Evaluación de genes de virulencia relacionados con la generación de variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus

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1 Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016) 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Evaluación de genes de virulencia relacionados con la generación de variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus Resumen Adriana García Tapia Unidad Académica de Ciencias Ambientales honnie_d7@hotmail.com Area en la que presenta: VI biotecnología y ciencias agropecuarias Asesor: Dr. Joel Edmundo López Meza profesor-investigador del Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. elmeza@umich.mx Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, coagulasa y catalasa positiva. Esta bacteria causa infecciones crónicas en humanos y animales, lo cual se relaciona con su capacidad de internalizarse y sobrevivir en las células fagocíticas profesionales y no profesionales, evadiendo el sistema inmune del hospedero y dificultando la terapia antimicrobiana. Se ha asociado a S. aureus con enfermedades persistentes en humanos, como la Osteomelitis y endocarditis, y en bovinos es el principal causante de la mastitis bovina crónica, relacionada todas ellas con el fenotipo de variantes de colonia pequeña (VCP). Las VCP se caracterizan por presentar un crecimiento lento, ausencia del color dorado característico, una actividad de coagulasa y catalasa retardada, Auxotrofismo para hemina y/o menadiona, además de modificaciones en la expresión de los factores de virulencia. S. aureus cuenta con reguladores y factores de virulencia modulados por el sistema Agr; agra interactúa con el promotor P3 y regula la expresión de ARNIII, cuya función es modular la expresión de exoproteínas y de proteínas de superficie como la proteína de unión a fibronectina A (FnbpA) involucrada en el proceso de internalización. En las VCP de S. aureus la expresión del sistema Agr se ve atenuada, por lo tanto ARNIII está ausente; sin embargo, la producción de proteínas de superficie como FnbpA se incrementa. Palabras Clave: Genes, Staphylococcus aureus, Fenotipo

2 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Introducción Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, coagulasa y catalasa positiva. Esta bacteria causa infecciones crónicas en humanos y animales, lo cual se relaciona con su capacidad de internalizarse y sobrevivir en las células fagocíticas profesionales y no profesionales, evadiendo el sistema inmune del hospedero y dificultando la terapia antimicrobiana. Se ha asociado a S. aureus con enfermedades persistentes en humanos, como la Osteomelitis y endocarditis, y en bovinos es el principal causante de la mastitis bovina crónica, relacionada todas ellas con el fenotipo de variantes de colonia pequeña (VCP). Las VCP se caracterizan por presentar un crecimiento lento, ausencia del color dorado característico, una actividad de coagulasa y catalasa retardada, Auxotrofismo para hemina y/o menadiona, además de modificaciones en la expresión de los factores de virulencia. S. aureus cuenta con reguladores y factores de virulencia modulados por el sistema Agr; agra interactúa con el promotor P3 y regula la expresión de ARNIII, cuya función es modular la expresión de exoproteínas y de proteínas de superficie como la proteína de unión a fibronectina A (FnbpA) involucrada en el proceso de internalización. En las VCP de S. aureus la expresión del sistema Agr se ve atenuada, por lo tanto ARNIII está ausente; sin embargo, la producción de proteínas de superficie como FnbpA se incrementa. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo es evaluar la expresión de los principales genes de virulencia y su relación con la generación del fenotipo VCP en S. aureus. Materiales Puntas azules blancas y amarillas. Pipetas 1000, 100, 20, 10, 2. Campana de flujo laminar Tubos Falcón 50 ml 15 ml Cámara de electroforesis Asa bacteriológica Tubos Eppendorf Agua destilada Termociclador Cajas de Petri Centrifugas Mechero Viales Hielo Reactivos Lisozima

3 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Buffer SET Trizol Cloroformo Isopropanol Buffer Gx de carga Buffer 1x DNasa Rnasa Buffer 10x Mg Cl2 1.5 Mm Oligo Rv Oligo Fw DNTP S Taq H20 estéril Buffer electroforesis 5x TBE Buffer SET EDTA Caldo LB Caldo TCS Método. Se utilizó la cepa S. aureus ATCC y su clona VCP 9. Las bacterias se crecieron en caldo LB y TCS + 1µg/ml gentamicina, respectivamente. Posteriormente se realizó una extracción del ARN total del cultivo bacteriano con Trizol de acuerdo con las indicaciones del proveedor (TRIzol Reagent, Life Technologies). La síntesis de ADNc se realizó con el kit First Strand cdna Synthesis Kit (Thermo Scientific) utilizando random primers (hexámeros). Se analizó la expresión de los genes 16S, RNAIII, agra, fnbpa por PCR en punto final.

4 4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT Figura 1. Representa: Carril 1: 8-11: agra VCP Marcador, Carril 2-5: 16S gen endógeno, Carril 6-8: agra cepa silvestre, Carril Figura 2: Representa Carril 1: Marcador, Carril 2-5: ARNIII, Carril 2-3: S. aureus silvestre 4-5 VCP, Carril 7-11: FnbpA, Carril 7-8: S. aureus silvestre 9-10 VCP

5 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016) Resultados Figura 1: 16s endógeno se expresa en los carriles 2-5 esto define que se está trabajando con bacterias, de acuerdo a los carriles 6-8 agra cepa silvestre se expresa, sin embargo en los carriles 9-11 agra VCP se muestra atenuado. Figura 2: Se aplicó ARNIII S. aureus silvestre en los carriles 2-3 en los cuales se expresa, y en los carriles 4-5 se aplicó ARNIII VCP en los cuales no expresa ARNIII, sin embargo, gen FnbpA se aplicó en los carriles 7-8 se expresa en S. aureus y VCP. Discusión y conclusiones Se concluyó que la clona 9 es VCP debido a que la expresión del gen agra se muestra atenuada, y la expresión de ARNIII es ausente. Agradecimientos Minerva Frutis Murillo Dr. Joel Edmundo Meza Mis padres Mi familia Ma. De la Luz Salinas Pérez Honorable Consejo Técnico del Programa Delfín Referencias Alva-Murillo, N., López-Meza, J. E., & Ochoa-Zarzosa, A. (2014). Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in staphylococcus aureus internalization. BioMed Research International, Atalla, H., Gyles, C., Jacob, C. L., Moisan, H., Malouin, F., & Mallard, B. (2008). Characterization of a Staphylococcus aureus small colony variant (SCV) associated with persistent bovine mastitis. Foodborne Pathogens and Disease, 5(6),