Instructivo de Laboratorio. Cocos Piógenos

Transcripción

1 Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Médicas Curso de Inmunología y Microbiología Tercer año, Fase II Instructivo de Laboratorio Cocos Piógenos Dra. Débora Esmeralda Aldana Introducción: El presente instructivo de laboratorio brinda los fundamentos teórico prácticos para el estudio de algunas de las bacterias denominadas cocos piógenos, tienen forma esférica o cocoide, son grampositivas y conforman un importante grupo de patógenos para el ser humano que se asocian a un amplio espectro de enfermedades. Tienen como característica, que estimulan en el hospedero una reacción inflamatoria intensa llevada a cabo principalmente por neutrófilos, que liberan accidentalmente o al morir enzimas que producen licuefacción de células vecinas y junto con las bacterias y sus productos metabólicos forman un residuo semilíquido viscoso llamado pus, de ahí el nombre de piógenos. Estos patógenos tienen una amplia distribución, siendo algunos de ellos, parte de la microbiota indígena. Por su importancia clínica y sus características epidemiológicas es indispensable conocer las características microbiológicas de estos microorganismos y las pruebas de laboratorio que permiten su identificación. Objetivos: Al finalizar la práctica el estudiante sea capaz de: 1. Reconocer las características morfológicas, estructurales y metabólicas de Streptococcus pyogenes y del Staphylococcus aureus

2 2. Describir y aplicar las técnicas de laboratorio más frecuentemente usadas para el diagnóstico microbiológico de enfermedades asociadas a estos Cocos piógenos. Material proporcionado por el Laboratorio: 1. Medios de cultivo: a) Agar sangre de carnero sembrado con Streptococcus pyogenes b) Agar sangre de carnero y Agar manitol sal sembrado con Staphylococcus aureus c) Caldo nutritivo con Streptococcus pyogenes d) Caldo nutritivo con Staphylococcus aureus 2. Preparaciones con la prueba de la coagulasa 3. Peróxido de hidrógeno al 30% 4. Reactivos para la técnica de coloración de Gram 5. Mechero Material proporcionado por el estudiante: - Bata - Asa bacteriológica (una por grupo) - Lupa - Portaobjetos - Encendedor o fósforos Actividades a realizar: A. Identificación de Estreptococos 1. Observe los medios de cultivo de agar sangre y describa las características morfológicas de las colonias. 2. Describa en el medio de cultivo la presencia o ausencia de hemólisis (alfa, beta, no hemólisis). Discuta con su profesor (a) las razones que explican los diferentes tipos de hemólisis y su importancia clínica. 3. Seleccione con un asa bacteriológica una colonia beta-hemolítica, una alfa-hemolítica y una no hemolítica, realice un frote, fíjelo a la llama y coloréelo con la Técnica de Gram, obsérvelo al microscopio con objetivo 100x e identifique y describa los hallazgos encontrados (forma, tamaño, tipo de coloración, tipo de agrupación) 4. Realice la prueba de la catalasa (ver anexo)

3 B. Identificación de Estafilococos 1. Observe los medios de cultivo de agar sangre y describa las características morfológicas de las colonias. 2. Describa el medio de cultivo manitol sal observando la fermentación de manitol (ver anexo) 3. Seleccione con un asa bacteriológica una colonia beta-hemolítica, una alfa-hemolítica y una no hemolítica, realice un frote, fíjelo a la llama y coloréelo con la Técnica de Gram, obsérvelo al microscopio con objetivo 100x e identifique y describa los hallazgos encontrados ( forma, tamaño, tipo de coloración, tipo de agrupación) 4. Observe la prueba de la coagulasa en tubo, discuta con su profesor (a) los hallazgos y la importancia de esta característica en las infecciones asociadas a estafilococos (ver anexo) 5. Efectúe la prueba de la catalasa Bibliografía: - Staphylococcus, Murray et al, Microbiología Médica, Séptima Edición capítulo 18 - Streptococcus, Murray et al, Microbiología Médica, Séptima Edición capítulo 19.

4 Anexo 1. Hemólisis: Los estreptococos producen dos hemolisinas, la estreptolisina S, que es estable en presencia de oxígeno, no inmunogénica y ligada a la célula que puede lisar hematíes, leucocitos y plaquetas. Esta se produce en presencia de suero y es la responsable de la ß- hemólisis. La estreptolisina O es lábil al Oxígeno, capaz de lisar hematíes, leucocitos, plaquetas y células cultivadas. La hemólisis puede ser inhibida ante un aumento de la tensión de CO 2, ya que puede producirse peroxidasa. Existen distintos tipos de hemólisis, la hemólisis alfa, es incompleta, aquí los glóbulos rojos que rodean las colonias son parcialmente dañados pero no lisados, se observa un enverdecimiento del medio debido a la salida de la célula oxidada de compuestos del tipo biliverdina, la lisis completa, sí ocurre en las reacciones beta hemolíticas, en las que hay un aclaramiento completo del medio. 2. Fermentación de Manitol: El agar manitol sal es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos. Al utilizar este medio se inhibe el crecimiento de bacterias que no pueden crecer en medios salinos y se aprovecha la capacidad de los estafilococos de crecer en presencia de cloruro de sodio al 7.5% y de manera específica, la capacidad del Staphylococcus aureus de fermentar manitol. Las colonias se forman en el medio formando un halo amarillo en el agar circundante que indica la producción de ácido a partir del manitol. 3. Prueba de la Catalasa: El peróxido de hidrógeno se acumula durante el metabolismo celular o durante la fagocitosis, para protegernos de las bacterias. Todos los estafilococos producen una enzima llamada catalasa, que cataliza la conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Procedimiento: 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de H 2 O 2 al 30% 2. Con un palillo estéril transferir una pequeña cantidad del cultivo puro sobre la gota de agua oxigenada 3. Observar el aparecimiento de burbujas

5 4. Prueba de la Coagulasa: Las cepas de S. aureus producen una enzima que tiene una actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina insoluble, provocando la formación de un cóagulo visible. Estas bacterias poseen dos formas de coagulasa: la ligada y la libre. Se cree que la coagulasa ligada in vivo se une a la pared del estafilococo forzando la agregación de los estafilococos, formando así una barrera en el sitio de la infección. La coagulasa libre logra el mismo resultado al reaccionar con un factor del plasma (una globulina) para originar la estafilotrombina, un factor semejante a la trombina que cataliza la conversión del fibrinógeno en fibrina insoluble. Se utilizan en el laboratorio clínico dos formas de la prueba: a. Coagulasa en lámina b. Coagulasa en tubo Procedimiento de Coagulasa en lámina: 1. Colocar una gota de plasma sobre un portaobjetos limpio y seco 2. Colocar una gota de agua destilada o solución salina cerca de la gota de plasma (se usará como control) 3. Transferir con un palillo una cantidad de colonia a cada gota, inoculando primero la gota control. Debe observarse turbio y homogéneo 4. Observar las preparaciones para evaluar la aparición de pequeños coágulos Procedimiento de la Coagulasa en Tubo (procedimiento realizado previamente en el laboratorio): 1. En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de una dilución 1:4 del plasma humano 2. Agregar una buena cantidad de colonia al tubo 3. Leer en 1, 2 y 4 horas, incubando a 35ºC