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Transcripción

1 1 Bacteriología Veterinaria. TRABAJO PRÁCTICO No. 2 CULTIVO DE BACTERIAS OBJETIVOS 1. Manejar con destreza las diferentes técnicas empleadas para la siembra y aislamiento de bacterias. 2. Obtener cultivos bacterianos puros. 3. Realizar estudio de colonias. 4. Conocer y usar adecuadamente los diferentes medios bacteriológicos estudiados. 5. Disponer de los criterios necesarios para la selección de un medio de cultivo. Primer Periodo GENERALIDADES Uno de los requisitos principales para el adecuado estudio de las bacterias es cultivarlas en condiciones de laboratorio, para lo cual se necesita conocer los requerimientos nutricionales y las condiciones físicas en las cuales se logra el crecimiento bacteriano. Las bacterias presentan diferencias notables en cuanto a sus necesidades nutricionales, algunas bacterias tienen necesidades sencillas pudiendo utilizar el CO 2 como fuente de carbono, estas bacterias se denominan AUTOTROFAS; existen otros grupos bacterianos denominados HETERÓTROFAS que requirieren de compuestos orgánicos complejos para su desarrollo. Existen además diferencias muy importantes en cuanto a otros requerimientos nutricionales como la fuente de Nitrógeno, aminoácidos específicos, vitaminas, etc. lo que determina la composición de los medios de cultivo a utilizar. En este trabajo práctico, nos referimos al cultivo de las bacterias heterótrofas, pues en éste grupo se incluyen las bacterias relacionadas con el hombre y los animales, objeto de nuestro curso. 1. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo bacterianos son múltiples y variados. Se pueden clasificar de acuerdo al estado físico en líquidos y sólidos, y según su procedencia en naturales y artificiales. Sin embargo, la clasificación más importante es según su finalidad bacteriológica, de acuerdo a la cual se clasifican en medios: a) Comunes c) Selectivos e) De prueba b) Enriquecidos d) Diferenciales

2 2 a) Medios Comunes Son los medios bacteriológicos más sencillos, que presentan los nutrientes mínimos necesarios para el desarrollo de las bacterias menos exigentes. Ej. Caldo nutritivo y Agar nutritivo. El caldo nutritivo contiene: extracto de carne, peptona, cloruro de sodio y agua destilada. El agar nutritivo presenta la misma composición del caldo nutritivo solo que se le adiciona agar a una concentración de 1,5%, como agente solidificante para lograr un medio sólido. Estos medios relativamente simples hacen posible el desarrollo de muchas bacterias heterótrofas comunes. A estos medios básicos, se les puede adicionar extracto de levadura, mejorando su calidad nutritiva debido a que el extracto de levadura contiene varias de las vitaminas del complejo B. b) Medios Enriquecidos Se obtiene mediante la adición de componentes como sangre, suero o extracto de tejido de animales y/o plantas al caldo nutritivo o al agar nutritivo, proporcionando sustancias nutritivas complementarias. Ej. Agar sangre, caldo tripticasa soya, medio infusión cerebro corazón (BHI). Estos medios se usan para el crecimiento de bacterias heterótrofas exigentes, que tienen requerimientos nutricionales muy complejos y requieren de vitaminas y sustancias promotoras del crecimiento. c) Medios Selectivos Estos medios se obtienen adicionando al medio nutritivo ciertas sustancias químicas que inhiben el desarrollo de un grupo de bacterias y permiten el crecimiento de otros grupos bacterianos diferentes. Existen muchos medios selectivos, tomando en consideración la toxicidad selectiva de las diversas sustancias químicas que se pueden utilizar. Ej. Agar Mac Conkey, el cual contiene sales biliares, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas sin afectar el crecimiento de bacterias Gram negativas, como las enterobacterias. De modo que el agar MacConkey es un medio selectivo para enterobacterias. Estos medios se usan para aislar grupos bacterianos a partir de poblaciones mixtas de diversos géneros y especies. d) Medios Diferenciales Estos medios tienen adicionados ciertos sustratos especiales, reactivos o sustancias químicas que determinan cambios en el medio como consecuencia del crecimiento bacteriano, lo que permite establecer diferencias entre distintos tipos de bacterias. Ej. Agar urea de Christensen, este medio permite diferenciar bacterias en base a la utilización de la urea, lo cual se evidencia por un cambio de color del medio. Agar sangre, el cual permite diferenciar bacterias en base a la hemólisis o lisis de glóbulos rojos. El agar sangre es a la vez un medio de enriquecimiento y diferencial. El agar

3 3 Mac Conkey se clasifica como un medio selectivo y diferencial, ya que solo permite el crecimiento de bacterias Gram negativas y dentro de este grupo bacteriano permite diferenciar entre bacterias fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. e) Medios de Prueba Estos son medios específicos utilizados para ensayos cuya finalidad es determinar el uso o requerimiento de vitaminas y aminoácidos por algunas bacterias; así como también para determinar la acción que tienen los antibióticos sobre éstas. Son medios de composición conocida. 2. MÉTODOS DE SIEMBRAS La siembra, trasplante o repique de cultivos bacterianos, tiene por objeto renovar el cultivo microbiano, conservar su viabilidad o conocer algunas de las propiedades biológicas, químicas o de cultivo de las bacterias en estudio. Para la siembra de cultivos bacterianos se deben seguir las técnicas apropiada de acuerdo al tipo de medio de cultivo a ser utilizado SIEMBRAS EN MEDIOS LÍQUIDOS Una de las formas más comunes en las que se cultivan bacterias es a través de la inoculación de medios líquidos o caldos de cultivo. Estos medios son dispensados en tubos con tapa y generalmente el caldo presenta un aspecto cristalino. Una vez inoculado el medio y transcurrido el periodo de incubación, el crecimiento bacteriano en el caldo de cultivo se evidencia por enturbiamiento de éste. MATERIAL a) Cultivo de Escherichia coli (E. coli) o Staphylococcus aureus (S. aureus) en caldo nutritivo. b) 1 tubo con caldo nutritivo. c) Asa de inocular. 1. Rotular el tubo adecuadamente con el nombre de la cepa a utilizar. 2. Esterilizar el asa. 3. Con una mano tomar el tubo que contiene el cultivo bacteriano en caldo nutritivo. Con la otra mano, retirar la tapa haciendo uso del dedo meñique y la palma de la mano, de manera que los dedos restantes queden libres para manipular el asa. Al destapar el tubo pasar la boca de éste 2 o 3 veces por la llama del mechero (flamear la boca del tubo). 4. Una vez que enfríe el asa retirar con ella una pequeña muestra del cultivo de bacteriano. 5. Flamear de nuevo la boca del tubo, taparlo y colocarlo en su lugar.

4 4 6. Tomar un tubo de caldo nutritivo estéril retirar la tapa, de la manera descrita en el punto 2, y efectuar la siembra introduciendo el asa y moviendo suavemente dentro del líquido (inocular). 7. Flamear la boca del tubo y taparlo. 8. Esterilizar el asa y colocarla en su lugar. 9. Incubar a 37ºC por horas. 9. Transcurrido el período de incubación observar el desarrollo del crecimiento en caldo inoculado, el cual se evidencia por la turbidez o presencia de una película en la superficie o de sedimento en el fondo del tubo SIEMBRA EN AGAR INCLINADO Generalmente los medios sólidos envasados en tubo se dispensan colocando los tubos en una posición inclinada, de manera que, el agar solidifica adquiriendo una superficie en forma de bisel sobre la cual se efectúa la siembra. MATERIAL a) Cultivo de E. coli o S. aureus en caldo nutritivo. b) 1 tubo con agar nutritivo inclinado. c) Asa de inocular. 1. Repetir los pasos 1 al 4 del punto 2.1, usando el cultivo bacteriano en caldo nutritivo. 2. Transferir una pequeña cantidad del cultivo al tubo de agar inclinado. La siembre se realiza comenzando desde el fondo del tubo hacia el extremo mas delgado del medio, deslizando suavemente el asa en forma de zig-zag (estría) sobre la superficie del agar sin romperlo. 3. Flamear la boca del tubo y colocar nuevamente la tapa. 4. Esterilizar el asa y colocarla en su lugar. 5. Incubar a 37ºC por horas. 6. Transcurrido el período de incubación observar el desarrollo bacteriano sobre la superficie inclinada del medio SIEMBRA POR PUNCIÓN Y ESTRÍA La siembra por punción y estría se realiza en medios dispensados en tubo, haciendo una combinación entre agar taco y agar inclinado; asimismo, la manera en la que se siembran estos medios es una combinación entre la forma de siembra por punción profunda y la siembra en agar inclinado. Este tipo de siembra se efectúa solo en medios de cultivos especiales formados por un medio en taco, en el fondo del tubo y otro medio de cultivo que se dispensa sobre el taco, quedando una superficie en

5 5 forma de bisel. Este tipo de medio se emplea en el estudio simultáneo de varias propiedades bioquímicas de las bacterias. Ej. TSI (triple azúcar-hierro) MATERIAL a) Cultivo de E. coli o S. aureus en caldo nutritivo. b) 1 tubo con medio agar taco/inclinado c) Aguja de inocular. 1. Rotular los tubos adecuadamente con el nombre de la cepa a utilizar. 2. Tomar con la aguja de inocular una muestra de cultivo bacteriano crecido en caldo nutritivo. 3. Realizar una punción en el centro del taco y una vez retirada la aguja del sitio de punción, trazar una estría en forma de zig-zag sobre la superficie del agar sin romperlo. 4. Flamear la boca del tubo y colocar de nuevo la tapa. 5. Esterilizar la aguja de inocular y colocarla en su lugar. 6. Incubar a 37ºC por horas. 7. Transcurrido el período de incubación observar el crecimiento bacteriano tanto en la línea de punción como en la superficie inclinada del medio. 3. TRASPLANTE DE COLONIA El transplante de colonia tiene como finalidad la obtención de un cultivo puro, es decir la obtención del crecimiento de una sola especie bacteriana. El cultivo puro se obtiene al transportar una pequeña porción de una colonia aislada, a un caldo de cultivo fresco. Una colonia bacteriana no es más que una masa visible de células bacterias conglomeradas en un mismo punto, estas células bacterianas que forman la colonia se han generado a partir de una sola célula bacteriana, que se ha multiplicado y ha dado origen a dos nuevas células, que a su vez se han dividido y dado origen a cuatro nuevas células y en y así sucesivamente, hasta formar una masa visible de células bacterianas. MATERIAL a) Colonias bacterianas aisladas en placas de agar nutritivo, crecidas durante 24 horas. b) Aguja o asa de inocular. c) 1 tubo con caldo nutritivo. 1. Rotular los tubos adecuadamente 2. Seleccionar una colonia en la placa de agar nutritivo.

6 6 3. Colocar la placa invertida (con el fondo hacia arriba) a un lado del mechero encendido. 4. Flamear la aguja y dejar enfriar por unos segundos. 5. Levantar el fondo de la placa, llevarla a la zona estéril de la llama del mechero, manteniéndola con la superficie del cultivo hacia arriba. 6. Tocar con la aguja el centro de la colonia seleccionada, sin correr la aguja a ningún lado, ni tocar las colonias adyacentes; transferir el material adherido a la punta de la aguja al tubo con caldo nutritivo, agitar suavemente la aguja dentro del caldo. 7. Incubar por horas a 37ºC. 8. Transcurrido el período de incubación observar los tubos de caldo y comprobar si se logró el trasplante de la colonia. 4. AISLAMIENTO DE BACTERIAS AERÓBICAS Se denomina aislamiento de una bacteria a la obtención de su cultivo puro, es decir, separarla de otras bacterias que se encuentran en el mismo material. Prácticamente todas las muestras obtenidas a partir de ambientes naturales contienen una población mixta de microorganismos. Las técnicas para el aislamiento bacteriano, deben ser realizadas bajo estrictas condiciones de asepsia, a fin de evitar la contaminación del cultivo con otros microorganismos y al mismo tiempo proteger al operador de posibles infecciones accidentales CULTIVO PURO La mayoría de las muestras clínicas contienen más de una especie bacteriana. Usualmente solo una de ellas es el organismo patógeno responsable de la enfermedad, el resto son bacterias comensales que forman parte de la flora bacteriana normal del tejido o cavidad a partir del cual se tomó la muestra. Por lo tanto, para el estudio exacto de cualquier especie bacteriana con fines taxonómicos o de identificación, es indispensable disponer de su cultivo puro, ya que los otros gérmenes presentes en la muestra podrían introducir errores en los ensayos bioquímicos o pruebas de patogenicidad practicadas en el curso de la identificación. La expresión cultivo puro indica que todas las células presentes en el cultivo tuvieron un origen común, es decir, que son descendientes de una sola célula bacteriana (una especie bacteriana).

7 MÉTODOS DE AISLAMIENTO BACTERIANO Los métodos de aislamiento bacteriano se clasifican en: A. GENERALES A.1. Aislamiento por diseminación B. ESPECIALES B.1. Aislamiento por métodos disgenésicos B.2. Aislamiento por inoculación A. MÉTODOS GENERALES DE ASILAMIENTO Los métodos generales consisten en sembrar el material de manera adecuada, en un medio apropiado, de tal forma que se obtengan colonias aisladas. Esto se basa en el hecho de que la población microbiana de una colonia se desarrolla a partir de una sola célula y por lo tanto al trasplantar a un medio apropiado una colonia bacteriana, se obtendrá su cultivo puro. A.1. Aislamiento por diseminación o estriado en placa. Este método se basa en diseminar o extender una asada del material con los microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo sólido, contenido en una placa de Petri. El estriado en placa consiste en realizar una serie de trazados (o estrías) sobre la superficie del agar, con el asa que contiene la muestra; esto se hace con el fin de diseminar la muestra sobre el agar para obtener una buena separación de las células bacterianas. Cada célula bacteriana originará una colonia conteniendo un solo tipo de bacterias idénticas a la que le dio origen. MATERIAL a) Cultivo bacteriano en caldo nutritivo. b) 1 placa con agar dextrosa (A. Dex.). c) Asa de inocular. 1. Colocar una placa con agar dextrosa en posición invertida (el fondo que contiene el agar hacia arriba) cerca de mechero encendido. 2. Con el asa de inocular tomar una muestra del cultivo bacteriano en caldo. 3. Levantar el fondo de la placa (donde se encuentra el agar) y cerca del mechero diseminar el inóculo trazando estrías separadas sobre una pequeña área de la superficie del agar.

8 8 4. Esterilizar el asa, dejarla enfriar y diseminar algunas las bacterias que han sido depositadas inicialmente sobre la superficie del agar, tocando con el asa un extremo del conjunto inicial de estrías y haciendo un segundo trazado de estrías en la superficie adyacente. Realizar al menos 3 o 4 grupos de estrías sobre la superficie del agar, esterilizando el asa después de cada estriado. Los trazados de las estrías en la superficie de la placa no deben cruzarse, Figura Inocular el área central de la placa a partir del último estriado, realizando estrías separadas y cuidando de no tocar con el asa los otros segmentos estriados, los cuales fueron más densamente inoculados. 6. Esterilizar el asa y tapar de la placa. 8. Incubar la placa a 37ºC por horas. Las placas sembradas deben colocarse siempre en posición invertida (el fondo que contiene el agar hacia arriba) durante su incubación. 9. En el segundo periodo de la práctica examinar los diferentes tipos de colonias aisladas y estudiar sus características, siguiendo las indicaciones del punto 5. A Figura 1. MÉTODO DE AISLAMIENTO DE COLONIAS POR ESTRIADO EN PLACA 1er. estriado 2do. estriado 3er. estriado 4to estriado 5to. estriado

9 9 B. MÉTODOS ESPECIALES DE AISLAMIENTO Los métodos especiales se basan en el tratamiento de la muestra bajo ciertas condiciones, que solamente permitan el desarrollo de la bacteria que se desea aislar y no de los otros microorganismos presentes en dicha muestra. Estos métodos se utilizan cuando la bacteria cuyo aislamiento se pretende, se encuentra en muy poca cantidad y/o existe abundante flora de contaminación. B.1. Aislamiento por Métodos Disgenésicos: B.1.1. Calentamiento del Material La esporulación es un mecanismo de resistencia que algunas bacterias desarrollan ante condiciones ambientales adversas como, altas temperaturas, baja cantidad de nutrientes, etc. Durante el proceso de esporulación, la forma vegetativa de la bacteria se transforma en una espora resistente. Cuando la bacteria que se desea aislar de una muestra tiene la propiedad de esporular, se aprovecha la resistencia que poseen las esporas al calor. El procedimiento consiste en calentar el material a 80ºC durante 15 minutos o a 100ºC durante 5 minutos, seguido de la inoculación en un medio de cultivo adecuado. Las bacterias que no forman esporas serán destruidas por efecto del calor, mientras que las esporuladas resisten el tratamiento y una vez inoculadas en un medio de cultivo adecuado se obtendrá su crecimiento. B.1.2. Tratamiento del material con sustancias bactericidas selectivas Este método de aislamiento se basa en que algunas bacterias son resistentes a la acción de ciertas sustancias químicas con acción bactericida, las cuales son eficaces en la destrucción de los microorganismos susceptibles. Uno de los mejores ejemplos es el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis (bacilo de la tuberculosis) por tratamiento del material con soluciones concentradas de ácido o álcali, durante 15 minutos. Esta bacteria es más resistente que otras bacterias que se pueden encontrar en la muestra patológica. Seguidamente al tratamiento, se inocula en el medio de cultivo apropiado para el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. B.1.3. Uso de Medios Selectivos Para el aislamiento de algunos microorganismos, es común añadir al medio de cultivo sustancias que ejerzan un efecto inhibidor sobre cierto grupo de microorganismos pero que no afectan a los microorganismos que se desean aislar, estos medios son llamados medios selectivos. Un medio selectivo, como su nombre lo indica permite seleccionar un grupo bacteriano (el de interés) que se

10 10 encuentra formando parte de una población bacteriana mixta. Permite el desarrollo de las bacterias interés de estudio e inhibe las no deseadas. Estos medios son una de las vías a través de las cuales se logra la obtención de cultivo puro. Ciertos colorantes derivados de la anilina, las sales biliares y otras sustancias, se usan para inhibir el crecimiento de varios microorganismos. Por ejemplo, en el medio de Wilson & Blair (agar sulfito de Bismuto) Salmonella typhi crece exuberantemente, mientras que E. coli no se desarrolla en este medio. Esto permite aislar bacterias que se encuentran dentro de una población mixta de especies bacterianas. MATERIAL a) Cultivo bacteriano en caldo nutritivo. b) Agar nutritivo en placa c) Agar Mac Conkey (MCK) d) Agar Manitol Salado (MS) e) Asa de inocular 1. Siembre por diseminación en estrías el cultivo bacteriano mixto en cada uno de los medios de cultivo, efectuando cuidadosamente la técnica de estriado en placa, de manera de obtener colonias aisladas. 2. Incubar a 37ºC por horas. 3. En el segundo periodo de la práctica, observar el resultado obtenido. En el medio de agar nutritivo (no selectivo) aparecerán colonias de dos tipos diferentes. En un portaobjeto efectúe un frotis de cada tipo de colonia, coloree con Gram y observe al microscopio las características morfológicas y tintoriales de las bacterias correspondientes a la colonia observada. Haga sus dibujos. 4. Observe en el agar Mac Conkey y en agar manitol salado el desarrollo de colonias de un solo tipo. Haga un frotis de una colonia de cada medio, coloree con Gram y observe al microscopio. 5. Interprete los resultados obtenidos. Correlacione el tipo de bacteria (por su morfología, agrupación, reacción al Gram) crecida en los medios de agar MacConkey y agar manitol salado con los desarrollados en el agar nutritivo. 6. Los medios de agar Mac Conkey y agar manitol son medios selectivos. Tome nota de la utilidad de cada uno de estos medios, que tipo de bacteria es seleccionada (crecimiento positivo) y cual es inhibida. 7. Haga dibujo de los resultados.

11 11 B.1.4. Aislamiento por Inoculación Este método se fundamenta en el poder patógeno, para separar un microorganismo de otro. El aislamiento de una bacteria patógena puede obtenerse en muchos casos inoculando la suspensión bacteriana mixta en la que se encuentra el patógeno o inoculando el producto patológico a investigar, en animales de experimentación susceptibles a ser infectados con la bacteria que se desea aislar. Las bacterias contaminantes no se multiplicarán en los tejidos del animal, en cambio la bacteria patógena a la cual es susceptible el animal experimental, lo hará sin competencia, pudiendo ser aislada en cultivo puro a partir de los tejidos del animal. Este método de aislamiento se emplea para aislar microorganismos patógenos que no se desarrollan fácilmente en cultivos de laboratorio o que son fácilmente superados en población por los microorganismos contaminantes. Segundo Periodo 5. ESTUDIO DE COLONIAS Cuando una especie bacteriana se desarrolla en un medio de cultivo sólido, forman masa de células bacterianas visible a simple vista denominado colonia, con características particulares. En el estudio de las colonias, se deben diferenciar varios aspectos que son de interés en la clasificación de las bacterias y que se refieren a las características macroscópicas y microscópicas. Realizar el estudio de las colonias en la placa de agar dextrosa. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS: 1. Tamaño (diámetro en milímetros). 2. Forma: Puntiforme, circular, irregular, ameboidea, filamentosa. 3. Elevación: Plana, convexa, umbilicada, cónica. 4. Superficie topográfica: Lisa, rugosa, mucoide. 5. Consistencia: Dura, blanda, mucosa. 6. Color: Transparente o pigmentada. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS: Observadas al microscopio con lente de menor aumento o lupa. 1. Borde: Entero, lobulado, ondulado, dentado. 2. Estructura Interna: Homogénea, granular, muroloide, rizada.

12 12 1. Seleccionar una colonia de la placa. 2. Describir las características microscópicas y microscópicas de la colonia seleccionada. En la Figura 2 se esquematizan algunos ejemplos de las características a observar. 3. Anotar los resultados. Figura 2. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS FORMA Puntiforme (Menos de 1mm Ø) Circular (Más de 1mm Ø) Irregular Ameboide Filamentosa ELEVACIÓN Plana Elevada Convexa Cónica Umbilicada SUPERFICIE TOPOGRÁFICA Lisa Rugosa Mucoide