AISLAMIENTO DE RNA TOTAL DE DIFERENTES TEJIDOS DE Bromelia haemisphaerica. San Martín Azócar, Alejandra; Anaya Sosa, Irasema; Muñoz Sánchez, José Luis

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1 Clave: AISLAMIENTO DE RNA TOTAL DE DIFERENTES TEJIDOS DE Bromelia haemisphaerica San Martín Azócar, Alejandra; Anaya Sosa, Irasema; Muñoz Sánchez, José Luis DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Departamento de Bioquímica, ENCB, IPN. Prolongación Carpio y Plan de Ayala, 11340, México D.F , ext CORREO ELECTRÓNICO pishirushe@hotmail.com

2 INTRODUCCIÓN Las enzimas proteolíticas de origen vegetal son utilizadas en numerosas industrias: en los procesos de fabricación de cerveza, en la elaboración de ablandadores de carne, en la producción de hidrolizados proteínicos, en la formulación de productos farmacéuticos diversos, entre otros (Briones y col. 1994). La hemisfericina es una enzima proteolítica polimórfica y cisteínica que fue aislada del jugo de los frutos de Bromelia hemisphaerica: especie silvestre mexicana que crece principalmente en las entidades de Morelos, Guerrero y Estado de México. Esta proteinasa está constituida por nueve formas moleculares, cada una con actividad esterolítica y caseinolítica. La enzima tiene componentes aniónicos, catiónicos y neutros (Hernández et al., 1983, Cruz y Victoria et al., 1974, Garduño et al., 1974). La hemisfericina tiene un grupo tiol, presente en el sito activo como es el caso de la bromelaína y la pinguinaína, dos otras proteasas de bromeliaceae (Ochoa et al., 1987). Briones et al. (1994), reportan que han estudiado mediante análisis electroforéticos el efecto de la hemisfericina en la modificación de las proteínas miofibrilares del músculo de bovino. Los resultados preliminares mostraron que esta enzima produce una hidrólisis más moderada y selectiva que las proteínas miofibrilares que la producida por papaína, enzima de uso muy difundido en la elaboración de emolientes comerciales de carnes. Esta origina una hidrólisis indiscriminada, transformando rápidamente las proteínas a compuestos de bajo peso molecular. Aparentemente, la característica polimórfica de la hemisfericina le confiere una mayor selectividad y/o especificidad en la modificación de las diferentes proteínas miofibrilares, semejante al efecto de las catepsinas: las proteinasas polimórficas endógenas del músculo, responsables del ablandamiento posterior a la muerte de la carne de bovino. El objetivo es aislar el RNA total a partir de diferentes tejidos de Bromelia hemisphaerica, y determinar de cual de los tres tejidos es más conveniente obtener el RNA.

3 MATERIALES Y MÉTODOS Se obtuvo RNA total a partir de plantas recién germinadas, de pulpa de fruto y de hijuelos de Bromelia hemisphaerica. a.- Aislamiento de RNA total a partir de plantas recién germinadas y a partir de pulpa de fruto de Bromelia hemisphaerica Se utilizó en juego comercial Aqua Pure Isolation Kit (Bio-Rad): - Lisis de la célula Se agregaron 5-10 mg de tejido congelado o fresco a un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml que contenía 300 µl de solución de lisis de RNA. Se trituró el tejido congelado en nitrógeno líquido con un mortero de porcelana. El tejido se mantuvo congelado hasta agregarlo a la solución de lisis. Se homogeneizó rápidamente. - Precipitación de proteína-dna Se agregaron 100 µl de solución precipitadora de proteína-dna, se invirtió el tubo 10 veces y se colocó en baño de hielo por 5 min. Se centrifugó a 13,000-16,000xg por 3 min. - Precipitación de RNA Se pipeteó el sobrenadante que contienía el RNA en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml que contenía 300 µl de isopropanol 100%. Se mezcló la muestra por inversión veces y luego se centrifugó a 13,000-16,000xg en una mircocentrífuga por 3 min. Se quitó el sobrenadante. Se agregaron 300 µl de etanol 70% y se invirtió el tubo muchas veces para lavar la pastilla de RNA y se centrifugó a 13,000-16,000xg por 1 min. Se quitó cuidadosamente el etanol. Se dejó secar al aire min. - Hidratación del RNA Se agregaron 50 µl de solución de hidratación de RNA, se incubó por 30 min en hielo. Antes de usar, se mezcló la muestra en Vortex por 5 segundos y se dio un pulso. Se pipeteó repetidas veces para asegurar una mezcla adecuada. La muestra de RNA purificado se almacenó a -70 C.

4 b.- Aislamiento de RNA total a partir de hijuelo de Bromelia hemisphaerica No fue posible obtener RNA total a partir de los hijuelos de la planta utilizando el juego comercial Aqua Pure Isolation Kit (Bio-Rad), por lo que se trabajó utilizando el reactivo Trizol. Se homogeneizaron 2 g del tejido de hijuelos de Bromelia hemisphaerica en 10 ml del reactivo TRIZOL en un Potter, se centrifugó a 12,000xg por 10 min a una temperatura de 8-10 C. El sobrenadante se incubo por un lapso de 5 min a C, para permitir la disociación completa de las nucleoproteínas, se añadieron 2 ml de cloroformo, se taparon los tubos, se agitaron vigorosamente con la mano durante 15 s y se incubaron por 2 min a una temperatura de C, se centrifugó a 12,000xg durante 15 min a 2-8 C; después de centrifugar se observaron 3 fases, la capa acuosa se transfirió a un tubo limpio, se mezcló con 5 ml de alcohol isopropílico, se incubó por 10 min a C y se centrifugó a no más de 12,000xg durante 10 min a 2-8 C. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el RNA precipitado una vez con 10 ml de etanol 75%, se mezcla usando un Vórtex y se centrifugó a no más de 7,500xg durante 5 min a 2-8 C. Para finalizar el procedimiento, se secó parcialmente el RNA. Se disolvió el RNA en 1 ml de agua libre de RNasa pasando la solución varias veces a través de una pipeta. La muestra de RNA purificado se almacenó a -70 C. c.- Electroforesis en gel de agarosa de RNA Se preparó la agarosa utilizando un 1% de agarosa y 0.5% de formaldehído en regulador TBE 0.5X; en el pozo se colocaron 25 µl de muestra de RNA con 5 µl de azul de bromofenol. Se desarrolló la electroforesis a 80V y luego se retiró el gel y se colocó en una solución con bromuro de etidio, después de 15 min el gel se enjuagó y se expuso a luz ultravioleta para observar las bandas de RNA. d.- Cuantificación del RNA total Se leyó la absorbancia a 260 nm y se calculó la concentración de RNA total con la siguiente ecuación: RNA total (µg/ml) = A 260 x 40 x dilución x volumen (µl)

5 RESULTADOS Para analizar la integridad del RNA obtenido, se realizó una electroforesis en gel de agarosa (1%) para muestras del RNA total obtenidas de plantas recién germinadas (Figura 1) y de pulpa de fruto (Figura 2) y de hojas de hijuelos (Figura 3), de Bromelia hemisphaerica, en las cuales se observan tres bandas para cada muestra, correspondientes a RNAs ribosomales 28S, 18S y 5.8S, característicos de eucariontes; sus tamaños son de 1.7x10 6, 6x10 6 y 5x10 4 Da. Entre las bandas se aprecia el mrna S 18S 5.8S Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de plantas recién germinadas Bromelia hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA.

6 1 2 28S 18S 5.8S Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de pulpa de fruto Bromelia hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA S 18S 5.8S Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de hijuelos Bromelia hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA.

7 Para el caso de las plantas recién germinadas de Bromelia hemisphaerica se obtuvieron concentraciones de RNA total 4.64 y 3.20 µg/ml, para la pulpa de fruto los resultados fueron de 9.39 y 8.78 µg/ml, mientras que para las hojas del hijuelo los resultados fueron de de 3.66 y 5.02 µg/ml.

8 DISCUSIÓN Las electroforesis en agarosa (1%) muestran mayor integridad del RNA de las muestras obtenidas de las plantas recién germinadas y de las muestras de pulpa de fruto (Figuras 2 y 3) respecto al aislado a partir de hojas del hijuelo de Bromelia hemisphaerica (Figura 1), observándose más claramente las bandas de rrna propias de las células eucariontes. Al comparar las concentraciones de RNA de las tres muestras, se obtuvo la mayor concentración para el caso del RNA obtenido de la pulpa de fruto, mientras que la concentración más baja fue para el caso de las hojas de los hijuelos. Probablemente, la diferencia en los resultados obtenidos para pulpa de fruto comparados con los de las plantas recién germinadas y las hojas de los hijuelos, se deban a la mayor facilidad de extracción de RNA total a partir de las células de la pulpa porque el tejido es el más blando de los tres, lo cual permite trabajar con menor cantidad de muestra, menor tiempo de proceso y menor manipulación de la muestra. Esto permitiría reducir las posibilidades de daño del RNA mientras se está llevando a cabo el proceso de aislamiento. Mientras que las hojas de los hijuelos fueron muy difíciles de moler, en la primera etapa de aislamiento, lo cual podría sugerir que no se logró romper lo suficiente las células para permitir la extracción del RNA total.

9 CONCLUSIONES Es posible obtener RNA total, tanto a partir de hojas de hijuelos, de Bromelia hemisphaerica, así como de plantas nuevas de 2 meses de vida y de pulpa del fruto de la planta; sin embargo, se logró una mayor concentración y mejor integridad para el caso del RNA total obtenido a partir de la pulpa del fruto de la planta.

10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Briones-Martínez, H., Cruz y Victoria, MªT., Oliver-Salvador, MªC. y Cortes-Vazquez, MªI Preparaciones enzimáticas de interés industrial con proteinasas de plantas mexicanas. Información tecnológoca. Vol. 5 Nº Cruz y Victoria, M.T., Oliver, M. del C., del Castillo, l.m y Castañeda-Agulló, M Proteinasas de plantas mexicanas I. Determinación de pesos moleculares de proteinasas cisteínicas por concentración de grupos tioles. Rev. Lat. de Quim Hernández, A., Rodríguez, R., Cruz y Victoria, M. y del Castillo, L Proteinasas de plantas mexicanas IX. Estructura, relaciones y taxonomía. Rev. Latinoamer. Quím. 14(2): Garduño, R., Soriano, M., Chávez, E., Cruz y Victoria, M.T., del Castillo, L.M. y Castañeda-Agulló, M Proteinasas de plantas mexicanas II. Puntos isoeléctricos y caracterización de formas moleculares múltiples en enzimas de bromeliaceas. Rev. Latinoamer. Quím Ochoa, N., Agundis, C. Córdoba, F Isolation and partial characterization of Bromelia hemisphaerica protease by affinity chromatography. Prep. Biochem. 17 (4) REFERENCIAS INFORMÁTICAS I. [Nombre del recurso]; url: [dirección: [fecha de consulta]

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