DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS
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- Catalina Elena Saavedra Maestre
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1 DETERMIAIÓ UATITATIVA DE PRTEIAS bjetivos: Al finalizar este trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de: - onocer el principio que rige la determinación cuantitativa de proteínas por los métodos de Biuret y Bradford. - omparar la sensibilidad de ambos métodos al aplicarlo a distintas muestras biológicas. - alcular la concentración de proteínas en muestras biológicas. Introducción: El contenido de proteínas de una muestra biológica es un parámetro de gran utilidad tanto para el investigador como para profesionales del área clínica. Este dato es importante para el bioquímico, ya que puede precisar la eficiencia de un método de aislamiento proteico o la cantidad de proteínas de fluidos corporales o de una determinada fracción subcelular. Para el Veterinario, Médico o el Bioanalista, la concentración sérica o urinaria de proteínas puede reflejar la presencia de algún estado patológico o simplemente verificar la condición fisiológica del animal. Para determinar la cantidad de proteínas en muestras biológicas existe una diversidad de métodos. Unos se basan en principios físicos como la refractometría, otros en determinar la composición de nitrógeno total de la muestra y luego calcular la cantidad de proteínas como el método de Kjeldhal. Sin embargo, estos métodos como herramientas de trabajo en el laboratorio de Bioquímica son poco precisos. El surgimiento del espectrofotómetro abrió camino a un gran número de pruebas, basadas en la ley de Lambert y Beer, entre ellas la determinación cuantitativa de proteínas. Alguno de los métodos para cuantificarlas son: Biuret, Lowry y Bradford. onceptos básicos sobre espectrofotometría La espectrofotometría es uno de los métodos analíticos de mayor importancia y utilidad en bioquímica ya que permite medir la cantidad relativa de luz absorbida o transmitida por la materia (ej. moléculas biológicas en disolución acuosa: proteínas, aminoácidos, metabolitos, etc.) medida como absorbancia (Abs) o transmitancia (%T), respectivamente. La absorbancia es la medida de la cantidad de luz bloqueada o absorbida por una solución. Las moléculas que absorben luz se llaman cromóforos. El color de las sustancias se 1
2 debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos, aquellas longitudes de onda no absorbida. La transmitancia es el parámetro inverso de la absorbancia, constituye la medida porcentual de la cantidad de radiación o luz que pasa a través de la solución. Para medir la absorbancia y/o transmitancia de un compuesto en solución se utiliza el espectrofotómetro, instrumento que permite determinar la radiación absorbida o transmitida por una solución, a una determinada longitud de onda. Los componentes básicos de cualquier espectrofotómetro son: 1.-Fuente de luz o radiación la cuál tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que abarca (usualmente es una lámpara de tungsteno para luz visible, y una de deuterio para luz ultravioleta); 2. Monocromador que selecciona la longitud de onda deseada del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra; 3.-ompartimiento para la muestra y 4.- Fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra (Figura 1). Figura 1. omponentes de un espectrofotómetro Ley de Beer- Lambert La fracción de luz incidente que es absorbida por una solución depende de la longitud de onda, de la concentración del compuesto absorbente en solución y de su naturaleza química. La relación matemática entre estas variables fue establecida por Beer- Lambert y se expresa con la siguiente ecuación: A = εcl 2
3 Donde: A = Absorbancia o densidad óptica, ε = oeficiente de absortividad molar (constante), c = oncentración de la muestra y l = Longitud de onda Si se mantiene constante l, tenemos que A es directamente proporcional a la concentración de la muestra. De este modo, la ley de Beer- Lambert establece que la concentración de un analito en solución, es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida. uando se desconoce la concentración de un analito, ésta puede ser determinada a partir de una curva de calibración que se construye graficando los valores de absorbancia contra distintas concentraciones de un estándar o patrón. La interpolación de la absorbancia de la muestra desconocida en la curva de calibración nos permitirá conocer la concentración del analito. Método de Biuret Este método recibe su nombre debido a que el color que se produce en esta reacción, es similar al de la condensación de dos moléculas de urea, conocido en alemán como: Biuret. Se fundamenta en la formación de un compuesto azul violeta por la reacción del ión cúpicro con la proteína en medio alcalino. Este ión forma un enlace covalente coordinado (Figura 1). Una condición indispensable para la positividad de la reacción es que el compuesto analizado posea al menos dos enlaces peptídicos en su estructura. En el caso de los aminoácidos y dipéptidos la reacción es negativa. Si se observa la reacción se verá claramente porqué hacen falta dos enlaces: H u ++ H H 2 H R H - R H u ++ H R H H H Enlaces Peptídicos Enlace covalente coordinado Figura 2. Reacción de Biuret 3
4 El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, es decir, que a mayor concentración de proteínas, más coloreada se torna la solución y por lo tanto, la absorbancia será mayor. Esto hace posible la cuantificación de las proteínas presentes en una muestra desconocida, relacionando la absorbancia de la muestra con la de estándares de proteínas (soluciones con concentraciones conocidas) graficados en una curva patrón de proteína. Este método detecta proteínas en un rango de 0,5 a 10 mg/ml, lo que es suficiente para medir los valores de proteínas en algunos fluidos biológicos como el suero y el plasma, ambos con concentraciones mayores de 6 g%. Método de Bradford Éste método se basa en la capacidad que presenta el Azul Brillante de oomasie G-250 de unirse a las cargas positivas de la estructura proteica. El colorante presenta dos estructuras, la roja predominante en solución (Abs max = 465 nm) y la azul, cuando se encuentra asociado a las proteinas (Abs max = 595 nm). 2 H 5 H H 3 H 3 2 H 5 H 2 H 5 2 H 2 - S 3 S 3 - Figura 3. Estructura del Azul de oomasie G250 Debido a que la respuesta del método es la misma para una gran cantidad de proteínas, la cuantificación se puede llevar a cabo usando cualquier estándar disponible. La interferencia de otros compuestos distintos a las proteínas es mínima. La sensibilidad del método está en el rango de 0,2 a 20 μg/ml. Es decir 1000 veces más sensible que el método de Biuret. 4
5 MATERIALES Y REATIVS - Reactivo de Biuret: 1,5 g de us 4 : 5 H 2 y 6 g de tartrato de sodio y potasio se disuelven en 500 ml de agua. Añadir 300 ml de ah al 10% y aforar a 1L. - Reactivo de Bradfrod: 100 mg de azul brillante de oomasie G 250 se disuelven en 50 ml de etanol al 95%. Añadir 100 ml de H 3 P 4 al 85% (concentrado) y aforar a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de papel filtro Whatman 1. Para probar el reactivo medir la absorbancia contra un blanco de agua destilada a 595 nm, el valor debe estar entre 0,4 y 0,6 UA. - Standard de proteína 2 g% - Espectrofotómetro - ubetas para espectrofotometría - Azul brillante de oomasie G al 0,9% - Pipetas volumétricas de 1, 2 y 5 ml tubos de ensayo. PARTE EXPERIMETAL: Experimento º 1. Determinación de proteínas por el método de Biuret Procedimiento: - Preparar una dilución 1:10 de plasma bovino en un tubo de ensayo (1mL de plasma + 9 ml de al 0,9%). - Rotule y prepare los tubos blanco, estándares y muestra en el mismo orden como se indica en el siguiente cuadro: Reactivos albúmina 2 g% Blanco ,6 g% 1,0 g% 0,2 g% 1,2 g% Muestra problema 0,1 ml 0,3 ml 0,5 ml 0,6 ml al 0,9% 1 ml 0,9 ml 0,7 ml 0,5 ml 0,4 ml Plasma diluido 1:10 Reactivo de Biuret 1 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5
6 Una vez agregado el reactivo de Biuret, espere 10 minutos y proceda a leer la absorbancia a 545 nm con ayuda del espectrofotómetro. Anote los resultados en la tabla anexa para el posterior análisis. RESULTADS TUB ABSRBAIA 0,2 g% 0,6 g% 1,0 g% 1,2 g% Muestra problema Experimento 2 Determinación de proteínas por el método de Bradford Procedimiento: - A partir del estándar de proteínas (2 g%) prepare por dilución 100 ml de una solución que contenga 100 mg%, y a partir de ésta prepare 100 ml de estándares que contengan 10, 25, 50 y 100 mg% de proteína. - Prepare 100 ml de una dilución de plasma bovino 1:100 que se utilizará como muestra problema. Prepare la siguiente serie de tubos: Reactivos blanco 10 mg% 25 mg% 50 mg% 100 mg% Muestra problema 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml al 0,9 % Plasma diluido 1:100 Reactivo de Bradford 0,1 ml 0,1 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml - Mezclar bien y leer la absorbancia con un espectrofotómetro a 595 nm dentro del lapso de 15 a 20 minutos después de agregar el reactivo de Bradfrod. 6
7 Una vez obtenidos los resultados anótelos en la tabla que se suministra a continuación para su posterior análisis y discusión. RESULTADS TUB ABSRBAIA 10 mg% 25 mg% 50 mg% 100 mg% Muestra problema on los datos de cada tabla construya una curva patrón para cada método (graficando la concentración de proteínas en el eje x contra absorbancia en el eje y ) y mediante extrapolación, estime la concentración de proteínas de la muestra. onsidere la dilución realizada en el procedimiento de cada método. Discuta las diferencias encontradas entre ambos métodos, así como sus ventajas y desventajas en el análisis de muestras biológicas. Auto evaluación 1. Qué ventaja representa el hecho de que el reactivo de Bradford posea absorbancia a dos longitudes de onda distintas, una libre y otra asociado a las proteínas. 2. En base a la sensibilidad que presentaron los métodos estudiados, que aplicaciones prácticas tiene cada uno de éstos. 3. Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos hasta llevar las proteínas a aminoácidos libres. Si una proteína es incubada con estas enzimas que sucederá con la absorbancia en el tiempo al medir la concentración de éstas por alguno de los métodos estudiados. En cuál la absorbancia se hace cero primero? Bibliografía A.V. hechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral. 7
8 Boyer, Rrodney. Modern Experimental Biochemistry. 2 da Edición. Benjamin ummins Editores Bradford, M. A rapid and sensitive meted for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:
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