilidad para la determinación de pacientes con autoanticuerpos cuando se usan las siguientes combinaciones: - 99% para GAA e ICA, - 97% para GAA y MIAA, - 97% para GAA e ICA512AA, - 93% para ICA512AA e ICA, 35

28 - 92% para MIAA e ICA, - 73% para ICA512AA y MIAA. La posibilidad de eliminar el Test de ICA, puede limitar la sensibilidad solo a aquellos sujetos que resulten positivos para GAD65Ab, obviando los falsos negativos. La estrategia que mejores resultados han arrojado resulta de la combinación de GAD65Ab e ICA, pero es necesario identificar cuales son los autoanticuerpos presentes, ya que de esta forma se puede hacer una análisis de la predicción de enfermedad. 4.9 ASPECTOS NEGATIVOS EN EL TAMIZAJE - Económicos: la incidencia de diabetes tipo 1 puede considerarse moderada pero no de alta incidencia. - Los individuos realmente desean tal información? - Ético: debemos tamizar en ausencia de un método conocido para prevenir la diabetes tipo 1? - Privacidad: como debe manipularse tal información? - Practicidad: quien debe hacer este tamizaje? 36

29 CONCLUSIONES Se ha observado un gran avance en el conocimiento de la diabetes tipo 1 durante las últimas tres décadas de la historia; los investigadores han diseñado diferentes estrategias, basándose principalmente en estudios experimentales en ratones NOD y ratas BioBreeding, para dar respuesta a los diferentes interrogantes que han surgido, se han creado modelos de la historia natural de la enfermedad, se han determinado los principales autoantígenos involucrados y se han diseñado los métodos analíticos para identificarlos. La identificación de los pacientes que sufren de diabetes, consiste en la medición de glucosa plasmática, un ensayo de rutina de laboratorio, cuyos resultados se evalúan de acuerdo a los criterios internacionales establecidos. Dentro de este grupo de pacientes, se encuentran aquellos cuya producción de insulina esta disminuida y presentan autoanticuerpos circulantes contra antigenos relacionados con la enfermedad, siendo clasificados dentro del grupo de diabetes tipo 1a. La diabetes tipo 1a es una enfermedad de origen multifactorial, cuyas manifestaciones clínicas se evidencian cuando un gran porcentaje de células en el páncreas han sido destruidas, debido a un proceso autoinmune. En cuanto a estos múltiples factores, se han relacionado componentes genéticos (genes HLA y no HLA), ambientales (alimentación, infecciones), entre otros. Se especula que la combinación de genes de susceptibilidad con factores ambientales son importantes en el desarrollo de diabetes tipo 1a. La aparición de diferentes autoanticuerpos son el primer signo de destrucción de la célula β. Los autoanticuerpos pueden ser detectados incluso durante la fase prodrómica, como en el caso de la diabetes tipo 1a, durante la cual no existen síntomas 37

30 clínicos, pero se esta llevando a cabo una destrucción de las células secretoras de insulina. Estos autoanticuerpos son de gran utilidad, ya que permiten determinar la naturaleza de la enfermedad, es decir clasificar la diabetes en autoinmune o no, han sido usados para estudiar la actividad de la enfermedad y determinar la tasa de progresión. Los anticuerpos contra las células de los islotes ICAs, fueron los primeros descritos y han representado el gold estandard para analisis de autoanticuerpos por muchos años. Estos anticuerpos, constituyen un buen marcador de autoinmunidad en diabetes, a pesar de la difícil estandarización de su analisis. Son muchos los autoantigenos relacionados con la enfermedad, pero los marcadores más importantes de autoinmunidad contra las células β son autoanticuerpos contra insulina (IAA), descarboxilasa del ácido glutámico (GAD65) y antigeno-2 de células de los islotes (IA-2). La insulina fue el primer autoantígeno de islotes, célula β específico reconocido. Los anticuerpos contra la insulina usualmente se presentan como el primer marcador de advenimiento de un proceso autoinmune. La descarboxilasa del ácido glutámico, GAD no es especifica de las células beta o islotes. No es claro si la presencia de anticuerpos contra GAD65 en pacientes con diabetes mellitus influencia el curso clínico. La presencia de GAD65 en el inicio de la enfermedad puede predecir una rápida perdida de la función de las células β. El valor predictivo de GAD65 para diabetes mellitus autoinmune es ligeramente mayor en comparación con ICA o IAA. 38

31 En cuanto al antigeno-2 de las células de los islotes (IA-2), se ha identificado como proteínas de la familia de las fosfatasa de tirosina. Los anticuerpos contra esta proteína se desarrollan más tardíamente que los GADAs y así pueden servir como marcadores de riesgo a corto término para la presentación clínica de diabetes tipo 1. En la actualidad, la mejor opción para obtener un mayor grado de sensibilidad en las determinaciones es la realización de combinaciones de medición de autoanticuerpos. De acuerdo a estudios realizados en Estados Unidos, las mejores sensibilidades obtenidas se evidenciaron cuando se realizaron simultáneamente GAD e ICA, GAD e IAA, o GAD e IA2Ab. El siguiente paso consiste en crear métodos de prevención y cura total de la enfermedad; por qué el principal objetivo de la predicción es la prevención. Así es que si poseemos las herramientas para predecir, en este caso los métodos analíticos de medición de autoanticuerpos, falta la intensa labor de identificación de estrategias curativas eficaces. 39

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